PL161476B1 - Srodek owadobójczy i roztoczobójczy PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Srodek owadobójczy i roztoczobójczy PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL161476B1
PL161476B1 PL1989282843A PL28284389A PL161476B1 PL 161476 B1 PL161476 B1 PL 161476B1 PL 1989282843 A PL1989282843 A PL 1989282843A PL 28284389 A PL28284389 A PL 28284389A PL 161476 B1 PL161476 B1 PL 161476B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
methyl
formula
medium
compounds
compound
Prior art date
Application number
PL1989282843A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of PL161476B1 publication Critical patent/PL161476B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Abstract

1. Srodek owadobójczy i roztoczobójczy, zawierajacy obok skladnika czynnego jeden lub kilka fitologicznie dopuszczalnych nosni- ków i/lub rozcienczalników, znamienny tym, ze jako skladnik czynny zawiera 0,0005 do 90% wagowo nowego zwiazku A 83943 o wzorze 1. w którym R2 oznacza grupe o wzorze 3, R4 oznacza grupe etylowa, R5 i R6 kazdy oznacza grupe metylowa, a podstawniki R, R1 i R3 wystepuja w nastepujacej kombinacji R R 1 R3 wzór 2a Metyl H wzór 2b Metyl H wzór 2c Metyl H wzór 2a Metyl Metyl wzór 2a H H H Metyl H H Metyl Metyl lub ich fizjologiczne dopuszczalnych soli. W ?or 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek owadobójczy i roztoczobójczy, zawierający jako substancję czynną związki z nowej grupy związków makrolidowych o działaniu owadobójczym i roztoczobójczy m.
Istnieje duże zapotrzebowanie na nowe związki o działaniu owado- i roztoczobójczym, ponieważ owady i roztocza stają się szybko odporne na stosowane do ich zwalczania preparaty. Odporność na preparaty owadobójcze wśród stawonogów występuje u przynajmniej 400 gatunków niewrażliwych na jeden lub więcej preparatów, takich jak DDT, karbaminiany i fosforany organiczne. Odporność występuje lówniez w stosunku do niektórych nowszych piretroidów, i stąd dążenie do otrzymywania nowych związków o działaniu owado- i roztoczobójczym.
Zwalczanie pasożytów zewnętrznych, takich jak różne gatunki much i kleszczy stanowi od dawna ważne zagadnienie w hodowli zwierząt. Tradycyjnie stosuje się insektycydy zewnętrznie, jak znane powszechnie natryski (dips) dla owiec. Taki sposób postępowania jest ciągle szeroko stosowany.
Wynalazek niniejszy odnosi się do środka, którego substancja czynna wytwarzana jest w procesie fermentacji, której produkt oznaczono jako A 83543, w skład którego wchodzą: A 83543 A, A 83543 B, A 83543 C, A 83543 D, A 83543 E, A 83543 F, A 83543 G, A 83543 H, A 83543 J.
161 476
Produkt A 83543 i jego poszczególne składniki zwalczają owady, zwłaszcza z gatunków Lepidoptera i Diptera (łuskoskrzydłe i dwuskrzydłe) i może być stosowany w różnych kompozycjach i formach jako preparat owado- i roztoczobójczy.
Związki A 83543 przedstawione są wzorem ogólnym 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupy o wzorze 2aX 2bX 2c) 2d\ a r2 oznacza grupę o wzorze 3 w którym r1 , R^ r5 i R® oznaczają atom wodoru lub metyL a r4 oznacza metyl lub etyk lub sok addycyjne z kwasami tych związków, gdy R ma inne znaczenie niż atom wodoru.
Środek według wynalazku zawiera zwózki o wzorze 1 w których R R\ r3, r\ r5 i R® występują w jednej z następujących kombinacji przedstawionych w poniższej tabeli:
Tabela 1.
R Ri R3 R4 R® R®
Wzór 2a Me H Et Me Me
Wzór 2b Me H Et Me Me
Wzór 2c Me H Et Me Me
Wzór 2a Me Me Et Me Me
Wzór 2a Me H Me Me Me
Wzór 2a H H Et Me Me
Wzór 2d Me H Et Me Me
Wzór 2a Me H Et H Me
Wzór 2a Me H Et Me H
H Me H Et Me Me
H Me Me Et Me Me
H Me H Me Me Me
H H H Et Me Me
H Me H Et H Me
H Me H Et Me H
lub sole addycyjne tych związków z kwasami, gdy R ma inne znaczenie niż atom wodoru. W związku oznaczonym A 83543 A; aminocukrem jest beta-D-forozoamina, a naturalnym cukrem alfa-2,3,4-tri-O-metylo-ramoza, w ilości 0,005-90% wagowo.
Scharakteryzowano i opisano dziewięć składników A 83543. Związki te przedstawione są wzorem 1, w którym R ma inne znaczenie niż atom wodoru. Mają one następującą budowę:
Tabela 2
Składnik R R1 R3 R4 R® R®
A Wzór 2a Me H Et Me Me
B Wzór 2b Me H Et Me Me
C Wzór 2c Me H Et Me Me
D Wzór 2a Me Me Et Me Me
E Wzór 2a Me H Me Me Me
F Wzór 2a H H Et Me Me
G Wzór 2d Me H Et Me Me
H Wzór 2a Me H Et H Me
J Wzór 2a Me H Et Me H
Aminocukier można oddzielić od związków wchodzących w skład A 83543. Powstaną wówczas pseudoaglikony (związki o wzorze 1, gdzie R = H).
Komponenty A, B, C i G mają wspólny pseudoaglikon (pseudoaglikon A 83543 lub pseudo A). Pseudoaglikon A 83543 A jak się okazało, powstaje w procesie fermentacji jako jeden z komponentów A 83543. Komponenty D, E, F, H i J mają pseudoaglikony różne. Pseudoaglikony te mają budowę przedstawioną w tabeli 3.
Tabela 3
Pseudoaglikon R = H R1 R3 R4 R® R®
A 83543 A Me H Et Me Me
A 83543 D Me Me Et Me Me
A 83543 E Me H Me Me Me
A 83543 F H H Et Me Me
A 83543 H Me H Et H Me
A 83543 J Me H Et Me H
161 476
Pseudoaglikony stosuje się jako produkty pośrednie, na przykład do składników A 83543.
Poniżej podano fizyczne i spektralne właściwości składników A 83543 i pseudoaglikonów. Przy omawianiu danych stosuje się następujące skróty:
EI-MS: electron-impact mass spectrometry - spektrometria mas z jonizacją strumieniem elektronów;
FAB-MS: Fast -atom-bombardment mass spectrometry - spektrometria mas z jonizacją szybkimi atomami;
FD-MS: Field desorption mass spectrometry - spektrometria mas z desorpcją polem;
HPLC: wysokosprawna chromatografia' cieczowa;
IR: podczerwień;
NMR: jądrowy magnetyczny rezonans;
UV: nadfiolet.
Charakterystyki związku oznaczonego A 83543 A. Ciężar cząsteczkowy: 731. Wzór sumaryczny: C14H65NOi0. FD-MS: patrz rysunek fig. 4. FAB-MS (M+ 1): stwierdzono: 732,4706; wyliczono C^HeeNOio = 732,4687 (patrz rysunek fig.8). EI-MS: stwierdzono: 731,4612, wyliczono 731,4608 (patrz rysunek fig. 10). UV (EtOH) lambda max. 243 nm (E 8,920). IR (CHC13): v (lakton) 1713, (keton skoniugowany) 1657, liczne piki dla drgań C-H około 2940 i dla drgań C-0 około 1060 cm1 (patrz rysunek fig. 1). (σ)ο3β5: + 6,8° (c 1.03, CHC1a), (σ)ο529: -121,8° (c 1,03. CHC1s).
W tabeli 4 podano wartości 1H i 13C NMR dla A 83543 A (w acetonie de).
Tabela 4.
Pozycja ’3c ’H’ Pozycja 13c ’H°
l 172,02 _ 21 76,24* 4,66
2 33,83 3,07/2,45 22 28,51 1,48
3 48,13 2,94 23 8,97 0,81
4 41,65 3,48 24 15,71 1.12
5 129,12 5,86 1' 96,34 4,81
6 129,66 5,89 2' 77,61 3,51
7 41,46 2,15 3' 81,87 3,37
8 36,50 1,^^,/^1,34 4' 82,43 3,00
9 76,31* 4,31 5' 68,03 3,48
10 37,65 2,36/1,36 6' 17,64 1,18
11 36,42 0,93 2'-OCHa 56,66” 3,37
12 49,74 2,87 3'-OCHs 58,39” 3,41
13 147,78 7,01 4'-OCHa 60,12” 3,45
14 144,27 — 1' 103,45 4,45
15 202,46 — 2 31,24 1,92./1,37
16 47,74 3,30 3 18,14 1,84/52
17 80,41 3,53 4 65,34 2,12
18 30,33 1.51 5 73,35 3,56
19 21,85 1,78/1,17 6 18,87 1,21
20 34,45 1,50 n(ch3j 40,38 2,22
Niektóre pomiary wzięte ze stosunku 1H/13C *, ” Rezonansy z tym samym indeksem górnym mogą być ttrymmniiirw
Charakterystyki związku oznaczonego A 83543 B. Ciężar cząsteczkowy: 717. Wzór sumaryczny. C40H63NO10. FAB-MS (patrz rysunek fig. 9). Charakterystyki A 83543 C. Ciężar cząsteczkowy 703, Wzór sumaryczny: CaaHeiNOio. FD-MS: (patrz rysunek fig. 5). Charakterystyka A 83543 D. Ciężar cząsteczkowy: 745. Wzór sumaryczny: C22H67NO10. UV (EtOH) lambda maks. 244 nm (E 9,910). iR (CHCI3): v (lakton) 1708; (skoniugowany keton) 1658; liczne piki dla drgań C-H około 2940 i dla drgań C-O około 1070cm”1 (patrz rysunek fig. 2). (σ)ϋ389: -142,9° (c 1.02, CHCI3), (ff)D365: -29,9° (c 1.02, CHCb). FD-MS- patrz rysunek fig. 6.
W tabeli 5 podano wartości 1H i 13C NMR dla A 83543 D (w acetonie de).
161 476
Tabela 5.
Pozycja ”C Ή Pozycja ,3C ’H“
1 172,68 — 21 74,84 4,65
2 34,38 3,08/2,43 22 29,16 1,48
3 49,01 2,90 23 9,55 0,81
4 42,83 3,47 24 16,32 1.12
5 123,27 5,54 Γ 97,11 4,85
6 137,26 — 2' 78,33 3,54
6-CH3 20,81 1.74 3' 82,58 3,40
7 4,41 2,18 4' 83,15 3,03
8 35,61 2,01/1,45 5' 68,71 3,50
9 76,72 4,32 6' 18,26 1,18
10 38,64 2,37/1,37 2'-OCHs 57,31' 3,40
11 47,04 1,02 3'-OCH3 59,02” 3,43
12 50,05 2,78 4'-OCH3 60,71” 3,47
13 148,47 7,04 1 104,14 4,47
14 145,19 — 2 31,96 1,94/1,319
15 203,16 — 3 18,83 1,81/1,49
16 48,47 3,30 4 66,06 2,12
17 81,03 3,53 5 74,12 3,55
18 30,99 1,49 6 19,42 1,20
19 22,51 1,78/1,19 N(CH3J 40,99 2,21
20 35,12 1,49
“'Niektóre oznaczenia wzięto w zależności łH/13C “ Rezonanse mogą się wymieniać
Charakterystyki związku oznaczonego A 83543 E. Ciężar cząsteczkowy: 717. Wzór sumaryczny: CąoHesNOio. FAB-MS (M + 1): stwierdzono: 718,4526; wyliczono CąoHeąNOw = 718,4530. UV (EtOH) λ maks. 244 nm (E 8,600). IR (KBr): (patrz rysunek fig. 13).
W tabeli 6 podano dane NMR 1H i 13C dla A 83543 E (w acetonie de).
Tabela 6
Pozycja ”C 1H“ Pozycja ’3C
1 172,46 — 21 72,97 4,68
2 34,95 3,06/2,40 22 21,61 1.12
3 48,88 2,95 23 — —
4 42,11 3,43 24 16,52 1,13
5 129,78 5,86 1' 97,11 4,83
6 130,39 5,90 2' 78,36 3,55
7 42,11 2,14 3' 82,55 3,37
8 37,18 1,96/1,39 4' 83,13 3,02
9 77,06 4.33 5' 68,72 3,50
10 38,31 2,36/1,36 6' 18,26 1,18
11 47,18 0,93 2'-OCH3 59,01 3,43
12 50,40 2,86 3'OCH3 57,30 3,40
13 148,37 7,06 4^-OCH3 60,69 3,46
14 144,84 — 1 104,24 4,47
15 203,09 — 2 32,00 1,93/1,39
16 48,05 3,34 3 18,86 1,82/1,50
17 81,35 3,55 4 66,06 2,12
18 34,98 1,62/1,48 5 74,13 3,57
19 22,25 1,77/1,13 6 19,42 1,21
20 33,73 1,50 N(CH3J 40,99 2,21
“'Niektóre dane wzięte ze stosunku 1h/13C
Charakterystyki związku oznaczonego A 83543 F. Ciężar cząsteczkowy: 717. Wzór sumaryczny: C40H63NO10. FAB-MS (M + 1)stwierdzono: 718,4534; wyliczono CąoHeąNOw = 718,4530. UV (EtOH) λ max. 243 nm (E 10.500) i 282 nm (E 109). IR (KBr): (patrz rysunek fig. 14).
W tabeli 7 przedstawiono dane NMR 1H i 13C dla A 83543 F (w acetonie de).
161 476
Tabela 7
Pozycja 13C 1H“ Pozycja 13c 'H“
1 172,60 — 21 77,09 4,32
2 34,50 3,06/2,42 22 29,05 1,48
3 48,82 2,95 23 9,56 0,81
4 42,46 3,45 1' 97,19 4,83
5 129,56 5,87 2' 78,38 3,53
6 130,39 5,92 3' 82,58 3,38
7 42,19 2,16 4' 83,15 3,00
8 37,18 1,97,/1,35 5' 68,74 3,48
9 77,15 4,65 6' 18,25 1.18
10 38,30 2,33/1,34 2'-OCHa 59,02 3,43
11 46,89 0,94 3^-OCH3 57,31 3,40
12 50,34 2,84 4'OCHa 60,69 3,47
13 148,86 7,03 1 100,19 4,53
14 145,73 — 2 32,41 1,80/1,38
15 198,68 — 3 18,86 1,83/1,53
16 45,49 3,22/2,50 4 66,16 2,12
17 74,17 3,58 5 74,01 4,01
18 30,74 1,52 6 19,46 1,22
19 22,41 1,70/1,17 n(ch3j 41,01 2,22
20 34,45 1,51
“'Niektóre pomiary wzięte ze stosunku 1H/'3C
Charakterystyki związku oznaczonego A 83543 G. Ciężar cząsteczkowy: 731. Wzór sumaryczny: C41H65NO10. FAB-MS (M + a): stwierdzono: 732,4661; wyliczono C4iHeeNOio = 732,4687. UV (EtOH) λ max: 243 nm (E 8,970). IR (KBr): (patrz rysunek fig. 15).
W tabeli 8 przedstawiono dane NMR 1H i 13C dla A 83543 G (w acetonie de).
