BG60520B1 - Макролидни съединения - Google Patents

Abstract

Макролидните съединения могат да се използват в химическата и агрохимическата промишленост и селското стопанство. Те имат инсектицидна и акарицидна активност спрямо различни насекоми, кърлежи, новоизлюпени ларви и различни вредители по културните растения. Използват се също за предпазване на селскостопански и домашни животни и птици от ектопаразити. Новият ферментационен продукт, обозначен като а83543, се състои от 9 отделни съставки. Изобретението се отнася и до метод за получаването му, койтосе състои в култивиране на щам-микроорганизъм в хранителна среда.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до нова група макролицни съединения, които се проявяват като инсектициди и акарициди, по точно до ферментационен продукт и негови съставки и метод за получаването им, до биологически пречистена култура от микроорганизми, както и до инсектициди и и акариццдни състави на тяхна база и използва® то им и намира приложение в химическата и агрохимическа промишлености и селското стопанство.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е синтезирането на макролцдни антибиотици /1/ и метинолиди /2/.

Описани са /3, 4/ антибиотици и методи за тяхното получаване на базата на изходен щам-микроорганизъм saccharopoiyspora hirsute . Тези антибиотици са активни срещу стафилококови, стрептококови и другии близки до тях бактерии и се използват за леч ение на туберкулоза при животни, а така също за дезинфекция на зъболекарско и медицинско оборудване, дрехи, помещения и обкръжаващата ги среда, но не е известно използването им срещу инсектициди и акарициди.

Известни са антипаразитни агенти и метод за тяхното получаване /5/, но те са авермотинови и милбемицинови производни и се получават чрез фермрртетйонен метод, използващ щам-микроорганизъм Streptomyces avertilis .

Тези съединения се използват за лечеяие на стронгилоидоза / вид диарии/ и трихинела.

Познати са различни начини за прилагане на лекарствени форми за обезпаратизяване.

Известно е /б, 7/ използването на хапчета оъс забавено действие, при които съединението е капсулирано в полимерна матрица.

I

Техническа същност на изобретението

Проблем при използването на инсектицидите и акарицедите е бързо развиващата се устойчивост на третираните организми към тях.

Известно е, че най-малко четиржтотин вица са устойчиви на едж или повече инсектициди. Добре позната е развитата устойчивост към инсектициди като ДДТ, карбамати и органофосфати. Тази устойчивост се развива и към някои от по-новите питроидни /пиретриноподобни/ инсектициди и акариццци.

£ Контролът върху ектопаразитите като бълхи, кърлежи, хапещи мухи и др. такива се смята за един от основните проблеми на животновъдството.

С настоящото изобретение се разкриват вещества, които могат да се прилагат при животните, особено орално и които могат да контролират ектопаразитите чрез отравяне на паразита, когато той поглъща кръвта на третираното животно.

Това изобретение се отнася до ферментационен продукт, обозначен като А 83 543*, който се състои от отделни съставки А 83 543 А,..

с

- 2 А83543В, А83543С. А83543В , А83543Е, А83543Р, А83543С, А83543Н и A83543J . А83543 и отделните съставки А83543 са полезни при контрола на насекомите, особено на видовете LepldapteK такива като Spodagtera eridaaia , и видовете Dljrtera , такива като calliphara vlcciaa , Stamoo^f calcitrant и Cnliseta innrnata »Ч₽И условие, чв ПОД·* ходящц инсектицидни състави и методи за съкращаване популацията от насекоми или кърлежи, използват съединенията А83543..

Съединенията А83543 съгласно това изобретение са съединения с формула 1 :

кздето R е Н или група, избрана от (CH3)₂N

(а)

nh₂

(С)

- 3 B¹, R³, ϊ?

са водород, или метил, а

е метил или етил;

или сол с киселинна добавка от съединенията, в които R не е водород.

Предпочитаните съединения съгласно изобретението, от гледна точка на лекотата при приготовление, са съединенията, в които R _г , В³, R⁴ „ и В? се появяват като една от следните комбинации :

R	R2	вз	R4	r5	-
(а)	Ие 2.	н	Et L.	Me	Me
(»	Ме	н	Et	Me	Me
(е)	Ме	н	Et	Me	Me
(аХ	Ме	Ие	Et	Me	Me
(аХ	Ме	Н	Me	Me	Me
(а)	И	Е	Et	Me	Me
(<О	Ме	И	Et	Me	Me
(а).	Ме	Е	Et	E	Me
(а)	Ме	Е	Et	Me	E
* .	Ме	И	Et	Me	Me
н	Ие	Ме	Et	Me	Me
н	Ме	И	Me	Me	Me
н	И	Е	Et	Me	Me
9	Ме	Е	St	H	Me
	Ме	Н	Et	Me	H