Tabela 8
Pozycja 13C 1H“ Pozycja 1c 1H“
1 172,59 21 76,47 4,64
2 34,67 3,04/2,46 22 28,84 1,48
3 48,72 2,94 23 9,61 0,80
4 42,25 3,50 24 15,29 1,18
5 129,85 5,84 1' 96,98 4,81
6 130,26 5,89 2' 78,23 3,52
7 42,02 2,14 3' 82,46 3,37
8 37,12 1,95/1,34 4' 83,05 2,29
9 76,99 4,32 5' 68,64 3,49
10 38,28 2,36/1,36 6' 17,18 112
11 47,23 0,91 2'-OCH3 58,97 3,42
12 50,43 2,87 3'-OCH3 57,25 3,39
13 148,28 7,04 4'-OCH3 60,70 3,46
14 144,61 — 1 99,51 4,80
15 203,20 — 2 29,62 1,87/1,48
16 47,94 3,30 3 19,31 1,73
17 81,73 3,57 4 62,13 2,29
18 35,20 1,55 5 69,93 4,20
19 21,68 1(64,/1,16 6 18,22 117
20 31,41 1(64,/1,36 N(CH3)2 43,47 2,24
“'Niektóre pomiary wzięto ze stosunku 'H/nC
Charakterystyki związku oznaczonego A 83543 H. Ciężar cząsteczkowy: 717. Wzór sumaryczny: C40H63NO10. UV (EtOH) λ max. 243 nm (ε 10.100) + IR (KBr): (patrz rysunek fig. 16 - określono w mieszaninie 58:42 z A 83543 H:J: Charakterystyka A 83543 J. Ciężar cząsteczkowy: 717. Wzór sumaryczny: C40H63NO10. UV (EtOH) λ max: 243 nm (ε 10.100). IR (CDCI3): patrz rysunek fig. 16 - określono w mieszaninie (58:42) A 83543 H:J.
A 83543 H i J wydziela się z A 83543 jako mieszaninę (stosunek H:J = 58:42). Mieszanina ta może być rozdzielona przez HPLC (patrz poniżej). Budowę A 83543 H i J wyjaśniono na podstawie widm NMR 1H i 13C dla mieszaniny A 83543 H:J w acetonie-d6. Widma NMR są do siebie podobne
161 476 i porównywano je z widmami A 83543 A. Największe różnice w widmach związku H i J grupują się wokół cukru ramnozy. Związki H i J mają tylko dwie grupy OCH3 w tym cukrze; w związku H, H-Γ ma przesunięcie około 0,1 δ w widmie 1H NMR i 36 w widmie WC NMR (4,81 i 99,68 - odpowiednio). Przesunięcia te są wywołane nieobecnością w pozycji 2' grupy CH3 w grupie metoksylowej ramnozy. Przesunięcia w związku J odpowiadają podobnej sytuacji, czyli braku grupy metylowej w grupie metoksylowej w pozycji 3'.
Charakterystyki Pseudoaglikonu A 83543 A. Ciężar cząsteczkowy: 590. Wzór sumaryczny: C33H50O9. UV (EtOH) λ max. 243 nm (ε 10,300) IR (CHCI3): v (lakton) 1724; skoniugowany keton) 1652; liczne piki dla drgań CH około 3017 i drgań C-O około 1140 cm-1 (patrz rysunek fig. 3). FD-MS: patrz rysunek fig. 7. EI-MS: patrz rysunek fig. 11.
Charakterystyki Pseudoaglikonu A 83543 D. Ciężar cząsteczkowy: 604. Wzór sumaryczny: C34H320s.
Związki wchodzące w skład A 83543 mogą być rozdzielone przez zastosowanie następujących metod analitycznych HPLC:
Układ I. Kolumna: ODS, 3//m, 4,5X50 mm (IBM); Rozpuszczalnik: CH3OH:CH3CN:H2O (2:2:1); szybkość przepływu: l,0 ml/min; Wykrywanie: UV w 245 nm; Temperatura: temperatura pokojowa.
Układ II
Składnik Czas retencji (min.) A 8,50
B 6,15
C 3,92
D 11,47
Kolumna: 4,6 X 100 nm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom, NJ). Rozpuszczalniki: CH3OH:CH3CN:0,05% NH4OAc(H2O). (A) 35:35:30 - pH 7,8; (B) 45:45:10 - pH 6,7; Szybkość przepływu 2,0ml/min. Czas przebiegu: 35 min. Wykrywanie: UV, 250 nm. Gradient: 10% B do 25% B w 20 min; do 50% B w 30 min.
Składnik
A
A pseudoaglikon
B
C
D
E
F
G
H
J
Czas retencji (min) 22,62 7,27 12,65 10,62 25,47 19,22
16,30 18,92
16.30
17.30
Układ III. Kolumna: 4,6X100nm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom, NJ). Rozpuszczalniki: CH3OH:CH3CN:0,05% NH4OAc(H2O). 35:35:30-pH 6,0. Szybkość przepływu: 2,0ml/min. Czas przebiegu: 10 min. Wykrywanie: UV, 250 nm.
Składnik Czas retencji (min.)
F 4,32
H 3,42
J 3,42.
Związki wchodzące w skład A 83543 nie są rozpuszczalne w wodzie, lecz są rozpuszczalne w takich rozpuszczalnikach jak metanol, etanol, dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek, acetonitryl, aceton itp.
A 83543 i poszczególne składniki A, B, C, D, E, F, G, H, J mogą reagować z różnymi kwasami 1 tworzyć odpowiednie sole. Sole A 83543 są używane między innymi do wydzielania i oczyszczania A 83543. Niektóre sole, oprócz tego, mają większą rozpuszczalność w wodzie. Sole A 83543 wytwarza się według standardowych metod. Na przykład A 83543 może być neutralizowany odpowiednim kwasem, w wyniku czego powstaje sól addycyjna z tym kwasem. Sole addcyjne z kwasami są szczególnie użyteczne. Przykładowo można wymienić sole z kwasami organicznymi i nieorganicznymi, np. kwasem siarkowym, fosforowym, solnym, octowym, bursztynowym, cytrynowym, mlekowym, maleinowym, fumarowym, chlorowym, pomoinowym, śluzowym, glutaminowym, kamforowym, glutarowym, glikolowym, ftalowym, winowym, mrówkowym, laurylowym, stearowym, salicylowym, metanosulfonowym.benzenosulfonowym, pikrynowym, sorbinowym, benzoesowym, cynamonowym i innymi. Przy omawianiu zastosowań określenie „związek A 83543“ oznacza związek wybrany z grupy składającej się na A 83543, to jest spośród związków A 83543 A, A 83543 B, A 83543 C, A 83543 D, A 83543 E, A 83543 F, A 8354 G, A 83543 H, A 83543 J i ich soli addycyjnych z kwasami.
Nowy szczep Saccharopolyspora spinosa, wybrany spośród NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 i NRRL 18539 lub z ich mutantów, hodowany na odpowiednich kulturach w procesie fermentacji wytwarza się z napowietrzaniem A 83543. Jak wiadomo, stosunek komponentów A 83543 może zmieniać się i zależy od warunków, w których prowadzi się fermentację. Na ogół A 83543 zawiera około 85-90% A 83543 A, ok. 10-15% A 83543 D i mniejsze ilości A 83543 B, C, E, F, G, H i J oraz pseudoaglikon A 83543 A. Poszczególne składniki, takie jak A 83543 A, A 83543 B, A 83543 C, A 83543 D, A 83543 E, A 83543 F, A 83543 G, A 83543 H i J oraz pseudoaglikon A 83543 A mogą być wydzielone i rozdzielone według metod opisanych niżej.
Proces wytwarzania związku A 83543 polega na hodowli szczepu Saccharopolyspora Spinosa wybranego z NRRL 18395, NRRL 18357, NRRL 18538 lub NRrL 18539 albo też ich mutantów wytwarzających A 83543 na pożywce zawierającej przyswajalne źródła węgla, azotu i soli nieorganicznych w warunkach podpowierzchniowej fementacji napowietrznej, prowadzonej aż do otrzymania dających się wyodrębnić ilości A 83543. Poszczególne składniki mogą być wyodrębnione i rozdzielone w sposób znany w technice.
Środek według wynalazku zawiera związki wytwarzane też przez biologicznie oczyszczone kultury mikroorganizmu Saccharopolyspora Spinosa wybrane spośród NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 lub NRRL 18539, a także mutantów wytwarzających A 83543.
W dalszym ciągu omówienia szczepy będą znaczone: A 83543.1, A 83543.3, A 83543.4 i A 83543.5. Kulturę A 83543.1 otrzymano przez mutację chemiczną kultury (A 83543) wyodrębnionej z próbki ziemi zebranej na Wyspach Dziewiczych. Kultury A 83543.3, A 83543.4 i A 83543.5 otrzymano z pochodnych kultury A 83543.1 przez mutacje chemiczne.
Kultury A 83543.1, A 83543.3, A 83543.4 i A 83543.5 zostały zdeponowane i weszły w skład kolekcji szczepów w Midwest Area Northern Regional Research Center. Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, North University Street, Peoria, Illinois, 61604, skąd mogą być udostępnione pod kolejnymi numerami:
NRRL nr 18395
18537
18538
18539
Szczep Nr A 83543.1 A 83543.3 A 83543.4 A 83543.5.
Badania taksonomiczne kultur A 83543.1 zostały wykonane przez F. P. Mertza z Laboratorium Badawczego Lilly.
Opierając się na tych badaniach mikroorganizmy A 83543.1, A 83543.3, A 83543.4 i A 83543.5 sklasyfikowano jako nowe gatunki Sacharopolyspora i nazwano je Saccharopolyspora spinosa sp. nov. Klasyfikacja ta opiera się na bezpośrednich obserwacjach i porównaniach laboratoryjnych dotyczących opublikowanych opisów podobnych gatunków.
Stosowane metody.
Stosowano metody rekomendowane przez International Streptomyces Project (ISP) dla charakteryzowania gatunku Streptomyces (E. B. Shirling i D. Gottlieb, „Methods for Charakterization of Streptomyces Species“, Int. J. Syst. Bactenol 16:313-340 (1966) i metody polecane dla określania gatunków Nocardia, R. E. Gordon, D. A. Barnett, J. E. Handerhan i C. H. Pang, „Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica i Nocardia Strain, Int. J. Syst. Bacteriol. 24 (1), 54-63 (1974).
161 476
Do określania zabarwienia strzępków powietrznych i rewersu grzybni stosowano ISCC-NBS Centroid Color Charts, próbka standardowa No. 2106 (Nationak Bureau of Standards, 1958, US Department of Commerce, Washington, D. C.).
Morfologię badano używając mikroskopu optycznego i mikroskopu elektronowego (SEM).
Do oznaczania izomeru kwasu diaminopimelinowego (DAP) i węglowodanów w hydrolizatach całych komórek stosowany metody chromatograficzne opisane przez Beckera i innych, „Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography ofWholecell Hydrolysates, Appl. Microbiol. 12,421-423 (1964) i Lechevaliera (Μ. P. Lechevalier and H. Lechevalier, „Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes, Int. J. Syst. Bacteriol, 20,435-443 (1977/). Fosfolipidy oznaczano według metody Μ. P. Lechevaliera i H. Lechevaliera (A University Laboratory Approarch, Dietz and Thayer (eds), Society for Industrial Microbiology Special Publication No 6, Arlington, VA, pp. 227-233 /1989/).
Skład mieszaniny menachinonów oznaczano metodami R. M. Kroppestedta (Chemical Methods in Bacterial Systematies, M. Goodfellow and D. E. Minnikin (eds), 1985 pp. 173-196) i M. D. Collinsa (ibid., pp. 267-285).
Odporność na antybiotyki oznaczano przez umieszczanie krążków nasyconych antybiotykami na powierzchni kultur ISP No2 na płytkach agarowych. Hydrolizę skrobi oznaczano stosując próbę jądrową na obecność skrobi na ISP No4 (sole nieorganiczne-skrobia) na płytkach agarowych. Analizy kwasów tłuszczowych wykonywano stosując HP 5898A Microbial Identification system (patrz L. Miller i T. Berger, „Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Coli Fatty Acids“, Hewlett-Packard Application Notę 228-41, 8pp /1985/).
Estry metylowe kwasów tłuszczowych otrzymywano z liofilizowanych komórek wyhodowanych w identycznych warunkach.
Analizę zasadniczych kompenentów wykonywano w dwóch wymiarach na komputerze (vide rysunek fig. 12).
Kwasy mykolowe oznaczono metodami proponowanymi przez Minnikina (D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson i A. B. Caldicott, „Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria, J. Chromatography 188, 221-233 /1980/).
Charakterystyka kultur.
Kultury A 83543.1 wzrastają dobrze zarówno na pożywkach o skomplikowanym składzie jak i na prostych. Hodowla tworzy strzępki powietrzne na wszystkich używanych pożywkach. Zabarwienie masy zarodnikowej od strony powietrznej jest jasno żółtawo-różowe, lecz na niektórych pożywkach występuje białe zabarwienie. Rewers, czyli odwrotna strona, ma zabarwienie zółtobrązowe do żółtego. Nie występuje określona pigmentacja, lecz w niektórych pożywkach jest obecny brązowy pigment. Charakterystyki hodowli zebrano w tabeli 9.
Tabela 9
Charakterystyki hodowli A 83543 l”
Pożywka Wzrost Zabarwienie rewersu Strzępki powietrzne Pigment rozpuszcz
wzrost zabarwienie
ISP pożywka 2 obfity 76 j br obfity 92 z biały brak
ISP pożywka 3 dobry 264 j sz dobry 263 biały brak
ISP pożywka 4 dobry 92 z b dobry 263 biały brak
ISP pożywka 5 obfity 73 j pom zól obfity 31 j róz j brun
ISP pożywka 7 obfity 77 j br obfity 31 j róz j brun
AIA Agar' obfity 89 j żółty obfity 31 j róz brunatny
ATCC Nr 172 obfity 92 zół -biały obfity 31 j róz brak
Bennetts obfity 92 zół -biały obfity 31 j róz j brunat
Jabłczan Ca dobry 73 j pom zół poprawny 9 biały brunatny
Chityna poprawny 92 zół -biał poprawny 263. biały brak
Czapek dobry 92 żół - bial dobry 263 biały brak
Emerson obfits 76 j zół br obfity 31 j z róz brunatny
Glikoza-Asparagina dobr\ 90 szar zół poprawny 31 j z róz j brunatny
Ghceryna-Glicyna obfitv 78 c zół br obfity 80 sz zół br c brunat
Nutrient obfitv 90 sz zółtv obfity 31 j z róz j brunatny
TPO' obfitv 90 sz żółty obfity 31 j ż róz brak
TWA' poprawny 93. zół szary słaby 263. biały brak
YDA0' obfity 77 śr z br poprawny 9 biały c brunat
“'inkubacja w 3°° przez 21 dni 'izolacja Actinomycetes, Agar, Difco 'pasta pomidorowa i mąlra owsiana W Tlie Αctιnomycetes, νύ1 2 SA Wal^ma^ Tlie Wdliams and WUtons Co , Baltιmore, 1961 'woda z kranu-agar (Gordon, Barnet^ Handerhahn and Pang j w ) “'agar z dekstroza drozdzowa ^Gordon. BarnetC Handerhahn an< Pan^ i w 1
161 476
Charakterystyki morfologiczne.