11. етил, матйЗГ или сол с киселинна добавка от съединенията, в които К не е водород. Беше показано, че аминозахарта в А83543А & β - в-форосамин_г а неутралната захар в А83543А е ςΛ-2,3„4 - три-О-метилрамноза. Характеризирани са девет съставки на А83543* Тези съставки са съединенията с формула 1, в която R е различно от Н. Те имат следните структури :

Companeiit 1.	R	Е1	R3	R4	R5	R6
А	(а)	Ме 2·	Н	Et 3·	Me	Me
В	(ъ)	Ме	Н	Et	Me	Me
С	(с)	Ме	Н	Et	Me	Me
В	(а)	Ме	Ме	Et	Me	Me
Е	(а)	Ме	Н	Me	Me	Me
F	(а),	Н	Н	Et	Me	Me
G	(d)	Ме	Н	Et	Me	Me
Н	(а)	Ме	Н	Et	H	Me
J	(а)	Ме	Н	Et	Me	H

Ο 1. съставка, 2. метил„ 3. етил

Аминозахарта може да бъде отцепена от съставките А83543 за да образува псевдоагликони /съединения с формула 1, при които R = Н/. Съставките А,_? В, С и С имат общ псевдоагликон /псевдоагликон А83543А или псевдр-А/. В качеството на съставка на А83543, произвеждана първично, псевдоагликонът А83543А беие открит по-късно. Всяка ат съставките В , Е, Р, Н и J има един единствен псевдоагликон. Псевдоагликоните А83543 притежават следните структури :

Псевдоагликон	R1	r’	B4	R5	R«
A83543A	Me	H	Et	Me	Me
A83543B	Me	Me	St	Me	Me
A83543E	Me	H	Me	Me	Me
A83543?	H	H	Et	Me	Me
A83543H	Me	H	Et	H	Me
A83543J	Me	H	St	Me	H

Псевдоагликоните са подходящи като междинни продукти, например за съставките А83543.

По-долу са обобщени физичните и спектралните свойства на съставките А83543 и на псевдоагликоните. В даденото по-долу обсъждане се използват следните съкращения:

EI-MS ; електронно-ударна мас-спектрометрия (ЕУМС)

FAB-MS ; мас-спектрометрия с бомбардиране с бързи атоми (МСББА)

FD-MS : мас-спектрометрия с отделяне на полето (МСОП)

НИС ; високопроизводителна течност на хроматография (ВТХ)

IB : инфрачервен (ИЧ) име : ядрено-магнитен резонанс (ЯМР)

UV : ултравиолетов (УВ)

Характеристики на А83543А

Молекулно тегло : 731

Емпирична формула:

МСОП: виж фиг. 4

МСББА (М<-1): Установено: 732*4706; Изчислено: =

732.4687 (виж фиг. 8)

ЕУМС: Установено: 731*4612; Изчислено: 731*4608 (виж фиг* 10) УБ(ЕЪ0Н ) Л_тах ; 243 им (€ 8,920)

ИЧ ( CHDI3 ): (лактон) 1713; (спрегнат кетон) 1657; многократни пикове на С-Н вибрации около 2940 и за С-0 вибрации около 1060 см1 (виж фкг* 1) [V] D^{29 5} ( £ 1.03, CHD1₃ ) [УЗр*^{5 8} +6-⁸° ( £ 1.03, СЖ1₃ )

Таблица I обобщава данните от ЯМР относно и наблюдавани при А83543А (в ацетон- d₆ ) *

- 6 Таблица 1: Данни от ЯМР отнобио и за А83543А в ацетон-^ .

Position Позиция

13С

хна

1	172.02
2	33.83	3.07/2.45
3	48.13	2.94
4	41.65	3.48
5	129.12	5.86
6	129.66	5.89
7	41.46	2.15
е	36.50	1.99/1.34
9	76.31*	4.31
10	37.65	2.36/1.36
11	46.42	0.93
12	49.74	2.87
13	147.78	7.01
14	144.27	--
15	202.46	——
16	47.74	3.30
17	80.41	3.53
18	30.33	1.51
19	21.85	1.78/1.17
20	34.45	1.50
21	76.24*	4.66
22	28.51	1.48
23	8.97	0.81
24	15.71	1.12
1'	96.34	4.81
2’	77.61	3.51
3’	81.87	3.37
4’	82.43	3.00
5'	68.03	3.48
6’	17.64	1.18
2'-ОСН3	56.66*	3.37
3'-ОСН3	58.39*	3.41
4’-ОСН3	60.12	3.45
1	103.45	4.45
2”	31.24	1.92/1.37
3”	18.14	1.84/1.52
4' ’	65.34	2.12
5' '	73.35	3.56
6' '	18.87	1.21
N(CH3)2	40.38	2.22 1

^а От зависимостта %/^С бяха направени няколко измервания.

+ , * Резонанси с еднакъв горен индекс могат да бадат взаимозаменяеми

- 7 Характеристика на а§з§4$в .

молекулно тегло: 717

Емпирична форцула : =4Λ/°ιο

МЗББА : /вж. фиг. 9/

Характеристика на А83543С

Молекулно тегло : 703

Емпирична формула:

МССП: /вж. фиг. 5/

Характеристика на Λ83543Β

Молекулно тегло: 745

Емпирична формула:

УВ /BtOH/ Ятах : 244 нм / £ 9,910/

ИЧ /СНС!^/ : /лактон/ 1708; /сложен/прегнат/ кетон/ 1658;

многократни пикове за вибрации/колебания/ С-Н около 2940 и за вибрации С-0 около 1070 см**^ /вж фиг» 2/

Wi® ' -мг.9“ ( е L.O2, ⁵ * -29.9* ( к 1.02, CHClj)

МСОП: вж фиг. 6.

‘тълпиг^я II обоф^ва данните от ЯМ* относно наблвдавани при А83545В /в ацетон-dg /.

Таблица 11: Данни от ЯМР относно и за A83543D в ацетон-а^

Position Позиция	13С	хна
1	172.68
2	34.38	3.08/2.43
3	49.01	2.90
4	42.83	3.47
5	123.27	5.54
6	137.26
6-СН3	20.81	1.74
7	44.41	2.18
8	35.61	2.01/1.45
9	76.72	4.32
10	38.64	2.37/1.37
11	47.04	1.02
12	50.05	2.78
13	148.47	7.04
14	145.19	—
15	203.16	— —
16	48.47	3.30
17	81.03	3.53
18	30.99	1.49
19	22.51	1.78/1.19
20	35.12	1.49
21	76.84	4.65
22	29.16	1.48
23	9.55	0.81
24	16.32	1.12
1'	97.11	4.85
2'	78.33	3.54
3’	82.58	3.40
4'	83.15	3.03
5'	68.71	3.50
6’	18.26	1.18
2'-ОСН3	57.31*	3.40
3’-осн3	59.02*	3.43
4’-ОСН3	60.71	3.47
1”	104.14	4.47
2”	31.96	1.94/1.39
3	18.83	1.81/1.49
4' ’	66.06	2.12
5' ’	74.12	3.55
6’ '	19.42	1.20
N(CH3)2	40.99	2.21

^а Някои стойности са взети от зависимостта 41 / ^¾.

^т Резонансите могат да бтдат взаимно заменяеми.

- 9 Характеристика на А83543Е

Молекулно тегло : 717

Емпирична форцула: «♦АЗ¹⁰»

МСББА. /М + 1/ : Установено: 718.4526; Изчислено: =

718.4530

УВ/МОН / Лтнх : 244 нм /2 8,600/

ИЧ /ХВт / /вж фиг. 13/

Таблица III обобщава данните от ЯМР относно % и ^С, наблвдавани А83543Е /в ацетон-dg /.

Таблица III: Данни от ЯМР относно и за А83543Е в ацетон-^.

Position Позиция	13С	*на
1	172.46
2	34.95	3.06/2.40
3	48.88	2.95
4	42.11	3.43
5	129.78	5.86
6	130.39	5.90
7	42.11	2.14
8	37.18	1.96/1.39
9	77.06	4.33
10	38.31	2.36/1.36
11	47.18	0.93
12	50.40	2.86
13	148.37	7.06
14	144.84	—
15	203.09	--
16	48.05	3.34
17	81.35	3.55
18	34.98	1.62/1.48
19	22.25	1.77/1.13
20	33.73	1.50
21	72.97	4.68
22	21.61	1.12
23	--	—
24	16.52	1.13
1’	97.11	4.83
2’	78.36	3.55
3’	82.55	3.37
4'	83.13	3.02
5’	68.72	3.50
6'	18.26	1.18

- 10 Таблица III: Данни от ЯМР относно ^Н и 1¾ за А83543Е в аце тон-dg /продължение/

Position Позиция	13С	*на
2'-ОСН3	59.01	3.43
3'-ОСНз	57.30	3.40
4'-ОСН3	60.69	3.46
1’ '	104.24	4.47
2’ '	32.00	1.93/1.39
3' '	18.86	1.82/1.50
4' '	66.06	2.12
5' '	74.13	3.57
6' '	19.42	1.21
N(CH3)2	40.99	2.21

^а Някои от измерванията са взети от зависимостта ^Н / ^¾.