Kultury A 83543.1 tworzą rozległą grzybnię podłoża, która rozpada się w procesie fermentacji w cieczy. Rozpad ten nie następuje, gdy hodowla prowadzona jest na pożywce agarowej. Na pożywce ISP 1 na płytkach tworzą się białe koliste kolonie o średnicy 8-10 mm ze wzniesionym centrum i żółto-brązowym zabarwieniu odwrotnej strony. Na większości pożywek obserwuje się dobrze wykształcone strzępki powietrzne, które tworzą długie łańcuchy sporów, ułożonych w pętle otwarte i sierpy. Obserwuje się również spirale, lecz są one krótkie i niekompletne. Morfologia ogólna jest typu Rectus-Flexibilis (RA).
Strzępka powietrzna ma wyraźny wygląd ziarnisty, z wieloma pustymi miejscami w łańcuchu sporów. Ten kształt wykazuje, że pochewki sporów okrywa łańcuch sporów, który jest pokryty bardzo wyraźnymi kolcami. Kolce mają długość 1 pm i są zaokrąglone na końcach. Kształt sporów jest owalny. Osiągają one wymiary l,lXl,5pm. Łańcuchy sporów składają się z ponad 50 jednostek. Nie zaobserwowano charakterystycznych zygzaków, przetwalników, zarodników lub ruchomych komórek.
Charakterystyka fizjologiczna.
Hodowla A 83543.1 wytwarza kwasy z następujących węglowodanów: adonitu, D-arabinozy, erytrytu, fruktozy, glikozy, gliceryny, mannitu, mannozy, rybozy i trehalozy.
Hodowla nie wytwarza kwasów z: L-arabinozy, cellobiozy, cellulozy, dekstryny, dulcytu, etanolu, galaktozy, glikogenu, inozytu, inuliny, laktozy, maltozy, melicytozy, melebiozy, ametylo-D-glikozy, rafinozy, L-ramnozy, salicyny, sorbitu, L-sorbozy, sacharozy, kysylytu oraz ksylozy.
Obserwuje się wzrost kultury po dodaniu galaktozy, maltozy i melicytozy, lecz z węglowodanów tych nie powstają kwasy.
Kultura A 83543.1 wykorzystuje następujące sole sodowe kwasów organicznych: octany, maślany, cytryniany, mrówczany, mleczany, jabłczany, propioniany, pirogroniany i bursztyniany.
Kultura A 83543.1 nie wykorzystuje soli sodowych: kwasu benzoesowego, śluzowego, szczawiowego i winowego. A 83543. 1 rozkłada alantoinę, jabłczan wapniowy, kazeinę, elastynę, hipurany, hipoksantynę, testosteron, L-tyrozynę i moczniki, nie jest zdolny do rozkładu adeniny, eskuliny, guaniny, skrobi lub ksantyny, A 83543.1 wytwarza katalazę, fosforazę, ureazę i H2S, upłynnia żelatynę 1 redukuje azotany. Ulega działaniu lizozynu i nie wytwarza pigmentów melanoidowych. Nie peptonizuje ani nie hydrolizuje mleka odciągniętego. A 83543.1 toleruje obecność NaCl aż do stężenia 11%. Nie przeżywa temperatury 50°C w ciągu 8 godzin, lecz wzrasta w temperaturze między 15° a 37°.
A 83543.1 jest odporny na cefalotynę (30 pg), penicylinę G (10 jednostek) i rifampinę (5pg), natomiast jest wrażliwa na bacytracynę (10 jednostek), gentamycynę (10/tg), linkomycynę (2//g), neomycynę (30jug), oleandomycynę (15//g), streptomycynę (10//g), tetracyklinę (30pg), tobramycynę (10>ug) i Vankomycynę (30/rg).
Analiza ścian komórek.
Ściany komórek A 83543.1 poddano hydrolizie i stwierdzono, że zawierają one kwas mezodiaminopimehnowy. W ekstraktach z całych komórek diagnostycznymi cukrami są galaktoza i arabinoza. Wynika z tego, ze A 83543.1 ma ściany typu IV1 typ A pod względem rodzaju cukrów, (Lechevalier and Lechevaher, supra). Komórki nie zawierają kwasów mykolowych.
Oznaczanie fosfolipidów w całych komórkach wykazały obecność fosfatydylocholiny i kardiolipiny. Nie wykryto fosfatydylo-etanoloaminy. Wynika z tego, ze A 83543.1 ma typ P III rodzaju fosfolipidów. (Μ. P. Lechevalier, A. E. Stern and H. A. Lechevalier, „Phospholipidis m the Taxonomy of Actinomycetes w Actinomycetes, Zbl. Bakt. Suppl. 11, K. P. Schnel and G. Pulverer (eds), Gustav Fischer Verlag, New York, 1981).
Jako główny monachinon wykryto MK-9(H4 Zaobserwowano niewielkie ilości ΜΚ-9(Ηθ).
Umieszczania fagów.
Fagi gatunków Streptomycete, Sachcaropolyspora 1 Amycolatopsis posiewano na A 83543.1 Nie zaobserwowano tarczek.
Identyfikacja A 83543 1.
Jak ustalono wyżej, kultura A 83543. 1 ma cechy typu IV ścian komórek 1 cechy typu cukrów A zawartych w całej komórce. Te same cechy występują u 13 następujących rodzajów: Nocardia,
161 476
Rhodococcus, Coryneracterium, Caseobacter, Nycobacterium, Daenia, (Micropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Amycolata, Amylocolatopsis i Kibdelosporangium. Rodzaje te są rozróżniane przez obecność lub nieobecność kwasów mykolowych, przez skład mieszaniny kwasów tłuszczowych i przez klasyfikację typów fosfolipidowych i monachinonowych. Faenia, Pseudonocardia i Saccharopolyspora mają charakterystyki chemotoksonomiczną identyczne z A 83543.1, lecz rodzaje te różnią się od A 83543.1 właściwościami morfologicznymi i hodowlanymi.
Rodzaj Faenia (Micropolyspora) ma gładkie spory i krótkie łańcuchy sporów, które tworzą się zarówno na niciach strzępki powietrznej jak i na grzybni podłoża. Jego strzępka jest rzadko rozsiana i ma białe zabarwienie. Jest to rodzaj ciepłolubny, który wzrasta w temp. 60°C. A 83543.1 nie ma żadnej z tych właściwości, zatem różni się od Faenia.
Rodzaj Pseudonocardia ma spory na grzybni podłoża jak i na strzępce powietrznej. Rozróżnia się go po pączkowaniu (acropetal budding) i po blastosporach. Ma on charakterystyczny zygzakowaty kształt nici strzępki powietrznej. Nici strzępki są opisane jako wykształcone lecz nie poprzedzielane (patrz A. Henssen i D. Schafer, „Amended Deseription of the Genus Pseudonocardia Henssen and Deseription of a New Species Pseudonocardia Spinosa Schafer, Int. Syst. Bacteriol. 21:29-34 (1971). Wzrasta on bardzo powoli. Fragmentacja nie występuje wcale lub tylko rzadko. A 83543. 1 nie ma żadnej z tych właściwości.
Rodzaj Sacharopolyspora charakteryzuje się obecnością osłonek sporów i wyraźną ziarnistą budową łańcuchów sporów. Budowa ta jest bardzo widoczna u A 83543.1. Fragmentacja występuje również u rodzajów Saccharopylospora. Typowe gatunki, S. hirsuta, wyizolowano z syropu z wytłoczyn z trzciny cukrowej. Kultura macierzysta, z której otrzymano A 83543.1 została otrzymana z młyna do mielenia trzciny cukrowej. Ponieważ A 83543.1 ma wiele właściwości charakterystycznych dla tego rodzaju, jest uważany za szczep Saccharopolyspora.
Jedynymi, dobrze opisanymi gatunkami rodzaju Saccharopolyspora są S erythiea i S. hirsuta. Znanymi podgatunkami są S hirsuta subsp. taberi i S. hirsuta subsp. kobensis. A 83543 1 różni się od tych szczepów albo pod względem zabarwienia strony powietrznej i rewersu lub pod względem tworzenia rozpuszczalnego pigmentu.
Podobieństwa biochemiczne oceniono konstruując tabelę współczynników podobieństwa, opartych na możliwie największej liczbie ocen biochemicznych. Stosowano tutaj współczynniki Jaccarda Sj i współczynnik Sm (Simple matching) (patrz W. Kuryłowtcz. A. Paszkiewicz, W. Woźnicka, W. Kurzatkowski i T. Szulga, „Numerical Taxonomy of Streptomycetes, Polish Medical Publishers, Warsaw, 1975, p. 37).
W tabeli 10 przedstawiono współczynniki podobieństwa.
T a b e la 10
Kultura Sm Sj
A 83543 1 100 100
S hirsuta subsp taheri 68 57
S hirsuta subsp kobensis 67 60
S erythraea 63 54
S hirsuta 55 50
Analiza kwasów tłuszczowych A 83543.1 i znanych gatunków Saccharopolyspora wykazała, że każdy z nich zawiera kwasy tłuszczowe nasycone o łańcuchach prostych i rozgałęzionych. Skład kwasów tłuszczowych występujących w A 83543.1 jest podobny lecz nie identyczny w porównaniu ze składem kwasów tłuszczowych innych gatunków W tabeli 11 porównano skład kwasów tłuszczowych A 83543.1 i znanych gatunków Saccharopolyspora.
Analizy głównych składników kompozycji kwasów tłuszczowych zamieszczono w tabeli 11 i wykazują wystarczające różnice, aby stwierdzić, że kultury te dotyczą innych gatunków w obrębie tego samego rodzaju Składy kwasów tłuszczowych z tabeli 11 są przedstawione na wykresie rysunek fig 12
161 476
W tabeli 12 porównano fizjologiczne charakterystyki A 83543. 1 i innych gatunków i podgatunków Saccharopolyspora.
Tabela II
Współczynniki podobieństwa dla A 83543 I i gatunków Saccharopolyspora
A 83543 1 S erythraea S hirsuta S hirsuta subsp kobensis
15 1 Izo 11,80 17,86 15,44 17,94
15 0 Anteizo 0,64 1,33 1,38 1,25
16 0 Izo 22,47 25,70 15,61 19,05
16 1 Trans 9 1,15 — 4,14 2,63
17 1 Izo F 7,22 7,97 — —
17 1 Izo G — — 3,75 6,82
17 Olzo 17,59 13,37 26,26 19,41
17 0 Anteizo 15,30 12,46 14,19 12,72
17 1 E 4,77 1,90 — 0,67
17 1 C 1,65 — 2,70 1,81
170 2,74 1,01 1,43 0,94
16 1 20H 1,27 2,07 4,74 4,85
18 1 Izo Γ 7,57 11,31 6,83 7,47
TBSA lOMe 18 1,15 1,34 1,77 1,00
“'TBSA = kwas liit>erkulostearowy
Tabela 12
Różnicujące charakterystyki fizjologiczne A 83543 I i gatunków Saccharopolyspora
Charakterystyka A 83543 1 S crythaea S hirsuta S hirsuta subsp taben S hirsuta subsp kobensis
Rozkład
adeniny — + + + F
eskuhny — + + + +
skrobi — + + + +
ksantyny — + + + +
alantoiny + — — — ND*'
Redukcja NOs + + — + +
Wykorzystanie przez
fosfatazę benzoesanów — — + — ND
mucatc — — + — ND
szczawianów — — + — ND
Zakres temper (°C) 15-37 20-42 25-50 20-42 20-42
Tolerancja 11 ND* 15 ND 12
Wytwarzanie kwasów z
arabinozy U + — + —
ccllobiozy — + + + +
dekstryny — + + + ND
galaktozv — + + F —
inozytu — + F —
maltozy — + + + +
malezytozy — + — F ND
melibiozy — + ND — ND
ralfinozv — + + + +
rhamnozy — + + + —
saltcyny — -1 — — ND
sacharozy — - + +
ksvlo7> — T _u — —
laktozy — — + — ND
-Me-D-glιko1\du — — -I- + ND
asorbitu — — + — —
inuliny — MD 4- ND F
'me przeprowadzono
161 476
Porównania te wskazują, że A 83543.1 różni się w wystarczający sposób od uprzednio opisanych gatunków Saccharopolyspora aby można było uznać, iż stanowi nowy gatunek Saccharopolyspora, co pozwala na wybranie nazwy Saccharopolyspora spinosa. Nazwa spinosa odzwierciedla kolczasty wzór na sporach tego gatunku.
Szczepy A 83543.3, A 83543.4 i A 83543.5 są wystarczająco podobne do makroskopowo do szczepu A 83543.1 aby można było je sklasyfikować jako szczepy Saccharopolyspora spinosa. Te cztery szczepy różnią się pod względem ilości produkowanego przez nie A 83543. Szczepy A 83543.3 produkuje w przybliżeniu czterokrotnie więcej A 83543 niż A 83543.1, a szczepy A 83543.4 i A 83543.5 produkują ośmio- dziewięciokrotnie więcej niż szczep A 83543.1.
Tak, jak to w przypadku innych organizmów, charakterystyki kultur produkcyjnych A 83543 będących składnikiem aktywnym środka według wynalazku, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 i NRRL 18539 mogą ulegać zmianom. A więc, mutanty tych szczepów mogą być otrzymane znanymi metodami fizycznymi i chemicznymi. Na przykład, inne szczepy mogą być wytworzone przez działanie chemikaliami, takimi jak N, metylo-N'-nitro-Nnitrozoguamdyna. Składnikiem czynnym środka według wynalazku jest też A 83543 wytwarzany w wykrywalnych ilościach przez naturalne i indukowane mutanty tych szczepów Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 19538 i NRRL 18539, które utrzymały właściwości produkowania A 83543.
Podłoże hodowlane, stosowane do hodowli Saccharopolyspora spinosa może mieć różnorodny skład, ze względu na ekonomikę produkcji, optymalną wydajność i łatwość wydzielania produktu, przy czym niektóre pożywki są preferowane. Tak więc, na przykład, preferowanymi źródłami węgla w fermentacji na dużą skalę są glikoza i maltoza, chociaż również mogą być stosowane inne cukry jak ryboza, ksyloza, fruktoza, galaktoza, mannoza, a także mannit, skrobia rozpuszczalna, dekstryna ziemniaczana, oleinian metylu, oleje, takie jak olej sojowy i inne.
Preferowanymi źródłami azotu są mąka z nasion bawełny, mleko peptonizowane, trawiona mąka sojowa; można też stosować mączkę rybną, namok kukurydziany, wyciąg z drożdży, kazeinę hydrolizowaną enzymatycznie, ekstrakt mięsny i podobne.
Do soli nieorganicznych dodawanych do podłoża hodowlanego należą zwykle dodawane sole, dostarczające jonów cynku, sodu, magnezu, wapnia, amonu, chlorku, węglanowych, siarczanowych, azotanowych i podobnych.
Podstawowe śladowe pierwiastki konieczne do wzrostu i rozwoju organizmu muszą również znajdować się w podłożu hodowlanym.
Pierwiastki śladowe występują powszechnie jako zanieczyszczenia w innych składnikach podłoża hodowlanego w ilościach wystraczających do zaspokojenia wymagań wzrastającego organizmu.
Przy występowaniu pienienia się, dodaje się zwykle małe ilości (tj. 0,2 ml/1) środków przeciw pienieniu, jak na przykład glikol polipropylenowy do podłoża hodowlanego przy prowadzeniu procesu fermentacji w dużej skali.
W przypadku kultur produkujących A 83543, konwencjonalne środki przeciw pienieniu inhibitują wytwarzanie A 83543. Pienienie może być ograniczane przez dodanie oleju sojowego lub preparatu Pluronic L-101 (BASF) do środowiska fermentacji (1-3%). Ilość dodawanego oleju można zwiększyć, jeśli pienienie zwiększa się.