Характеристика на А83543Р

Молекулно тегло : 717

Емпирична формула:

МСББА /М + 1/ : Установено: 718.4534; Изчислено

718.4530

УВ /Е«Ж / Д ивк : 243 аг /8 10,500/ и 282 нм / £ 109/

ИЧ /ХВг / : /вж фиг. 14/

Таблица IV обобщава данните от ЯЬР относно и ^С, наблкдава ни при А83543Р /в ацетон/.

Таблица IV : Данни от ЯМР относно и за А83543Р в ацетон-d^

Position Позиция	13С	1на
1	172.60
2	34.50	3.06/2.42
3	48.82	2.95
4	42.46	3.45
5	129.56	5.87
6	130.39	5.92
7	42.19	2.16
8	37.18	1.97/1.35
9	77.15	4.65
10	38.30	2.33/1.34
11	46.89	0.94
12	50.34	2.84
13	148.86	7.03
14	145.73	--
15	198.68	—
16	45.49	3.22/2.50
17	74.17	3.58
18	30.74	1.52
19	22.41	1.70/1.17
20	34.45	1.51
21	77.09	4.32
22	29.05	1.48
23	9.56	0.81
1’	97.19	4.83
2'	78.38	3.53
3'	82.58	3.38
4’	83.15	3.00
5'	68.74	3.48
6’	18.25	1.18
2'-0СН3	59.02	3.43
3'-ОСНз	57.31	3.40
4'-ОСН3	60.69	3.47
1	100.19	4.53
2”	32.41	1.80/1.38
3”	18.86	1.83/1.53
4’ ’	66.16	2.13
5	74.01	4.01
6	19.46	1.22
N(CH3)2	41.01	2.22

някои измервания са взета от зависимостта ^ХН /

Характеристика на А835436

Молекулно тегло: 731

Емпирична формула:

МСББА /М + 1/: Установено: 732.4661; Изчислено = 732.4687

А835436

- 12 ·

УВ /е«® /Яписх : 243 нм /£ 8,970/

ИЧ /квг /- /вж фиг. 15/

Таблица V обобщава данните от ЯМР относно и ^С, набладавани

Таблица V. Данни от ЯМР относно % и за А835436 в ацетон

Position

Позиция

13_С ^ХН

2

11 12

21 22

1' 2' 3’ 4’ 5' 6'

172.59		--
34.67		3.04/2.46
48.72		2.94
42.25		3.50
129.85		5.84
130.26		5.89
42.02		2.14
37.12		1.95/1.34
76.99		4.32
38.28		2.36/1.36
47.23		0.91
50.43		2.87
148.28		7.04
144.61		--
203.20		--
47.94		3.30
81.73		3.57
35.20		1.55
21.68		1.64/1.16
31.41		1.64/1.36
76.47		4.64
28.84		1.48
9.61		0.80
15.29		1.18
96.98		4.81
78.23		3.52
82.46		3.37
83.05		2.29
68.64		3.49
17.18		1.12

- 13 Таблица V : Данни от ЯМР относно и ^С за A83543G в ацетон-^ /продължение/

Position ¹³с ¹н^а

Позиция______________________________________

2’-ОСН3	58.97	3.42
3’-ОСН3	57.25	3.39
4'-ОСН3	60.70	3.46
1’ ’	99.51	4.80
2 ’ ’	29.62	1.87/1.48
3’ ·	19.31	1.73
4' '	62.13	2.29
5' '	69.93	4.20
6' '	18.22	1.17
N(CH3)2	43.47	2.24

Някои измервания са взети от зависимостта / ^¾.

Характеристика на А83543Н

Молекулно тегло : 717

Емпирична формула:

УВ Лнон /Лих : 243 нм /£. 10,100/*

ИЧ / Иж/ / вж фиг. 16* определено въз основа на смес А83543Н : J /58:42/.

Характеристика на A63543J __

Молекулно тегло : 717

Емпирична формула:

УВ Аюж /Л иях : 243 им / ξ 10,100/*

ИЧ /cacij / : вж фиг. 16* определено въз основа на смес А83543Н : j /58:42/.