Zawartość procentowa składników A 83543 może ulegać zmianom wraz ze zmianami środowiska Na przykład, dodatek walmy albo kwasów izomasłowego lub propionowego powoduje wzrost zawartości A 83543.
Do wytwarzania znacznych ilości A 83543 preferuje się fermentację (przewietrzoną fermentację wgłębną) z napowietrzaniem w bioreaktorach zaopatrzonych w mieszadła. Małe ilości A 83543 mogą być wytwarzane w kolbach na trzęsawkach Ze względu na dużą ilość czasu potrzebną w produkcji przy mokulowaniu dużych bioreaktorów zarodnikami, preferuje się szczepienie wegetatywne. Szczepienie wegetatywne przeprowadza się przez szczepienie małej objętości podłoża hodowalnego sporami lub framentami grzybni, aby otrzymać świeżą, aktywnie wzrastającą hodowlę organizmu. Szczepiony w ten sposób roztwór przenosi się następnie do większego reaktora. Podłoże hodowlane może być takie samo, jakie stosuje się w fermentacji na dużą skalę, lecz można stosować również inne podłoże.
161 476
A 83543 jest wytwarzane przez organizmy produkujące A 83543 podczas wzrastania w zakresie temperatur 24-33°C. Optymalnymi temperaturami do wytwarzania A 83543 są temperatury 28-30°C.
Zazwyczaj przy przewietrznej fermentacji wgłębnej sterylne powietrze wdmuchuje się do tanków od dołu, podczas gdy podłoże hodowlane jest mieszane za pomocą konwencjonalnych mieszadeł turbinowych. Na ogół, stopień napowietrzania i szybkość mieszania winny być takie, aby utrzymać poziom rozpuszczonego tlenu w ilości min. 35%, a preferuje się około 50% nasycenia powietrzem pod ciśnieniem wewnątrz tanku 0,33 MPa.
Tworzenie się komponentów A 83543 może być śledzone w czasie fermentacji przez badanie ekstraktów z brzeczki. Do badania można stosować HPLC, stosując system opisany w przykładzie I.
Śledzenie wytwarzania się komponentów A 83543 w warunkach hodowli głębinowej z napowietrzaniem wymaga wydzielania A 83543 ze środowiska fermentacji znanymi metodami. A 83543 tworzący się podczas fermentacji znajduje się zarówno w grzybni, jak i w brzeczce; A 83543 jest związkiem lipofilowym, a więc jeśli w czasie fermentacji zostanie użyta znacza ilość oleju, ekstrakcja brzeczki jest łatwiejsza. Jeżeli używa się mniejszych ilości oleju, większa część A 83543 znajduje się w grzybni. W takim przypadku bardziej efektywne wydzielanie A 83543 osiąga się przez odsączanie masy mycelium (biomasy) z brzeczki.
A 83543 może być wydobywany z biomasy różnymi technikami. Preferowany sposób polega na przemyciu oddzielonej biomasy wodą aby usunąć pozostałości brzeczki, wymieszaniu biomasy z polarnym rozpuszczalnikiem, w którym rozpuszcza się A 83543, na przykład metanolem lub acetonem, oddzielenie i zatężenie rozpuszczalnika, ekstrakcji zatężonej pozostałości niepolarnym rozpuszczalnikiem i/lub adsorbowaniu na żelu silikonowym (z odwróconymi fazami), jak RP-08 lub RP-018 lub na polimerze o wysokim stopniu porowatości, jak HP-20 i podobnych.
Aktywną substancję wymywa się z adsorbantu odpowiednim rozpuszczalnikiem, na przykład mieszaniną acetonitrylu i metanolu, zawierającą niewielką ilość THF.
A 83543 może być rozdzielony na poszczególne składniki A 83543 A, A 83543 B, A 83543 C, A 83543 D, A 83543 E, A 83543 F, A 83543 G, A 83543 H, A 83543 J i A 83543 A - pseudoaglikon. Perforowanym sposobem rozdzielania jest chromatografia podziałowa z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym (C18 lub C8).
Alternatywnie, jako źródło A 83543 mogą być stosowane osady z procesu fermentacji, zawierające składniki środowiska fermentacji i grzybnię, bez ekstrakcji lub rozdzielania, lecz najlepiej po oddzieleniu wody. Na przykład, po zakończeniu procesu otrzymywania A 83543, całość brzeczki fermentacyjnej poddaje się liofilizacji przez suszenie w suszarkach bębnowych lub przez destylację azotropową i suszenie.
Wysuszona brzeczka może być użyta bezpośrednio, na przykład, przez bezpośrednie mieszanie z premiksem.
Aktywność owadobójcza i roztoczobójcza.
Związki stanowiące składnik czynny środka według wynalazku są używane do zwalczania owadów i roztoczy. Wynalazek pozwala na zawalczanie owadów i roztoczy przez odpowiednie dostarczenie środka owado- i roztoczobójczego zawierającego A 83543 do miejsca, w którym znajdują się owady lub roztocza.
Związki A 83543 wykazują aktywność przeciw wielu gatunkom owadów i roztoczy. Bardziej szczegółowo, związki te wykazują aktywność przeciw Spodoptera eridania (Southern armyworm), przedstawiciela owadów rzędu Lepidoptera. Innymi przedstawicielami tego rzędu są ćma owocowa (colding moth), gąsienica rolnicy zbozówki (cutworms), mól odzieżowy, mól mąki kukurydzianej (Indianmeal moth), europejski wołek zbozowy, gąsienice niszczące kwiat bawełny (cotton bellworm) (pink bollworm), owady niszczące kapustę (imported cabbage warm, cabbage looper), osnuja darniowa (sed webworm) i inne, jak skoczki, mączniakowate. kraskowate. Związki A 83543 wykazują również działanie przeciw mszycom bawełnianym (cotton aphid), które należą do owadów rzędu Homoptera, wykazują też działanie owadobójcze przeciw innym przedstawicielom tego izędu.
A 83543 wykazują ponadto czynność przeciw muchom bydlęcym, muchom mięsnym i moskitom, które są przedstawicielami rzędu Diptera Przedstawicielem tego rzędu jest mucha domowa.
161 476
Związki A 83543 są użyteczne przy redukcji populacji owadów i roztoczy i są stosowane do hamowania wzrostu populacji owadów i roztoczy poprzez zastosowanie w miejscu występowania owadów i roztoczy skutecznej do inaktywacji owadów i roztoczy ilości związków A 83543.
Określenie „Miejsca występowania owadów odnosi się do środowiska, w którym żyją owady i roztocza lub gdzie znajdują się ich jajeczka. Odnosi się to również do powietrza otaczającego je, pożywienia, którym się żywią lub obiektów, z którymi się stykają. Na przykład, owady i roztocza żywiące się roślinami mogą być zwalczane przez stosowanie czynnego związku na części rośliny, którymi żywią się owady i roztocza lub na których zamieszkują, a szczególnie na liściach roślin
Związki A 83543 mogą być użyteczne do ochrony materiałów tekstylnych, papieru, przechowywanego zboża i nasion przez naniesienie aktywnego związku na ten materiał. Określenie „zwalczanie owadów i roztoczy odnosi się do spadku liczby żywych owadów i roztoczy lub do spadku liczby zdolnych do życia jajeczek owadów lub roztoczy. Rozmiar redukcji wywołanej przez związek zależy naturalnie od częstotliwości stosowania związku, od tego, który ze związków się stosuje i od gatunku owadów i roztoczy, które mają być celem tego działania.
Terminem „ilość dezaktywująca owady i „ilość dezaktywująca roztocza określa się ilość wystraczającą aby spowodować dającą się zmierzyć redukcję traktowanej populacji owadów lub roztoczy. Zazwyczaj stosuje się aktywny związek w ilościach od 1 do 1000 ppm (lub 0,01 do 1 kg/ha).
W jednym z preferowanych zastosowań, wynalazek niniejszy wykorzystuje się w metodzie zwalczania wrażliwych owadów rzędu Lepidoptera, przez zastosowanie na rośliny efektywnej dawki środka według wynalazku, dezaktywującej owady związku.
Badania czynności roztoczo owadobójczej.
Związki A 83543 były testowane na czynność roztoczobójczą i owadobójczą w następujących sposobach.
Każdy z badanych związków był rozpuszczany w mieszaninie aceton/alkohol (1:1), zawierającej 23 g „Teximul R“ (mieszanka sulfonian-niejonowy emulgator) i 13 g „Teximul S“ (mieszanka sulfonian - niejonowy emulgator) na litr. Roztwory te były następnie rozcieńczane wodą do pożądanego stężenia. Tetranychus urticao Koch, oraz mszyce bawełniana i melonowa (Aphia gossypii Glover) umieszczono na zgniecionych liścieniach i pozwolono aby umiejscowiły się na obydwu powierzchniach liści. Inne rośliny w tym samym naczyniu użytym do doświadczenia pozostawiono nie zakażone szkodnikami. Liście spryskano następnie 5 ml badanych roztworów stosując spryskiwacz DeVilbissa przy ciśnieniu 0,69 MPa. Pokryto aż do nasycenia obydwie powierzchnie liścia i pozwolono na schnięcie przez jedną godzinę. Dwa niezakażone liście ucięto i umieszczono na szalce Petriego zawierającej Spodptera oridania Cramer (nouthern armyworrn). Inne owady badno używając podobnych procedur form i porównywania, z wyjątkami, które omówiono.
Po standardowych okresach wystawiania na działanie określono procent śmiertelności. Wyniki zestawiono w tabelach podanych niżej. Stosowano następujące skróty:
Skrót O wad/roztocze Nazwa naukowa
BW ryjkowiec bawełniany (boli weevil) Anthonomus grandis
CA mszyca bawełniana (cotton apliid) Aplns gossypii
CBW mszyca mszcząca kwiat bawełny (cotton bollworm) Heliothis zea
CLH skoczek zbozowy (cornleafhopper) Dalibulus maidis
SAW Southern armyworm Spodoptera eridama
CRW Southern corn rootworm Diabrotica undecimpunctata howardi
SM twospotted spidor mite Tetranychus urticae
Tabela 13
Aktywność A 83543 A przeciw nowonarodzonym larwom CBW
Stosowanie dm” dawka/ppm % 'nhibitowania
1 2 3 4
Powierzchniowo01 1 1,00 20,00
5,00 100,00
10,00 100,00
50,00 100 00
100,00 100,00
161 476
1 2 3 4
Dieta01 4 1,00 30,00
5,00 100,00
10,00 100,00
50,00 100,00
100,00 100,00
Jajeczka”' 6 10,00 0,00
50,00 0,00
100,00 30,00
powierzchniowo“' 1 0,50 10,00
1,00 40,00
5,00 80,00
10,00 100,00
100,00 70,00
Dicta 3 0,50 15,00
1,00 45,00
5,00 100,00
10,00 100,00
50,00 100,00
^Liczba dni między zastosowaniem a obserwacją “'Średnia z dwóch pomiarów “'Stosowanie 1 ml preparatu A 83543 A “'Dieta - powierzchnia potraktowana A 83543 A, wysuszona i zakażona *’ Jajeczka traktowano powierzchniowo A 83543 A i trzymane dot^ az jajeczka kontrolne dojrzeją do wylęgu
Tabela 14
Procentowy spadek nowonarodzonych larw CBW przez zastosowme związków A 83543”
Składnik2' PPM
0,5 1 5 10
A 55 (d) 100 (a) 100 (a) 100 (a)
B 35 (e) 80 (c) 100 (a) 100 (a)
C 5 (g) 85 (bc) 93 (bc) 100 (a)
D 58 (d) 90 (ac) 100 (a) 100 (a)
E 28 (ef 58 (d) 100 (a) 100 (a)
F 0 (g) 0(g) 0 (g) 95 (ab)
G 0 (g) 0(g) 20 (f) 80 (c)
Zastosowanie z tymi samymi literami w nawiasach są podot>ne na poziomie 0,05 2,powierzchniowa metoda z zastosowaniem pipety w próbach po 20 larw w czterech replikach, jeden dzień między zastosowaniem i obserwacją
Tabela 15
Aktywność A 83543 A wobec larw SAW
Stan Działanie Dni”' Dawka (ppm) % mfitHtowania1'
1 2 3 4 5
Świezo wylęgte Fasola piechota0' 3 1,00 10,00
5,00 40,00
10,00 100,00
50,00 100,00
100,00 100,00
Śuiezo wylęgte (powierzchniowo0' 3 1,00 0,00
5,00 60,00
10,00 100,00
50,00 100,00
100,00 100,00
— Tasola piechota”' 4 0,50 0,00
1,00 66,67
5,00 100,00
10,00 100,00
50,00 100,00
161 476
1 2 3 4 5
Diuga forma powierzclimowo01 1 1,00 0,00
5,00 0,00
10,00 0,00
50,00 80,00
100,00 100,00
“-“ Fasota piecliota1 4 1,00 0,00
5,00 0,00
10,00 80,00
50,00 80,00
100,00 100,00
Trzecia forma powierzcliniowo”1 2 1,00 0,00
5,00 0,00
10,00 13,33
50,00 73,33
Trzecia forma Fasola piechota1 4 0,50 0,00
1,00 0,00
5,00 40,00
10,00 100,00
50,00 100,00
“'βηι między zastosowaniem a obserwacją d,Dwa powtórzenia “Średnia z powt<5rzonych testów “Trzy powtórzenia “jeitóo powtórzenie (replika) Zastosowanie powierzchniowe 1 ml roztworu A 83543 A
Tabela 16
Aktywność A 83543 A wobec dorosłych BW
Działanie Dawka (ppm) % intófrtowania*’
powierzchniowo“ 1,00 0,00
5,00 20 00
10,00 20,00
50,00 100,00
100,00 100,00
“Sedno powtórzenie (replika), obserwacja 3 dni po zastosowaniu “roztwór A 83543 A (I ml) wylano na dorosłe owady na płytce Petriego
Tabela 17
Aktywność A 83543 A w próbce szklarniowej przeciw różnym szkodnikom upraw
Uprawa Szkodnik Dawka (ppm) tótóbitowanie'
Kukurydza CRW 30 100
15 50
7,5 10
3,75 0
Dynia SAW 250 100
125 100
62,5 100
31,25 55
15,63 40
7,8 20
3,9 20
1,9 0
Dyma SM 250 70
125 40
62,5 20
31,25 0
Dema CA 100 0
50 0
Kukurydza CI H 200 90
100 30
50 0
Fasola-piechota SM 100 100
50 80
25 30
12,5 10
6,25 0
161 476
Tabela 18
Aktywność A 83543 A w próbie szklarniowej przeciw różnym szkodnikom upraw
Uprawa Szkodnik Dawka (ppm) %
Dyma CA 100 80
50 40
25 0
Kukurydza CRW 6 30
3 0
W tabeli 18 przedstawiono porównania efektywności wyrażonej śmiertelnością z działaniem methomylu.
Tabela 19
Skuteczność A 83543 przeciw Spodoptera ondania w testach doniczkowych na powietrzu
Działanie Dawka (ppm) Dni po działaniu*'
1 5 7 14
A 83543 A 63 100 88 90 5
A 83543 A 125 100 88 95 90
A 83543 A 250 100 95 100 100
A 83543 A 500 100 100 100 100
Methomyl 63 100 20 15 0
Methomyl 125 )00 35 40 20
Methomyl 250 100 85 45 40
Methomyl 500 100 90 85 60
Bez 0 0 0 0 0
Bez 0 0 0 0 0
“'Wyniki podano w % śmiertelności
W tabeli 20 zestawiono LC 50, stężenia przy których testowany związek zabija 50% testowanych owadów lub roztoczy, wykazywane przez A 83543 A w porównaniu ze znanym środkiem owadobójczym Methomyl.
Tabela 20 LC 50 dla A 83543*
LC 50 (ppm)
Objekt__
A 83543 Methomyl
CRW 15 6
Mszyca zbozowa >250 5,4
SM 150 71,4
SAW/na liściach 1,3 11.4
CBW/kontaktowo 0,6 14.5
*' dawka wciornastka w glebie wagowo, inne w koncentracji sprejowej
Związki A 83543 są aktywne przeciw moskitowi roznoszącemu żółtą febrę (Aedes aegypti) w postaci larwalnej w standardowej próbie na larwach moskita. Tabele 21 i 22 przedstawiają aktywność składników w tych testach.
161 476
Tabela 21
Aktywność in vitro A 83543 B i A 83543 C wobec larw moskita w pierwszym wcieleniu po wylince
A 83543 Minimalne stężenie inhibitujące
składnik (/ig/ml)
A 0,016 0,0311
B 0,016
C 0,031
Najniższe stężenie, które wykazywało 100% skuteczności po 24 godz Testy w dwóch seriach
Tabela 22
Aktywność związków A 83543 wobec larw moskita w czwartym wcieUniu po wyhnceal
Składnik % zniszczenia”1
A 60,701
B 60
C 60
D 30
E 80
F 0
G 0
” po 24 h przy stosowaniu dawlti 0 312 ppm 61 wynik z dwóch testów
Doświadczenia połowę.
A 83543 A badano w doświadczeniach polowych. W doświadczeniach tych A 83543 A wykazywał aktywność przeciw szkodnikom kapusty, jak bielinkowi rzepnikowi i przeciw mieszaninie miernicy sojowej (Soybean loopers) 75% (fali armawerm) Leucania unipuncta, 25% na uprawach soi.
Kompozycje owadobójcze.
Związki stanowiące składnik czynny środka według wynalazku stosuje się w postaci kompozycji. Kompozycje składają się z owadobójczego i roztoczobójczo działającej ilości związku A 83543 i fitologicznie dopuszczalnego neutralnego nośnika. Aktywny składnik, tj. związek A 83543, może być obecny jako 1) pojedynczy składnik związku A 83543, 2) mieszanina dwóch lub więcej składników, 3) oddzielonej mieszaniny A 83543, lub 4) A 83543 razem z wysuszoną częścią środowiska fermentacyjnego, w którym go wytworzono, tj. surowej, wysuszonej brzeczki.
Kompozycje są albo koncentratami, które dysperguje się w wodzie przed zastosowaniem, albo mają postać pylistą lub granulowaną, które to formy stosuje się bezpośrednio.
Kompozycje wytwarza się zgodnie ze sposobami w postaciach stosowanych konwencjonalnie przy wytwarzaniu środków agrochemicznych, przy czym są one nowe, ponieważ zawierają jeden lub więcej nowych związków A 83543.
Dyspersje, w których stosuje się surowe związki lub wysuszony produkt fermentacji stosuje się przeważnie jako zawiesiny w wodzie lub jako emulsje powstałe z koncentratów związków lub surowego produktu fermentacji. Takie rozpuszczalne w wodzie, zawieszalne w wodzie lub mogące utworzyć emulsje formy, mogą być zarówno ciałami stałymi (zwykle znanymi jako proszek zwilżalny) albo cieczami (zwykle znanymi jako koncentraty, mogące utworzyć emulsję lub wodne zawiesiny). Proszki zwilżalne, z których można otrzymać granulki do dyspergowania w wodzie, są dokładną mieszaniną związku czynnego, neutralnego nośnika i środków powierzchniowo czynnych Stężenie związku czynnego wynosi zwykle od 1%, korzystnie 10%, do około 90% wagowo Neutralny nośnik stanowi zwykle jeden spośród różnych rodzajów glinek attapulgitowych, montmoryllonitowych, albo ziemia okrzemkowa lub oczyszczone krzemiany.
Efektywnymi środkami powierzchniowo czynnymi, stosowanymi w ilości 0,5% do około 10% w stosunku do proszku zwilżalnego, są sulfonowane ligniny, skondensowane naftalenosulfoniany,
161 476 naftalenosulfomany, alkilobenzosulfoniany, siarczany alkilowe, oraz niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak addukty tlenku etylenu z alkilofenolami.
Koncentraty do emulgowania zawierają odpowiednio stężenie związku, takie jak od około 50 do około 500 g na litr cieczy, co jest równoważne ze stężeniem od około 10% do około 50%, rozpuszczonego w neutralnym nośniku, którym jest albo mieszający się z wodą rozpuszczalnik, lub mieszanina nie mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika i emulgatorów.
Przydatne jako rozpuszczalniki organiczne są związki aromatyczne, szczególnie ksyleny, frakcje ropy naftowej, szczególnie wysoko wrzące naftalenowe i olefinowe frakcje ropy naftowej, jak ciężka aromatyzowana benzyna. Mogą być również stosowane inne rozpuszczalniki organiczne, jak rozpuszczalniki terpenowe, obejmujące pochodne kalafonii, ketony alifatyczne, jak cykloheksanon i złożone alkohole, jak 2-etoksyetanol.
Stosowanymi emulgatorami do koncentratów emulsyjnych są konwencjonalne niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak to wymieniono wyżej.
Wodne zawiesiny to zawiesiny nierozpuszczalnych związków stanowiących składnik czynny środka według wynalazku, zdyspergowane w wodnym nośniku w stężeniach od około 5% do około 50% wagowo. Zawiesiny wytwarza się przez drobne zmielenie związku i szybkie energiczne mieszanie z zaróbką składającą się z wody i środków powierzchniowo czynnych, wybranych spośród tych samych rodzajów, jak to omówiono wyżej. Naturalne składniki, jak sole nieorganiczne i syntetyczne lub naturalne żywice, mogą być również dodawane aby zwiększyć gęstość i lepkość zarobki wodnej.
Często najlepiej jest mleć i mieszać związki jednocześnie przez wytworzenie wodnej mieszaniny i jej homogenizację w takim urządzeniu, jak młyn kulowy lub homogenizator typu tłokowego.
Związki mogą być również stosowane jako kompozycje granulowane, szczególnie użyteczne do stosowania na glebę. Kompozycje granulowane zwykle zawierają od około 0,5% do około 10% wagowo związku, zdyspergowanego w naturalnym nośniku, który całkowicie lub częściowo stanowi glinę lub inną podobną tanią substancję. Kompozycje takie wytwarza się zazwyczaj przez rozpuszczenie związku w odpowiednim rozpuszczalniku i naniesienie go na granulowany nośnik, który został uprzednio uformowany w cząsteczki o odpowiedniej wielkości, w zakresie od około 0,5 do 3 mm. Kompozycje takie mogą być również formowane przez wytworzenie ciasta lub pasty nośnika i związku, a następnie pokruszenie i wysuszenie, aby otrzymać pożądany rozmiar granulek.
Pył, zawierający związki wytwarza się w sposób prosty, przez dokładne zmieszanie związku w sproszkowanej postaci z odpowiednim nośnikiem stosowanym w rolnictwie, jak glinka kaolinowa, zmielone skały wulkaniczne i podobne. Proszki te mogą zawierać od około 1% do około 10% związku.
Jest także możliwe stosowanie związku w formie roztworu w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, jak nieszkodliwe oleje naftowe, na przykład, oleje sprejowe, które są szeroko stosowane w chemii rolniczej.
Środki owado- i roztoczobójcze stosuje się zwykle w postaci dyspersji aktywnego składnika w ciekłym nośniku. Konwencjonalnie podaje się dawki jakie się stosuje określając stężenie aktywnego składnika w nośniku. Najczęściej stosowanym nośnikiem jest woda.
Środek według wynalazku można stosować również w postaci kompozycji aerozolowych. W takich kompozycjach związek aktywny jest rozpuszczalny lub zdyspergowany, w naturalnym nośniku, który stanowi mieszanina wytwarzających ciśnienie środków nośnych. Kompozycja aerozolowa znajduje się w pojemniku, z którego mieszanina wydobywa się przez zawór atomizujący Propelentem może być mieszanina niskowrzących chlorowcowęgli, które mogą być zmieszane z rozpuszczalnikami organicznymi, lub zawiesina wodna wysycona pod ciśnieniem neutralnym gazem lub gazowymi węglowodorami.
Aktualna ilość związku do zastosowania w miejscu występowania owadów i roztoczy nie jest ogianiczona i może być określona przez fachowców uwzględniając podane przykłady. Zazwyczaj uważa się, ze stężenie od 10 ppm do 5000 ppm związku są wystarczające do uzyskania dobrych wyników. W przypadku wielu związków wystarcza stężenie 100 do 1000 ppm. Dla upraw takich, jak soja i bawełna, dawką skuteczną związków jest dawka około 0,01 do 1 kg/ha, stosowana przeważnie w postaci oprysku w ilości 50-500 ί/ha. Miejscem stosowania związku może być każde
161 476 miejsce opanowane przez owady lub roztocza, na przykład zbiory roślin, drzewa owocowe i orzechowe, winorośle i rośliny ozdobne. Z powodu unikalnej zdolności jajeczek roztoczy, wykazujących odporność na działanie toksyczne, mogą być pożądane powtórzenia zastosowania, aby zwalczać nowe wylęgłe larwy, jak to jest w zwyczaju przy stosowaniu znanych środków owadobójczych.
Czynność przeciw ektopasożytom.
Związki A 83543 są także czynne przeciw wielu owadom rzędu Diptera. W tabelach 23 i 24 podano wyniki badań in vitro związków A 83543 A i A 83543 D.
Tabela 23
Badania aktywności in vitro A 83543 A wobec larw czarnej muchy plujki
Dawka (ppm) Aktywno^11
100 100
50 100
25 100
10 100
5 100
2 100
1 95
0,5 60
0,25 25
11 aktywność = % śmiertelności Tabela 24
Aktywność in vitro A 83543 A wobec dorosłej muchy stajennej
Aktywność
(ppm) w ciągu 24 h w ciągu 48 łi”
100 100 100
50 100 100
25 100 100
10 100 90
5 80 100
2 70 90
1 10 60
0,5 0 10
aktywno^ =% śmiertelności Tabela 25 Aktywność in vitro A 83543 A i A 83543 D1 2
ppm A 83543 A A 83543 D
ASF LBF ASF LBF
24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
10 80 100 100 100 50 100 100 100
5 50 100 100 100 20 90 90 100
2,5 30 100 100 100 20 100 90 100
1,25 20 100 100 100 10 90 80 90
0,625 0 70 60 90 0 60 50 75
0,312 0 50 25 50 0 0 25 25
Procentowa śmiertelność owadów w ciągu 24 do 48 godz oddziaływania in vitro na próbki surowicy z domieszką chemiczną 2Dorosłe muchy siajenne = ASF, larwy muchy plujki = LBF, ppm = części na milion
Środki według wynalazku stosuje się wobec zwierząt gospodarskich sposobem konwencjonalnym.
161 476
Na przykład, ciekłe formy użytkowe mogą być po prostu rozpylane na zwierzęta, zaatakowane pasożytami. Zwierzęta te mogą same się smarować, przy zastosowaniu takich urządzeń, jak drapaczki do grzbietów, które mogą zawierać toksyczny dla ektopasożytów środek w kawałku materiału tekstylnego, z którym kontaktuje się zwierzę. Stosuje się również zbiorniki do dezynfekcyjnego kąpania zwierząt-gospodarza.
Środek według wynalazku ma postać kompozycji ektopasożytobójczych, zawierających dopuszczalny fizjologicznie neutralny nośnik i związek A 83543.
Kompozycje te mogą być wytwarzane ogólnie powszechnie znanymi sposobami, na przykład przez rozpuszczenie związku w jednym z wielu fizjologicznie dopuszczalnych adjuwantów lub rozcieńczalników.
Podane niżej przykłady Ι-ΧΙ opisują bliżej sposoby wytwarzania, wydzielania, oczyszczania i metody oznaczania związków stanowiących substancję czynną środków według wynalazku. Przykłady ΧΙΙΑ do E ilustrują formy użytkowe środka według wynalazku.
Przykład I. Metoda oznaczania A 83543 w HPLC.
Do kontrolowania procesu fermentacji, w którym powstaje A 83543 stosuje się następujące metody analityczne HPLC.
Odwirowuje się próbkę surowej brzeczki, dekantuje się i oddziela sklarowaną ciecz z nad osadu, uzupełnia się do pierwotnej objętości metanolem, miesza i pozostawia na przynajmniej 15 min. Następnie odwirowuje się i sączy sklarowaną ciecz znad osadu przez filtr 0,45μιη.
Można tez surową brzeczkę ekstrahować acetonitrylem (1:4 brzeczka:rozpuszczalnik) lub acetonem. Układ do HPLC: Kolumna 8X100 mm wypełniona żelem krzemionkowym - 4//m sferycznym Cie (Nova C18, Waters). Faza ruchoma: CH2CN(MeOH)H2O /45/45/10 zawierająca 0,05% octanu amonu. Szybkość przepływu: 4 ml/min. Detekcja: UV przy 250 nm. Czasy retencji: A 83543 A - 3,6 - 3,7 min. A 83543 D - 4,4 - 4,5 min.
Przykład II. Wytwarzanie A 83543 w hodowli A 83543.1.
A. Fermentacja w kolbach na trzęsawiskach.
Hodowlę Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 w postaci liofilizowanej peletki, albo zawiesiny, przechowywanej w ciekłym azocie stosuje się do szczepienia pożywki wzrostowej o układzie A lub B (pożywka B preferowana jest do produkcji na dużą skalę):
Pożywka wzrostowa A
Składnik Ilość (%)
Bulion sojowy z tryptykazą* 3,0 ekstrakt z drożdży 0,3
MgSO4-7H2O 0,2
Glikoza 0,5
Maltoza 0,4 woda dejonizowana q.s. do 1 litra bez ustawania pH ‘'Baltimore Biological Laboratories Pożywka wzrostowa B
Składnik Ilość (%)
Kazeina hydrolizowana+enzymatycznie 3,0
Ekstrakt z drożdży 0,3
MgSO„ · 7H2O 0,2
Glikoza 1,0
Woda dejonizowana q.s. do 1 litra pH 6,2, korekcja do 6,5 wodorotlenkiem sodu +NZ Amino A, Sheffield Products. P. O. Box 638 Norwich, NY 13815
Skosy lub płytki przygotowuje się przez dodanie do pożywki wzrostowej A lub B 2,5% agaru.
Zaszczepione skosy poddaje się inkubacji w 30° przez 10 do 14 dni. Dojrzałą kulturę na skosach
161 476 drapie się sterylnym narzędziem aby uwolnić spory i poruszyć i zmacerować zbitą grzybnię. Około jednej czwartej uwolnionych zarodników i kultury wzrostowej otrzymanej w ten sposób używa się do szczepienia 50 ml pierwszego etapu posiewanej pożywki wzrostowej.
Szczepienie pierwszego stadium pożywki wzrostowej może być również dokonane przy użyciu ampułki z ciekłym azotem. Do przechowywania kultury w ciekłym azocie używa się równych ilości kultury wzrostowej (48-72 godz. inkubacji, 30°) i pożywki aby powstała zawiesina. Pożywka ta zawiera laktozę (100 mg), glicerynę (200 ml) i wodę dejonizowaną (q. s. do 1 litra).