А83543Н и J са озделени от А83543 като смес /съотношението : J = 58 : 42/, която може да се отдели чрез аналитична ВТХ както е описано по-долу. Структурите, отделени като А83543Н и J се основават _На изследванията © ЯАР за _и 1¾ на сйвста А83543Н : X в ацетон . Спектрите на ЯМР си приличат и бяха сравнени със спектрите на А83543А. Главните изменения в спектрите на Н и J се фокусират около рамнозната захар. В тази захар съставките Н i J

- 14 имат само две групи ОСН^^ В съставката Н Н-1* се измества около 0,1 S в ЯМР-спектъра на и 3 S в ЯМР-спектъра на /съответно 4,81 и 99,.68/. Тези измествания се дължат на отсъствието на метил при метоксилната група в позиция Z¹. Изместванията в съставката J съответстват на подобно отсъствие на метил при метоксилната група в позиция з/.

Характеристика на псевдоагликона А83543А

Молекулно тегло: 590

Емпирична формула: ΟββΗ^θΟ^

С УВ /МОН /Лиах : 243 НИ /£ 10,300/

ИЧ /CHClj /· /лактон/ 1724; /спрегнат кетон/1652; многократни пикове за вибрациите С-Н около 3017; многократни пикове за вибрациите С-0 около Ц40СИ-¹ /вж фиг. 3/

МСШ: вж фиг. 7

ЕПЕ: вж фиг.* 11

Характеристика на псевдоагликона А83543В

Молекулно тегло: 604

Емпирична формула: 634^53¾

Съставките А83543 могат да бздат отделени една от друга като се използва една от следните аналитични системи ΒΊΧ :

СИСТЕМА I

Колонка: ODS , 3 мкм, 4,5 х 50 мм /фирма IBM/

Разтворител: CB^OHjeHjC® /2:2:1/

Дебит: 1.0 мл/мин

Откриване/установяване/ : УВ при 245 нм

Време на задържане IvmrI

8,50 б,Д5

3.92

11.47

- 15 СИСТЕМА II

Колонка: 4.6 х 100 мм , CDS , /AQ -301, s -5; фирма ЛМС, Inc Mt* freedom, ЮГ/

Разтворители: CH^Qh rCH^CH : 0,05 £ KB^OAc /Н^О/ /А/ 35:35:30 - pH 7.8 /В/ 45:45:10 - рн 6.7

Дебит: 2.0 мл/мин

Продължителност на работа: 35 мин

Откриване: УВ, 250 нм

Градиент: 10 % В др 25 % В за 20 мин; др 50 % В за 30 мин

Съставка

А

А-псевдоагликон

В

С

В

Е ₽

я н

j

СИСТЕМА III

Колонка: 4.6 х 100 мм, CDS ,

Mt* freedom, Ю/

Разтворители: ΟΗθΟΗ:СНАСЯТ:

35:35:30 - pH

Време, на задържане /мин/

22.62

7.27

12,65

10s62

25.47

19.22

16.30

18.92

16.30

17.50 /JLQ -301, S -5, фирма IMC, Inc*

0.05 % ЯН^ОАе /Н₂0/

6.0

Дебит: 2 мл/мин

Продължителност на работа/цикъл/ : .10 мин \

Откриване: УВ, 250 нм

Съставка	Време на задържане /мин/
F	4.32
Н	3.42
	3.42

Съставките на А83543 са неразтворими във вода, но се разтварят в разтворители като метанол, етанол, диметилформамид, диметилсулфо окис,, ацетонитрил, ацетон и т.н.

А83543 и озделните съставки като А83543А, А83543В, А83543С, A83543^D , А83543Е, A83543F, А83543С, А83543Н и A83543J могат да реагират и да образуват различни соли. Всички подобни форми на тези вещества са част от това изобретение. Солите на А83543 са подходящи например за отделяне и пречистване на А83543. Освен това някои соли имат по-добра разтворимост във вода.

Солите на А83543 се получават чрез стандартни методи за пригот вяне на соли. Например,. А83543 може да се неутрализира с подходяща киселина и да образува образува сол с киселинна добавка.

Солите с киселинна добавка са с широка приложимост. Представи телни за тези соли са солите, образувани чрез стандартни реакции както с органични така и с неорганични киселини като например сярна, хлороводородна, фосфорна, оцетна, янтарна, лимонена, млечна, малеинова, фумарова, холева, памова, лигава, глутаминова, камфорова, глутарова, гликолова, фталова, тартарова, мравчена, лауринова, стеаринова, салицилова, метан-сулфонова, бензол-сулфонова, сорбинова, пикринова, бемзоена киселина» канелена киселина и други подобни.