Ampułki z ciekłym azotem używa się do 100 ml pożywki wzrostowej w kolbach Erlenmeyera o poj. 500 ml (lub 50 ml pożywki wzrostowej w kolbach o poj. 250 ml). Kultury poddaje się inkubacji w 30° przez 48 godzin na trzęsawce poruszającej się w kole o średnicy 5,08 cm (dwa cale) i 250obr/min. Inkubowaną kulturę (inokulum 5% v/v) używa się do szczepienia 100 ml pożywki stosowanej w produkcji o następującym składzie:
Środowisko produkujące.
Składnik: Ilość (%)
Glikoza 4
Proteiny rośhnne, częściowo hydrolizowane enzymatycznie* 1,5-3
Mąka z nasion bawełny** 1,0
CaCO3 (ofozynnik: lub czystość techn ) 0,3
Olej sojowy 1,0
Woda wodociągowa q.s. do 1 litra (Przy presterylizacji pH ustawia się na 7,0 wodorotlenkiem sodu) “Sheftone H, Sheffield Products *xProfilo, Traders Protein, P O Box 8407, Memhis, TN 38108
Inokulowana pożywka stosowana w produkcji umieszczona jest w kolbach Erlenmeyera w temperaturze 28-30°C przez 6 do 8 dni na trzęsawce orbitującej w kole o średnicy 5,08 cm i 250 obr/min.
B. Fermentacja w bioreaktorze z mieszaniem.
Aby otrzymać większą objętość szczepionki, 10 ml pożywki z pierwszego stadium, przygotowanego w sposób opisany w części A, używa się do szczepienia 400 ml pożywki wzrostowej drugiego stadium, pożywki o identycznym składzie, jak pożywka wzrostowa pierwszego stadium. Pożywkę drugiego stadium inkubuje się w 21 kolbach Erlenmeyera z szeroką szyją przez 48 godz. w temp. 30°C na trzęsawce poruszającej się po kole o średnicy 5,08 cm i o 250 obr/min.
Inkubowaną pożywkę wzrostową drugiego stadium (21 przygotowaną w opisany sposób, stosuje się do szczepienia 80 do 115 litrów sterylnej pożywki produkcyjnej, przygotowanej według przepisu podanego w części A. Dodaje się ponadto jeśli potrzeba, olej sojowy, aby zmniejszyć pienienie.
Zaszczepiona pożywka produkcyjna fermentuje w bioreaktorze o pojemności 165 litrów z mieszaniem w temperaturze 28°C. Przepływ powietrza i szybkość mieszania w tanku są kontrolowane za pomocą komputera, tak aby utrzymać minimalny poziom rozpuszczonego tlenu, czyli minimum 50% wysycenia powietrzem.
Przykład III. Wydzielanie A 83543 A, B, C i D.
Brzeczkę fermentacyjną (225 litrów), przygotowaną jak w przykładzie II, sączy się stosując pomocniczy materiał filtracyjny (1% Hyflo) i oddzieloną biomasę przemywa wodą (501). Biomasę miesza się z metanolem (ok. 1001 przez około 1 godz. i sączy. Przesącz metanolowy zatęza się do objętości około 11. Koncentrat ten ekstrahuje się 3 razy eterem dwuetylowym, (po 11). Połączone ekstrakty eterowe zatęża się do objętości około 200 ml. Próbkę koncentratu (8 ml) poddaje się chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym (RP-8 Lobar, rozmiar B, E. M Science, a Division of E. M Industries, Inc.) Czynność tę powtarza się przez 12 szarzy (cykli). Zestaw przyrządów i sposób wykonania chromatografii preparat ywnej według sposobu „Atoprep opisany jest poniżej.
Kompletny system „Autoprep HPLC składa się z trzech pomp Rainin Rabbitt ΗΡΧ, jednego modułu ciśnieniowego, jednego kolektora frakcji HPLC Gilson Model 20 IB, jednego detektora absorbancji typu ISCO-V4 i jednego komputera Apple Macintosh Plus. Kompletny system ten zmontowany zgodnie z instrukcjami podanymi w Dybamax HPLC Method Manager manuał firmy Rainin Instrument Company, Inc. System „Autoprep HPLC ma możliwości automatyzacji, co
161 476 pozwala na preparatywne rozdzielenie prowadzone w powtarzających się cyklach i warunkach identycznych z identycznymi wynikami. Zbieranie i łączenie odpowiednich frakcji różnych szarż umożliwia efektywny rozdział chromatograficzny bez potrzeby korzystania z dużej kolumny. Dwie mieszaniny rozpuszczalników (A) i (B) stosuje się w sposób izokratyczny i przy szybkości 8,0ml/min.
Układy rozpuszczalników.
Rozpuszczalnik Ilość (ml)
A B
CH3OH 95 100
CH3CN 95 100
NzO 10 —
Używana mieszanina izokratyczna zawiera 60% rozpuszczalnika E. Czas przebiegu wynosi dla każdego cyklu 28,0 mm. Eluaty z pierwszych 16 minut każdego przebiegu odrzuca się. Następne eluaty zbiera się w 6 frakcjach co 2 minuty (po 16 ml).
Automatycznie połączone frakcje z każdego z 12 cykli stanowią 6 końcowych frakcji (chromatografia cuts). Obecność aktywnych związków A 83543 wykazuje się przez analizowanie każdej frakcji końcowej na czynność przeciw larwom komarów, a także w analitycznej HPLC.
Aktywne frakcje łączy się następnie biorąc pod uwagę aktywność i profil HPLC i poddaje dalszemu oczyszczaniu, używając tego samego zestawu „Autoprep HPLC i układu rozpuszczalników, lecz z zastosowaniem kolumny o wysokiej rozdzielczości (Rainin Dynamax) o wymiarach 21,4 mm X 25 cm, wypełnionej żelem krzemionkowym do chromatografii z odwróconymi fazami 8μιη C-18, co pozwala na rozdzielenie składników A, B, C i D A 83543. Składniki A i D krystalizuje się z CH3OH/H2O. FD-MS A 83543 C pokazano na rysunku fig. 5, a FAB-MS A 83543 B przedstawiono na rysunku na fig. 9.
Przykład IV. Oczyszczanie A 83543 A i D.
Brzeczkę fermentacyjną (101) przygotowuje się jak opisano w przykładzie II części A, z wyjątkiem:
1) 260 ml pożywki produkcyjnej umieszcza się w kolbach o pojemności 1 litra,
2) nie dodaje się oleju sojowego do pożywki produkcyjnej i
3) inkubacja w 30° w ciągu 4-6 dni.
Brzeczkę filtruje się. Przesącz zawierający 4^g A 83543 A/ml 1 nie zawierający wykrywalnych ilości A 83543 B, C lub D/ml, odrzuca się.
Biomasę przemywa się wodą 1 ekstrahuje jedną godzinę metanolem. Ekstrakt metanolowy (71) zawiera 72^g A 83543 A/ml i 7/zg A 83543 D/ml. Ekstrakt metanolowy zatęża się do objętości 51 i dodaje do żywicy HP-20/150ml, Mitsubishi Chemical Industries, LTD, Japan) w wodzie (21). Mieszaninę tę miesza się przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę z żywicą HP-20 umieszcza się w kolumnie szklanej. Początkowy odcinek i eluaty po podaniu mieszaniny metanokwoda (1:1, 11), nie są aktywne. Drugi eluat, po podaniu mieszaniny metanokwoda (7:3,11), zawiera śladowe ilości A 83543 A. Po zastosowaniu metanolu (11), otrzymuje się eluat zawierający A 83543 A i A 83543 D. Eluat metanolowy zatęza się i łączy z dwoma podobnymi frakcjami z innych szarż i odparowuje się do sucha. Pozostałość rozpuszcza się w 75 ml mieszaniny metanokTHF (4:1) i wytrąca się przez wlanie do 10 objętości acetonitrylu. Mieszaninę łączy się, a przesącz zatęża do sucha. Pozostałość rozpuszcza się w metanolu (25 ml) 1 podaje na kolumnę 5,5 X 90 cm, do wypełnienia której użyto LH-20 Sephadex (/Paharmacia LKD Biotechnology Inc , USA/, a następnie zbiera się i analizuje 125 frakcji, każda po 25 ml, stosując procedurę HPLC, opisaną w przykładzie I.
Frakcje zawierające pożądane związki łączy się 1 zatęza. Pozostałość rozpuszcza się w metanolu (10 ml) 1 podaje na kolumnę preparatywną o wymiarach 41,1 mm X 25 cm, wypełnioną żelem kizemionkowym 8μηι C-18 (Rainin-Dynamaa) do chromatografii z odwróconymi fazami. Kolumnę kondycjonuje się mieszaniną metanol.acetonitryl -woda (40:40:20). Po dodaniu próbki, kolumnę lozwija się, stosując 180 min linearną elucję gradientową następujących rozpuszczalników:
161 476
Układ rozpuszczalników.
Rozpuszczalnik Ilość (ml)
A B
CH3OH 37,5 45
CH3CN 37,5 45
HaO 25 10
Elucję gradientową prowadzi się od 100% A do 100% B, zbierając 25 ml frakcje.
Frakcje, zawierające A 83543 A łączy się, zatęża do sucha, rozpuszcza się w t-BuOH (5 ml) i liofilizuje. Otrzymuje się 778 mg czystego A 83543 A. Widma IR A 83543 A w CHCI3 pokazano na rysunku fig. 1. Widmo FD-MS A 83543 A pokazano na rysunku fig. 4, widma FAB-MS A 83543 A na rysunku fig. 8 (dyspersent szybkich atomów ditiotreitol : ditioerytrytol 5:1); a widmo EI-MS A 83543 A pokazano na rysunku fig. 10.
Frakcje zawierające A 83543 D, łączy się z frakcjami zawierającymi związek D z 6 podobnych rozdziałów, zatęża i poddaje chromatografii, jak opisano wyżej, stosując tę samą kolumnę, lecz różne rozpuszczalniki. Kolumnę kondycjonuje się mieszaniną metanol : acetonitryl : woda (40:40:20). Układy rozpuszczalników stosowane do rozwinięcia kolumny w trwającej 180 min. linearnej elucji gradientowej podano niżej.
Układy rozpuszczalników.
Rozpuszczalnik Ilość (ml)
A B
CH3OH 40 95
CH3CN 40 95
H2O 20 10.
Frakcje zawierające A 83543 D łączy się i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w t-BuOH (5 ml) 1 liofilizuje. Otrzymuje się 212 mg A 83543 D. Widma IR A 83543 D w CHCI3 pokazane są na rysunku fig. 2, a widmo FD-MS A 83543 D pokazano na rysunku fig. 6.
Przykład V. Wydzielanie składników E, F, G, H i J A 83543 oraz pseudoaglikonu A.
Brzeczkę fermentacyjną (81) - przygotowaną według przepisów podobnych do tych, które opisano w przykładzie II, poddawano obróbce, metodami opisanymi w przykładzie IV. Frakcje z kolumny, wypełnienie której stanowi Sephadex LH-20, zawierające pożądane związki, łączy się z frakcjami pochodzącymi z podobnych fermentacji. Ponieważ składniki E, F, G, H i J oraz pseudoaglikon A powstają w bardzo małych ilościach, potrzeba licznych szarż fermentacji aby otrzymać ilości, wystarczające do dalszego oczyszczania. Zbiór wielu frakcji, otrzymanych w ten sposób i zawierający około 1,6 grama substancji stałej, kieruje się na kolumnę IIPLC (Rainin Dynamax), wypełnionej żelem krzemionkowym 8/um C-18 do chromatografii z odwróconymi fazami (ODS), jak to opisano w przykładzie IV. Kolumnę kondycjonuje się mieszaniną CH3OH:CH3Cn:H2O (75:75:50), a elucja gradientowa przebiega od 1θ0% rozpuszczalnika A do 50% rozpuszczalnika E, w następujących układach rozpuszczalników:
Układy rozpuszczalników.
Rozpuszczalnik Ilość (ml)
A B
CH3OH 75 75
CH3CN 75 95
HaO 50 10
Zbiera się frakcje po 25 ml. Łączy się następujące frakcje:
161 476
Zbiór frakcji Frakcje
1 31- 44
2 45- 63
3 64- 69
4 70- 80
5 81-130
6 131-160
Część frakcji 5 (100 ml) zatęża się do sucha, pozostałość rozpuszcza w metanolu (1 ml) i podaje na kolumnę HPLC o wymiarach 21,4 mm X 250 mm (Rainin Dynamax), postępując, jak podano w przykładzie III.
Kolumnę kondycjonuje się używając układu rozpuszczalników (A) spośród następujących układów rozpuszczalników:
Układy rozpuszczalników.
Rozpuszczalnik Ilość (ml)
A B
CH3OH 50 95
CH3CN 30 95
H2O(lnNH4
Ac, pH 5,0) 40 —
HaO — 10
i rozwija, stosując trwającą 120 min linearną elucję gradientową od 100% rozpuszczalnika (A) do 50% rozpuszczalnika (B), zbierając po 15 ml frakcji przy szybkości 7,5 ml/min. Eluowanie kontynuuje się przy 50% B przez następne 60 min. Łączy się następujące frakcje:
Zbiór frakcji Frakcje Składnik
1 37 F
2 38-48 E
3 52-63 B,G
4 65-70 H, J
Zebrane odpowiednio frakcje łączy się z podobnymi frakcjami z innych szarż chromatograficznych, do których użyto podobnych roztworów. Połączone zbiory frakcji poddaje się dalszemu oczyszczaniu, stosując chromatografię kolumnową, jak to opisano wyżej. Wymywanie z żywic HP-20 przeprowadza się według standardowych technik, następnie zatęża się i liofilizuje, aby otrzymać następujące składniki:
Składnik Ilość (mg) Mol. (wagowo*) IR*X
E 249 717 rys. fig. 13
F 4 717 rys. fig. 14
G 104 731 rys. fig. 15
HJ 87 717 rys. fig. 16
Pseudo A 288 590 rys. fig. 3
przez spektrometrię mas, tabletka KBr
Widma FD-MS i EI-MS A 83543 A pseudoaglikonu pokazano na rysunku fig. 7 i 11, (odpowiednio).
Przykład VI. Otrzymywanie A 83543 z kultury A 83543.3.
A. Fermentacja w kolbach na trzęsawkach.
Postępując według metod opisanych w przykładzie II część A, hoduje się kulturę Saccharopolyspora spinosa NRRL 18537 w kolbach na trzęsawkach lecz stosując pożywkę wzrostową C o składzie'
161 476
Pożywka wzrostowa C
Składnik Ilość
Kazeina hydrolizowana enzymatycznie*’ 30,Og
Ekstrakt drożdżowy 3,0g
MgSO4-7H2O 0,2g
Glikoza 10,Og
Gliceryna 20,0 ml
Woda dejonizowana q.s. 1 litr
pH 6,6 - ustawia się na 7,0 NaOH. Ml - NZ Aminę A
B. Fermentacja w bioreaktorze z mieszaniem.
Ampułki z ciekłym azotem, zawierające kulturę przygotowuje się,jak opisano w przykładzie II, używając metod ogólnych, opisanych w części B. Do szczepienia pożywki wzrostowej pierwszego stadium używa się jednej ampułki (50 ml pożywki C w kolbach o pojemności 21), które inkubuje się przez około 48-72 godziny. Inkubowane kultury pierwszego stadium używa się do szczepienia (10 ml inokulum) kultury drugiego stadium (400 ml pożywki C w kolbach o poj. 21), które inkubuje się przez około 48-72 godziny. Inkubowane kultury drugiego stadium (51 używa się do szczepienia
pożywki stosowanej w produkcji (1151) o składzie:
Pożywka II stosowana w produkcji przemysłowej
Składnik Ilość (g/l)
Glikoza 80
Mleko peptonizowane*’ 20
Mąka z nasion bawełny**’ 20
CaCO3 5
Ester metylowy kwasu olejowego 30ml/l
Woda wodociągowa q.s. 1 litra
spożywcze mleko peptonizowane, Sheffield Products można stosować dodawanie zaczynając od 4 dnia w ilości 5 mg/dzień/ml Proflo.