При обсъждане на използваемостта терминът съединение А83543” означава предимно член от група, състояща от А83543, отделните съставки А83543А, А83543В,. А83543С, А88543> , А83543Е, A83543F, А83543С, А83543Н и A83543J и техните соли с киселинни добавки.

Ферментационният продукт А83543 се произвежда чрез култивиране

- 17 на щам на новия микроорганизъм Saccharopolyspora spinasa, селекциониран от IRRL· 18395, ВНЖЬ 18537, 5RHL 18538 и КНВЬ 18539 или от техен цутант, произвеждащ А83543 при аеробни условия в дълбока хранителна среда от подходящи култури до получаването на извлекаемо количество А83543. Както е добре известно на специалистите по ферментационните процеси, съотношението на съставките в А83543 ще се изменя в зависимост от условията на ферментация, използвани за неговото производство. Като цяло А83543 съдържа около 85-90 % А83543А, около 10-15 % А83543® и малки количества от А83543В, С, Е, ₽, 6, Н и j и псевдоагликон А83543А. Отделните съставки като А83543А, А83543В* А83543С, А83543В ₉ А83543Е,. А83543Р, А835436, А83543Н и A83543J и псевдоагликона А83543А могат да се отделят и изолират както е описано по^долу.

Изобретението се отнася до метод за получаване на съединение А83543, който обуваща култивирането на щам Saccharopolyspara врХлова , селекциониран от 1HBI 18395, 1Ш 18357, ПШЬ 18538 или таи, 1853© или техен мутант* произвеждащ А83543 в среда от култури, съдържаща усвояеми източници на въглерод, азот и неорганични соли в условията на аеробна ферментация в дълбока Хранителна среда ДР получаването на извлекаемо количество А83543. След това отделните съставки могат да се изолират чрез известните в тази област медоди.

Това изобретение се отнася също и до биологически пречистена t

култура от микроорганизма Saecharapolyspora врХхюва , селекциониран от ЯВВЬ 18539, там, 18395, НВВХ 18537 или BRBX 18538 или техен мутант, произвеждащ А83543. Тези микроорганизми са полезни, защото произвеждат А83543.

За удобство в обсъждането, дадено по-долу, щамовете имат следните обозначения: А83543.1, А83543.3, А83543.4 и А83543.5. ^лтура- 18 та А83543.1 беше получена чрез химическо му тиране на кулзурата /А83 543/, изолирана от почвена проба, взета от островите Вирджиния. Културите А83543.3, А83543.4 и А83543.5 бяха получени чрез ихимическо му тиране на производни на щултурата А83543.1.

Културите А83543.1, А83543.3, А83543.4 и А83543.5 бяха депозирани и станаха част от колекцията щамови култури на Северния регионален изследователски център в Средния запад, Оздел по селскостопански проучвания, Министерство на селското стопанство на САЩ,гр. Пеория, щат Илинойс / Midwest Area. Northern Regional Research Center,

Agricultural Research Service_r United States Department of Agriculture, ^15 NoMh University Street, Peoria, Illinois, 61604» USA, където културите са на разположение на специалистите под следните картотечни номера:

£ ПО NBKL·

18395

18537

18538

18539 ϋ на- щама

А83543.1

А83543.3

А83543.4

А83543.5

Таксономични изследвания на култура А83543.1 бяха направени от Фредерик В. Мерц от Lilly Research Laboratories . Въз основа на тези изследвания микроорганизмите А83543.1, А83543.3., А83543.4 и А83543.5 се. класифицират като представители на нова разновидност на вида Saecharopolyspora , която се нарича Saccharopdyspora spinasa spw m. . Тази класификация се основава на преки лабораторни сравнения и изследвания на публикувани описания на подобни разновадности.

Използвани методи

Бяха използвани методите, препоръчвани от Международния проект за разработка на стрептомицели / IS2/ за охарактеризирана на вида //Е.Б. Шърлинг и Д.Готлиб Методи за характеризиране на вида Strep- 19 tomycea /, Int* J* Sy st. Bacterio!* , 16:313-340 /1966/J както ^методите за характеризиране на ввда Kocaxdia , препоръчвани от

Р.Е. Горцън, Д.А. Барнет, Д.Е. Хандерхан и С.Х. Панг, Kocerdia coeliaca, locardia autotrophica и щама Kocardia. , Int* J. Sy st* Bacterial*, 24 (1J; 54-63 (1974)*

Бяха използвани центроидни цветни карти ISCC - KBS» стандартен образец. № 2106 /Национално бюро за стандарти, 1958, Министерство на търговията на САЩ/ за обозначаване цветовите наименования на об ратната страна и на въздушните хифи.

Морфологията беше изследвана с помощта на оптичен микроскоп и сканиращ електронен микроскоп.

Изомерът на диаминпимелиновата киселина и въглехидратите в хидролизните продукти на цели клетки бяха установени чрез хрома то графски методи й Бекер и сътрудници £Б. Бекер, М.П. Льошвалие, Р.Е. Горцън и ХЕ. Льошвалие, Бързо разграничаване между B®cardia и Streptamycea чрез хартиена хроматография на хидролизни продукти на цяла клетка, 4ppl* Microbiol* , 12, 421-423,/1964/} и на Льошвалие и Льошвалие £м.П. Льошвалие и А.Е. Льошвалие, Химичния състав като критерий за класифициране на аеробните актиномицели, int* J. Syst. Bacterial* , 20, 435-443 /1970/] ·

Фосфолипидите бяха определени по метода на М.П. Льошвалие и А. Е. Льошвалие £в Д University Laboratory Approach, Diet» & Thayer (eds.), Society far Industrial Microbiology,Special Publfcatioea

M® 6, Arlingtom, TA, USA, pp* 227-233 (1980))J ·

Състава на менахинона беше определен по методиката на Р.М. Кропенщедт [ в Chemical Methods in Bacterial Systematics, M. Goodfellow & D.E.Minnikin. (cds.), p>* 173 · 196 J ^И ^⁰^^{3 /съ} щия източник, стр. 267-285/.

Устойчивостта на антибиотици беше измерена чрез зареждане на дискове за антибиотична чувствителност върху повърхността на блюда

посяти с агар ISP № 2.

Хидролизата на нишестето беше определена чрез тестуване за наличие на скорбяла с йод върху плочи с агар ISP N? 4 /неорганични соли -скорбяла/.

Анализът на мастните киселини беше направен с помощта на система за микробно идентифициране HP 5898А [вж Л. Милер и Т. Бергер Бактериално идентифициране чрез газова хроматография на мастни киселини в цяла клетка, Заявка за патент N§228-41 на фирмата Хюлет-Пакарц, стр. 8/1985/].

Метиловите естери на мастни киселини се получаваха от лиофилизирани цели клетки, отглеждани при едни и същи условия.

Анализа на основните съставки беше двумерен и проведен с компютър. . ^^^да^1нкте \блохове в принципната схема за съставките /показана на Фиг. 12/ дават стандартни отклонения.

Миколовите киселини бяха определени по метода,, предложен от Миникин [Д.Е. Миникин,И.Г. Хьтчинсън и А.Б. Калдикот, Хроматография на тънки слоеве на продукти на метанолиза на бактерии, съдържаща миколова киселина, J» Chromatography , 188, 221-233 /1980/],

Характеристика на културата

Културата А83543.1 нарастваше добре както в сложни така и в определени среди. Културата създаде въздушни мицели във всички използвани среди. Цвета на въздушните спори беше предимно слабо жълтеникаво розов, но в някои от средите беше бял.

Обратната страна беше жълта до жълтокафява. Нямаше разграничима пигментация. В някои от средите беше отделен разтворим кафяв пигмент.

Характеристиките на ^лтурата са обобщени в Таблица П.

ч ф

<Ό

ф

CO

ο Α 2	1 1
	•	•
•	CO	00
04 <Λ	<£> 04	CO 04

	ο αΐ	ο Π1
Ο	ο	ο	Ο	ο	Ο	ο	Ο	φ	Φ
01	ο<	Λ	31	01	ϋ	01	01	ft	ft
3	Ό	Ό	5	3	3	3	3	φ	Φ
Я	Ο	Ο	N	Η	Η	N	н
ο	k=t	*=£	ο	ο	ο	Ο	ο	£	£

i
1	& ο S 3 ο
Η 2	Η Η 33
Μ	» ψ
«	• S
. 04	C0 Φ
σ>	ο κ

σ>

Μ

о □3

& Ό δ	& Ό δ	ο ω	§ § ο	g § ο	3 3 ο	§ 3 ο
CQ	Μ*	Ю	C*
a	S	3	a	Ό ft	β
&	&	&	a	ή	τ4
ο	ο	ο	ο	Λ	ο
Λ	Ρ4	Й4	Й	3	ο
a	a	a	a	5	Д