Przed sterylizacją pH ustawia się na 7,0 używając NaOH. Zaszczepiona pożywka przemysłowa fermentuje w bioreaktorze o pojemności 1651 z mieszaniem w czasie 8-10 dni lub dłużej, w temperaturze 30°. Poziom rozpuszczonego tlenu (DO) reguluje się korzystając z układu skomputeryzowanego, utrzymując poziom DO około 50% wysycenia powietrzem, jak to jest opisane w przykładzie II, sekcja B.
Przykład VII. Otrzymywanie A 83543 z kultury A 83543.5.
A. Fermentacja w kolbach na trzęsawkach.
Ampułki, zawierające kulturę przygotowano według postępowania opisanego w przykładzie II, stosując ogólne metody opisane w części B. Do szczepienia kultury wzrostowej pierwszego stadium używa się jednej ampułki (50 ml pożywki B w kolbach o pojemności 250 ml) i następnie poddaje się inkubacji 48-72 godziny. Inkubowana kultura pierwszego stadium służy do szczepienia kultury drugiego stadium (10 ml inokulum do 400 ml pożywki B w kolbach 21). Inkubuje się drugie stadium 48 godzin. Inkubowana kultura drugiego stadium służy do szczepienia pożywki produkcyjnej (1151) o jednym ze składów:
Pożywka III stosowana w produkcji przemysłowej
Składnik Ilość (%)
Glikoza 80
Proteina roślinna, częściowo*
hydrolizowana enzymatycznie 20
Mąka z nasion bawełny** 10
CaCOe 5
Ester metylowy kwasu olejowego 30ml/l
Woda wodociągowa q.s. 1 litra
ęheftone H Proflo pH przed sterylizacją ustawia się na 7,0 stosując NHąOH.
161 476
Pożywka IV stosowana w produkcji przemysłowej
Składnik Ilość
Glikoza 8
Mąka z nasion bawełny*’ 3
Mleko peptonizowane**’ 2
Namok kukurydziany 1
CaCO3 (techn) 0,5
Ester metylowy kwasu olejowego 3
Woda wodociągowa q.s. 1 litra **FPoflo xxlPeptonizowane mleko spożywcze
Przed sterylizacją pH ustawia się na 7,0 stos. NaOH.
Zaszczepiona pożywka produkcyjna fermentuje w reaktorze o poj. 1651 z mieszaniem w ciągu 8 do 10 dni, lub dłużej, w temperaturze 30°C. Poziom DO reguluje się jak w przykładzie VI.
Przykład VIII. Otrzymywanie A 83543 z kultury A 83543.4.
Stosując metodę opisaną w przykładzie II i w przykładzie VII hoduje się kulturę Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538, lecz stosując pożywkę wzrostową B i pożywkę produkcyjną III.
Przykład IX. Brzeczkę fermentacyjną przygotowuje się jak opisano w przykładzie VIII. A 83543 wydziela się z brzeczki jak następuje:
1. Dodaje się równą objętość acetonu do brzeczki i sączy się używając filtru ceramicznego lub pomocniczego materiału filtracyjnego i prasy filtracyjnej.
2. Ustawia się pH przesączu brzeczki na 10.
3. Dodaje się octanu etylu (1/4 do 1/2 objętości brzeczki).
4. Dekantuje się ekstrakt octanowy oddzielając warstwę wodną; zatęża się ekstrakt octanowy do 1/3 objętości pod zmniejszonym ciśnieniem.
5. Ekstrahuje się zatężony roztwór w octanie etylu wodnym roztworem 0,1 M kwasu winowego (1/2 objętości) i rozdziela się fazy.
6. Odpędza się rozpuszczony w fazie wodnej octan etylu przez desylację pod zmniejszonym ciśnieniem (około 5%). Zatęża się roztwór wodny, stosując odwróconą osmozę.
7. Ustawia się pH zatężonego roztworu wodnego na 10-11 wodorotlenkiem sodu.
8. Oddziela się osad przez odsączenie, suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymuje A 83543.
Przykład X. A 83543 A, pseudoaglikon.
Próbkę związku A 83543 zawierającą w większości składnik A (ca 100 mg) rozpuszcza się w metanolu (50 ml), wodzie (2 ml) i stężonym HC1 (3 ml). Roztwór ten odparowuje się do sucha w 50°C. Pozostałość traktuje się dwukrotnie eterem dwuetylowym (po 200 ml), i odrzuca substancję nierozpuszczoną. Połączone roztwory eterowe zawierające surowy pseudoaglikon odparowuje się do sucha. Pozostałość rozpuszcza się w metanolu (20 ml) i oczyszcza, używając systemu AUTO - PREP - HPLC opisanego w przykładzie III, i otrzymuje się 20 mg czystego pseudoaglikonu A 83543 A.
Przykład XI. Pseudoaglikon A 83543 D otrzymuje się z A 83543 D, stosując postępowanie analogiczne jak opisano w przykładzie X.
Przykład XII. Niżej podane formy są typowymi przykładami kompozycji owadobójczych środka według wynalazku.
A Zawiesina wodna
A 83543 A 12,5% „Tergitol TMN-6“ (niejonowy środek powierzchniowo czynny) 1,0% „Zeosyl 200“ (krzemionka) 1,0% „AF-l00“ (środek przeciw pienieniu oparty na silikonach) 0,2%
Roztwór ksantanu (2%) 10,0% „Makon 10“ (10 molowy środek powierzchniowy zawierający tlenek etylenu i nonylofenol) 9,0%
Woda wodociągowa 66,3%
161 476
B. Koncentrat emulsyjny.
A 83543 D 12,4% „Exxon 200“ (rozpuszczalnik naftalenowy) 83,6% „Toximul H“ (mieszanina środków powierzchniowych niejonowych/jonowych) 2,0% „Toximul D“ (mieszanina środków powierzchniowych niejonowych/jonowych) 2,0%
C. Zawiesina
A 83543 A 30,0%
Sól kwasu naftalenosulfonowego 5,0%
Niejonowy środek powierzchniowo czynny 5,0%
Rozdrobniona krzemionka 1,0%
Woda 59,0%
D. Roztwór do oprysku
A 83543 A 20,0%
Niejonowy środek powierzchniowo czynny 0,0%
Glikol propylenowy 15,0%
Woda 64,2%
E. Zawiesina do oprysku
A 83543 B 10,0%
Niejonowy środek powierzchniowo czynny 1,0%
Lekki olej mineralny 89,0%.
FIG 15
FIG.I2
9.103
712·
63204 920
3538
2147
756
-0 636
- 10 621 -β 765 - 2909 0 947
FIG II
803
8658
O o Cj.HuO., m/z 449 E - C,H,0„ mu 88 F C.HjO,. m/z 88 C » C,M,^3, m/z 189 H-C,H„N0, =C„H„oi mil 383 I - CjH,jNOj β Cj*HjiOj m/z 367
FIG.9
FIG 8
FIG 7
FIG. 6
F1G.5
FIG 4
FIG3
FIG I
lCH3kN
CH
Wzór 2d
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe
1. Środek owadobójczy i roztoczobójczy, zawierający obok składnika czynnego jeden lub kilka fitologicznie dopuszczalnych nośników i/lub rozcieńczalników, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera 0,0005 do 90% wagowo nowego związku A 83943 o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę o wzorze 3, R4 oznacza grupę etylową, R5 i Re każdy oznacza grupę metylową, a podstawniki R, R1 i R3 występują w następującej kombinacji
R R1 R3 wzór 2a Metyl H wzór 2b Metyl H wzór 2c Metyl H wzór 2a Metyl Metyl wzór 2a H H H Metyl H H Metyl Metyl
lub ich fizjologiczne dopuszczalnych soli.
2. Środek owadobójczy i roztoczobójczy, zawierający obok składnika czynnego jeden lub kilka fitologicznie dopuszczalnych nośników i/lub rozcieńczalników, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera 0,0005 do 90% wagowo nowego związku A 83943 o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę o wzorze 3, R1 oznacza grupę metylową, R3 oznacza atom wodoru, a podstawniki R,
R4, R5 i R6 występują w następującej kombinacj R R4 Rs Re wzór 2a Metyl Metyl Metyl wzór 2a Etyl H Metyl wzór 2a Etyl Metyl H H Metyl Metyl Metyl H Etyl H Metyl H Etyl Metyl H
lub ich fitologicznie dopuszczalnych soli.
PL1989282843A 1988-12-19 1989-12-18 Srodek owadobójczy i roztoczobójczy PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL161476B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28659188A 1988-12-19 1988-12-19
US42944189A 1989-10-30 1989-10-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL161476B1 true PL161476B1 (pl) 1993-06-30

Family

ID=26963932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1989282843A PL161476B1 (pl) 1988-12-19 1989-12-18 Srodek owadobójczy i roztoczobójczy PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Country Status (32)

Country Link
US (2) US5496931A (pl)
EP (1) EP0375316B1 (pl)
JP (1) JP2535080B2 (pl)
KR (1) KR0143566B1 (pl)
CN (1) CN1035391C (pl)
AT (1) ATE116325T1 (pl)
AU (1) AU624458B2 (pl)
BG (1) BG60520B1 (pl)
BR (1) BR8906547A (pl)
CA (1) CA2005784C (pl)
CZ (1) CZ285992B6 (pl)
DE (2) DE68920301T2 (pl)
DK (1) DK174489B1 (pl)
DZ (1) DZ1375A1 (pl)
EG (1) EG19191A (pl)
ES (1) ES2065398T3 (pl)
FI (2) FI95601C (pl)
GR (1) GR3015598T3 (pl)
HU (1) HU208998B (pl)
IE (1) IE65919B1 (pl)
IL (1) IL92743A (pl)
IN (1) IN169756B (pl)
MA (1) MA21697A1 (pl)
MY (1) MY111148A (pl)
NL (1) NL350009I2 (pl)
NO (1) NO176914C (pl)
NZ (1) NZ231831A (pl)
OA (1) OA09249A (pl)
PE (1) PE5591A1 (pl)
PL (1) PL161476B1 (pl)
PT (1) PT92607B (pl)
YU (1) YU47099B (pl)

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5362634A (en) * 1989-10-30 1994-11-08 Dowelanco Process for producing A83543 compounds
MA21697A1 (fr) * 1988-12-19 1990-07-01 Dow Agrosciences Llc Composes de macrolides.
US5202242A (en) * 1991-11-08 1993-04-13 Dowelanco A83543 compounds and processes for production thereof
US5227295A (en) * 1991-11-08 1993-07-13 Dowelanco Process for isolating A83543 and its components
US5539089A (en) * 1991-11-08 1996-07-23 Dowelanco A83543 aglycones and pseudoglycones
CN1073483A (zh) * 1991-11-08 1993-06-23 道伊兰科公司 一种发酵杀虫剂化合物及其制备方法
US5591606A (en) * 1992-11-06 1997-01-07 Dowelanco Process for the production of A83543 compounds with Saccharopolyspora spinosa
TR28273A (tr) * 1992-12-09 1996-04-25 Dowelanco Yeni a83543 bilesikleri ve bunlari üretmeye mahsus yöntem.
BR9406587A (pt) * 1993-03-12 1996-01-02 Dowelanco Novos compostos a83543 e processo para a produção dos mesmos
JP4717163B2 (ja) * 1995-06-14 2011-07-06 ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー スピノシン化合物の合成的修飾
US6001981A (en) * 1996-06-13 1999-12-14 Dow Agrosciences Llc Synthetic modification of Spinosyn compounds
GB9624501D0 (en) * 1996-11-26 1997-01-15 Zeneca Ltd Insecticial compositions and method
CA2715847C (en) * 1997-12-23 2014-01-28 Syngenta Participations Ag Use of macrolides in pest control
DE19823396A1 (de) * 1998-05-26 1999-12-02 Bayer Ag Synergistische insektizide Mischungen
DE19823397B4 (de) * 1998-05-26 2011-07-28 Bayer CropScience AG, 40789 Verwendung von Spinosynen zum Einsatz als Bodeninsektizide
CA2337789C (en) * 1998-07-02 2010-10-26 Eli Lilly And Company Formulations for controlling human lice
DE19857967A1 (de) * 1998-12-16 2000-06-21 Bayer Ag Wirkstoffkombinationen
ATE324039T1 (de) 1999-08-12 2006-05-15 Lilly Co Eli Verwendung von spinosad oder einer zusammensetzung enthaltend spinosad
US6927210B1 (en) 1999-08-12 2005-08-09 Eli Lilly And Company Ectoparasiticidal aqueous suspension formulations of spinosyns
WO2001011961A1 (en) * 1999-08-12 2001-02-22 Eli Lilly And Company Control of ectoparasites using spinosyns
IL147827A0 (en) * 1999-08-12 2002-08-14 Lilly Co Eli Ectoparasiticidal aqueous suspension formulations of spinosyns
US6933318B1 (en) 1999-08-12 2005-08-23 Eli Lilly And Company Topical organic ectoparasiticidal formulations
AU6606400A (en) * 1999-08-12 2001-03-13 Eli Lilly And Company Topical treatment for insect pests in companion animals
AU783734B2 (en) 1999-09-13 2005-12-01 Dow Agrosciences Llc Pesticidal macrolides
AUPQ441699A0 (en) 1999-12-02 2000-01-06 Eli Lilly And Company Pour-on formulations
AUPQ634300A0 (en) * 2000-03-20 2000-04-15 Eli Lilly And Company Synergistic formulations
DE10013914A1 (de) 2000-03-21 2001-09-27 Bayer Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
US6682925B1 (en) * 2000-04-13 2004-01-27 Agraquest, Inc. Streptomyces strain with insecticidal activity and method of using as an insecticide
DE10055941A1 (de) * 2000-11-10 2002-05-23 Bayer Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
US6585990B1 (en) 2001-03-05 2003-07-01 Dow Agrosciences, Llc Compositions and devices using a spinosyn compound for control of insects
WO2002077005A1 (en) 2001-03-21 2002-10-03 Dow Agroscoences Llc Pesticidal spinosyn derivatives
TWI275592B (en) * 2001-03-21 2007-03-11 Dow Agrosciences Llc Synthetic derivatives of 21-butenyl and related spinosyns
WO2002079184A1 (de) * 2001-03-29 2002-10-10 Bayer Cropscience Ag Zwischenverbindungen zur herstellung von spinosynen
US6727228B2 (en) 2001-04-25 2004-04-27 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Pediculicidal and ovacidal treatment compositions and methods for killing head lice and their eggs
DE10135550A1 (de) * 2001-07-20 2003-01-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zum Herstellen von neuen Spinosyn-Derivaten
AR036872A1 (es) 2001-08-13 2004-10-13 Du Pont Compuesto de antranilamida, composicion que lo comprende y metodo para controlar una plaga de invertebrados
US20090227452A1 (en) * 2001-09-14 2009-09-10 Birthisel Timothy D Spent fermented grain soil additive
IL160619A0 (en) 2001-09-17 2004-07-25 Lilly Co Eli Pesticidal formulations pesticidal formulations
KR100566847B1 (ko) * 2001-10-08 2006-04-03 일라이 릴리 앤드 캄파니 딱정벌레의 방제 방법
TWI330183B (pl) * 2001-10-22 2010-09-11 Eisai R&D Man Co Ltd
WO2003070908A2 (en) 2002-02-19 2003-08-28 Dow Agrosciences Llc Novel spinosyn-producing polyketide synthases
DE10248257A1 (de) * 2002-10-16 2004-04-29 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen im insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE10320505A1 (de) 2003-05-08 2004-11-25 Bayer Healthcare Ag Mittel zum Bekämpfen von Parasiten an Tieren
DE10333371A1 (de) 2003-07-23 2005-02-10 Bayer Ag Fungizide Wirkstoffkombinationen
JP4881738B2 (ja) * 2003-11-04 2012-02-22 インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー スピノシン及びアゾール系殺虫剤からなる殺外部寄生虫性配合物
DE10353281A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
AU2006249441A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Eli Lilly And Company Improved fish production
EP1849363A1 (en) * 2006-03-09 2007-10-31 Cheminova A/S Synergistic combination of glutamate- and GABA-gated chloride agonist pesticide and at least one of Vitamin E or Niacin
KR101404913B1 (ko) * 2006-05-25 2014-06-09 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 스피노신 훈증제
DE102007045922A1 (de) 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2070416A1 (de) 2007-12-11 2009-06-17 Bayer CropScience AG Verwendung von Wirkstoffkombinationen zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen
EP2127522A1 (de) 2008-05-29 2009-12-02 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
WO2010032135A2 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Kritikou, Christine Spinosyn antifouling compositions, methods of use thereof and articles protected from attachment of biofouling organisms
EP2227951A1 (de) 2009-01-23 2010-09-15 Bayer CropScience AG Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren
TW201041507A (en) * 2009-04-30 2010-12-01 Dow Agrosciences Llc Pesticide compositions exhibiting enhanced activity and methods for preparing same
TW201041510A (en) 2009-04-30 2010-12-01 Dow Agrosciences Llc Pesticide compositions exhibiting enhanced activity
TW201041508A (en) * 2009-04-30 2010-12-01 Dow Agrosciences Llc Pesticide compositions exhibiting enhanced activity
TW201041509A (en) 2009-04-30 2010-12-01 Dow Agrosciences Llc Pesticide compositions exhibiting enhanced activity
CA2764526A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Christine Kritikou The use of spinosyns and spinosyn compositions against diseases caused by protozoans, viral infections and cancer
MX2012004404A (es) * 2009-11-06 2012-05-08 Agraquest Inc Caldo de fermentacion de actinomicetos con actividad insecticida.
EP2528587B1 (en) 2010-01-25 2015-03-18 Eli Lilly and Company Spinosyns for use in internally controlling or treating equine bot larvae
AR081720A1 (es) * 2010-02-19 2012-10-17 Sumitomo Chemical Co Composicion para el control de plagas
EP2382865A1 (de) 2010-04-28 2011-11-02 Bayer CropScience AG Synergistische Wirkstoffkombinationen
WO2011143291A1 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Dow Agrosciences Llc Spnk strains
CN102858870B (zh) 2010-09-29 2014-01-08 东海橡塑工业株式会社 水系软管用橡胶组合物和使用其得到的水系软管
BR112013010846A2 (pt) 2010-11-05 2016-07-12 Lilly Co Eli processos para inibir infestações de insetos
EP2654757A1 (en) 2010-12-22 2013-10-30 Entarco SA The use of spinosyns and spinosyn compositions as local anesthetics and as antiarrhythmic agents
EP2658377A4 (en) 2010-12-29 2014-06-18 Dow Agrosciences Llc METHOD FOR CONTROLLING INSECTS
EP2520653B1 (en) 2011-05-03 2017-03-29 Dow AgroSciences LLC Integration of genes into the chromosome of saccharopolyspora spinosa
JP5760781B2 (ja) 2011-07-13 2015-08-12 住友化学株式会社 有害節足動物防除組成物及び有害節足動物の防除方法
US9631195B2 (en) 2011-12-28 2017-04-25 Dow Agrosciences Llc Identification and characterization of the spinactin biosysnthesis gene cluster from spinosyn producing saccharopolyspora spinosa
HUE043949T2 (hu) 2012-02-06 2019-09-30 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Szisztémásan ható hatóanyagokat tartalmazó, parazitaellenes, szájon át adagolt állatgyógyászati készítmények, eljárások és alkalmazásuk
JO3626B1 (ar) 2012-02-23 2020-08-27 Merial Inc تركيبات موضعية تحتوي على فيبرونيل و بيرميثرين و طرق استخدامها
US9895388B1 (en) * 2012-07-27 2018-02-20 ParaPRO Methods and compositions useful for controlling cutaneous mites
US20150250166A1 (en) 2012-08-23 2015-09-10 Allylix, Inc. Nootkatone as an insecticide and insect repellent
US9839214B2 (en) 2012-12-18 2017-12-12 Evolva, Inc. Solavetivone and 5-epi-beta-vertivone as pest repellants and pesticides
CN106455560B (zh) 2014-04-17 2020-12-22 勃林格殷格翰动物保健美国公司 用于保护动物免受寄生物的丙二腈化合物的用途
US10045979B2 (en) 2014-05-19 2018-08-14 Merial Inc. Anthelmintic compounds
US9776986B2 (en) 2014-06-19 2017-10-03 Merial Inc. Parasiticidal compositions comprising indole derivatives, methods and uses thereof
WO2016022520A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Kyung-An Han Composition and methods for modulation of the octopamine receptor and its homologs
PY1609250A (es) 2015-02-26 2018-03-01 Merial Inc Formulaciones inyectables de acción prolongada que comprenden un agente activo isoxazolina, métodos y usos de las mismas
CN114891070A (zh) 2015-05-20 2022-08-12 勃林格殷格翰动物保健美国公司 驱虫缩酚酸肽化合物
CN106188184B (zh) * 2015-06-01 2021-01-05 中南大学 多杀菌素衍生物在制备抗肿瘤药物和抗kshv病毒药物方面的应用
US12162913B2 (en) 2016-02-01 2024-12-10 Blanco Animal Health GmbH Rhipicephalus nicotinic acetylcholine receptor and pest control acting thereon
WO2018039508A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Merial, Inc. Method for reducing unwanted effects in parasiticidal treatments
MX2019005628A (es) 2016-11-16 2019-12-18 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Compuestos depsipeptidos antihelminticos.
US20200115705A1 (en) 2017-06-06 2020-04-16 Zymergen Inc. A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa
US10494760B2 (en) 2017-12-12 2019-12-03 EctoGuard, LLC Methods and formulations for controlling human lice infestations
MX2021000293A (es) 2018-07-09 2021-07-15 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Compuestos heterociclicos antihelminticos.
CN112770742A (zh) 2018-07-27 2021-05-07 阿佩塔生物科学有限公司 用于治疗蠕形螨引起的眼部和面部疾病的多杀菌素制剂
US11773066B2 (en) 2018-11-20 2023-10-03 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Indazolylcyanoethylamino compound, compositions of same, method of making, and methods of using thereof
NZ776819A (en) 2019-01-16 2023-04-28 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Topical compositions comprising a neonicotinoid and a macrocyclic lactone, methods and uses thereof
BR112021018631A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Compostos anti-helmínticos de aza-benzotiofeno e aza-benzofurano
WO2020214901A1 (en) * 2019-04-17 2020-10-22 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Compositions and methods for modulating immunity in plants
WO2021242581A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Anthelmintic heterocyclic compounds
CN113461757B (zh) * 2021-06-25 2023-08-22 湖州师范学院 新型十六元大环内酯的制备方法及用途
CN119930720A (zh) * 2022-12-19 2025-05-06 利民化学有限责任公司 多杀菌素衍生物作为杀虫剂的应用
WO2025062400A1 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Adama Makhteshim Ltd. Photo-protective and thermo-protective agrochemical composition

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2881162A (en) * 1953-11-16 1959-04-07 Abbott Lab Recovery process
US3725385A (en) * 1970-11-02 1973-04-03 Abbott Lab Process for the demethylation of 3-amino macrolides
US4206206A (en) * 1977-03-24 1980-06-03 Kowa Company, Ltd. Antibiotics of the KA-6606 series and pharmaceutical compositions thereof
AU520409B2 (en) * 1977-05-25 1982-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Controlled release composition
US4213966A (en) * 1977-06-02 1980-07-22 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for isolating polyether antibiotics
US4148883A (en) * 1977-08-18 1979-04-10 Pfizer Inc. Antibiotics produced by new species of nocardia
US4224314A (en) * 1979-03-02 1980-09-23 Pfizer Inc. Antibiotics produced by species of Nocardia
JPS5943929B2 (ja) * 1979-08-13 1984-10-25 サッポロビール株式会社 多糖体ｒｂｓ物質，その製法およびそれを有効成分とする抗腫瘍性剤
US4273920A (en) * 1979-09-12 1981-06-16 Eli Lilly And Company Polymerization process and product
NZ194901A (en) * 1979-09-12 1983-07-15 Lilly Co Eli Device for oral delivery of drug to reticulorumen of ruminant
US4251511A (en) * 1979-10-02 1981-02-17 The Upjohn Company Antibiotic and fermentation process of preparing
US4293651A (en) * 1979-10-02 1981-10-06 The Upjohn Company Process for producing antibiotic using saccharopolyspora
US4321329A (en) * 1979-10-02 1982-03-23 The Upjohn Company Saccharopolyspora culture
EP0043197A1 (en) * 1980-07-02 1982-01-06 Beecham Group Plc Beta-Lactam antibiotic, its preparation and use
EP0044477B1 (en) * 1980-07-15 1984-02-08 Kowa Company, Ltd. Process for production of antibiotics, and novel antibiotics produced thereby
US4448970A (en) * 1981-02-19 1984-05-15 The Upjohn Company Nargenicin derivatives
IT1195299B (it) * 1981-11-27 1988-10-12 Pierrel Spa Procedimento chimico di sintesi per la preparazione di antibiotici macrolidici
CH656622A5 (de) * 1981-12-08 1986-07-15 Toyo Jozo Kk Aminoglycosid-antibiotika saccharocine und deren herstellung.
JPS58189114A (ja) * 1982-04-30 1983-11-04 Ss Pharmaceut Co Ltd 抗潰瘍剤
US4508647A (en) * 1982-07-26 1985-04-02 Bristol-Myers Company Antitumor antibiotics BBM-2040A and BBM-2040B
IT1194181B (it) * 1983-03-30 1988-09-14 Erba Farmitalia Procedimento migliorato per la purificazione della tilosina
US4530835A (en) * 1983-07-08 1985-07-23 Warner-Lambert Company CL-1577 Antibiotic compounds and their production
US4560509A (en) * 1983-11-16 1985-12-24 Eli Lilly And Company Antibiotic A39079 factor S-1
JPS625990A (ja) * 1985-06-20 1987-01-12 Sumitomo Chem Co Ltd 抗生物質およびその製造方法
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina
US4831016A (en) * 1986-10-31 1989-05-16 Merck & Co., Inc. Reduced avermectin derivatives
US5003056A (en) * 1987-12-24 1991-03-26 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Antibiotic NK86-0279, process for production of the same and application of the same
US5362634A (en) * 1989-10-30 1994-11-08 Dowelanco Process for producing A83543 compounds
MA21697A1 (fr) * 1988-12-19 1990-07-01 Dow Agrosciences Llc Composes de macrolides.
US5028536A (en) * 1989-03-15 1991-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Antitumor antibiotic BMY-41339
EP0454820A4 (en) * 1989-10-30 1992-03-11 Eli Lilly And Company A83543 recovery process
US5202242A (en) * 1991-11-08 1993-04-13 Dowelanco A83543 compounds and processes for production thereof
CN1073483A (zh) * 1991-11-08 1993-06-23 道伊兰科公司 一种发酵杀虫剂化合物及其制备方法
US5227295A (en) * 1991-11-08 1993-07-13 Dowelanco Process for isolating A83543 and its components

Also Published As

Publication number Publication date
IL92743A (en) 1994-10-21
CZ717089A3 (cs) 1999-08-11
JP2535080B2 (ja) 1996-09-18
FI96224B (fi) 1996-02-15
YU239389A (en) 1991-04-30
AU4689189A (en) 1990-06-21
IN169756B (pl) 1991-12-21
DK642089D0 (da) 1989-12-18
DK642089A (da) 1990-06-20
CZ285992B6 (cs) 1999-12-15
CN1035391C (zh) 1997-07-09
DE68920301T2 (de) 1995-07-06
KR0143566B1 (ko) 1998-07-15
PT92607B (pt) 1995-09-12
FI950946A7 (fi) 1995-03-01
KR900009681A (ko) 1990-07-05
FI95601C (fi) 1996-02-26
DE68920301D1 (de) 1995-02-09
PE5591A1 (es) 1991-02-15
NO895096L (no) 1990-06-20
CA2005784A1 (en) 1990-06-19
FI896053A0 (fi) 1989-12-18
NO176914B (no) 1995-03-13
EG19191A (en) 1994-09-29
NL350009I2 (nl) 2003-08-01
ATE116325T1 (de) 1995-01-15
FI95601B (fi) 1995-11-15
CA2005784C (en) 1999-02-02
HUT52562A (en) 1990-07-28
HU896661D0 (pl) 1990-03-28
NO176914C (no) 1995-06-21
EP0375316B1 (en) 1994-12-28
GR3015598T3 (en) 1995-06-30
IE65919B1 (en) 1995-11-29
BG60520B1 (bg) 1995-07-28
JPH02223589A (ja) 1990-09-05
IE894068L (en) 1990-06-19
FI96224C (fi) 1996-05-27
NZ231831A (en) 1994-10-26
OA09249A (fr) 1992-06-30
MA21697A1 (fr) 1990-07-01
HU208998B (en) 1994-02-28
PT92607A (pt) 1990-06-29
DZ1375A1 (fr) 2004-09-13
ES2065398T3 (es) 1995-02-16
CN1043742A (zh) 1990-07-11
EP0375316A1 (en) 1990-06-27
BG90678A (bg) 1993-12-24
BR8906547A (pt) 1990-09-04
AU624458B2 (en) 1992-06-11
YU47099B (sh) 1994-12-28
NO895096D0 (no) 1989-12-18
US5571901A (en) 1996-11-05
FI950946A0 (fi) 1995-03-01
US5496931A (en) 1996-03-05
IL92743A0 (en) 1990-09-17
DK174489B1 (da) 2003-04-14
MY111148A (en) 1999-09-30
DE122007000053I2 (de) 2009-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL161476B1 (pl) Srodek owadobójczy i roztoczobójczy PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
US5362634A (en) Process for producing A83543 compounds
EP0688332B1 (en) New a83543 compounds and process for production thereof
US5202242A (en) A83543 compounds and processes for production thereof
US5631155A (en) Saccharopolyspora spinosa strain
CA2099569C (en) New a83543 compounds and process for production thereof
MXPA94003509A (en) Procedure for the production of demaccured compounds, product obtained and compositioninsecticide or acaric
NO143030B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av polyeter-antibiotikumblandingen a-28086 eller dens bestanddeler faktor a, faktor b og faktor d
RO106065B1 (ro) Compusi macrolidici cu activitate insecticida si miticida si procedeu de preparare a lor