Ed	Ed	па «
<0		ф	ф	х?
ч д	Сй	Ч А	Ч Я	Т
φ о	щ	Ф о	Ф о	о
Ен ГО	о >S<	Ен ГО	Ен ГО Ч	и
ο о	А А	О О	ο о <4	о
Сб Рч	id S	<а Рч	cdft Ό	co
д1	о |	и I	И 1	о
о	о	о	о	Рч
Ен	Ен	Ен	Ен ·

о	о
Ed					го
Ф	о	о	о	о	Ф
Рч	ad	го	го	Ό	Рч Ф
Ф	ч	ч	ч	ст}
Я		го	го	ч
ь	о	о	о	о	ь

Таблица П: Характеристики на А83543.1^а (продължение)

о	о	о	о	ф	о
Рч	го	го	го	Рч	го
ХЗ	ч	ч	ч	Ф	ч
о	го	го	го	S	го
	о	о	о		о

- 23 Морфологични характеристики

Културата А83543.1 създаде голяма мицелна подложка, която се раздроби при течна ферментация. Когато културата нарастваше върху агарна среда не се забеляза никаква ферментация.

Бели кръгли колонйи с диаметър 8-10 мм с повдигнат център и жълтокафяв цвят на обратната страна бяха наблюдавани когато културата покриваше среда 1 ISP .

Върху по-голяма част от средите се наблюдаваха добре оформени въздушни хифи. Въздушните хифи бяха сегментирани на дълги вериги от спори, подредени дър/формата на куки и отворени халки. Наблюдаваха се също и спирали, но те бяха къси и непълни.

Общата морфология беше Bectus-flexibilis (RA)>

' Въздушните хифи имаха ясно разграничен мехурчест вид с множество празни места във веригата от спори. Тази характеристика показа, че обвивката на спората обхваща веригата от спори. Т&зи обвивка беше покрита с много ясно разграничими пшпчета. Тези шипчета бяха приблизително дълги 1 мкм и бяха заоблени в края.

Формата на спората беше продълговата със среден размер приблизително Ц х 1,5 мкм. Дължината на веригата от спори сздъркаие много повече от 50 спори. Не бяха наблюдавани: зигзагообразно подреждане, -склероции, спорангии или подвижни клетки.

Физиологични характеристики

Културата А83543.1 произвеждаше киселина от следните въглехидрати: адонит, 1)-арабиноза, еритрит, фруктоза, глюкоза, глицерин, манит, маноза, рибоза и трехалоза.

Културата не произвеждаше киселина от: ъ -арабиноза, целобиоза, целулова, декстрин, дулцит,. етанол, галактоза,. гликоген, инозит, инулин, лактоза, малтоза, мелецитоза, мелебиоза, р/ -метил-В-глюкозид, рафиноза, X -рамноза, салицин, сорбит, Ь -сорбоза, захароза, ксилцт или ксилоза.

- 24 Нарастване беше наблюдавано при галактоза, малтоза и мелицитоза, но от тези въглехидрати не беше получена киселина.

Като натриеви соли културата А83543.1 използваше следните органични киселини: ацетат, бутират, цитрат,. формат* лактат, малат, пропионат, пируват, и сукцинат. Културата не използваше бензоат, цукат, оксалат или тартарат.

А83543.1 разлагаше алантоина, калциевия малат, казейна, еластина, хипурата, хипоксантина, тестостерона, 1-тирозина, и карбамида. Културата не беше в състояние да разложи аденина,ес1$улина, гуанина, скорбялата или ксантина.

А83543.1. произвеждаше каталаза, фосфатаза, уреаза и . Културата втечняваше желатина и редуцираше нитрата. Тя не беше устойчива на лизоцима, и не произвеждаше меланоидни пигменти. Тя нито се пей тонизираше нито хидролизираше в латекс без пяна. А83543.1 допускаше количества Had до и включително 11 %. ^глтурата не беше в състояние да оцелее в продължение на 8 часа при 50 °C, но нараствапсе при температури между 15 и 37 °C.

А83543.1 беше устойчива на цефалотин /30 мкг/, пеницилин,С /10 единици/ и рифампин /5 мкг/. Тя беше чувствителна към бацитрацин / bacitracin./ /10 единици/, гентамицин /10 мкг/, линкомицин / feiJL //2 мкг/, неомицин /30 мкг/, олеавдомицин /15 мкг/, стрептомицин /10 мкг/, тетрациклин /30 мкг/, тобрамицин / tabraagrcin.//10 мкг/ и ванкомицин / тапсошусЗж/ /30 мкг/.

Анализ на клетъчните стени

Хидролизираните цели клетки на А83543.1 свдържаха мезо-диаминопимелинова киселина. Диагностичните захари в екстрактите на цели клетки бяха галактоза и арабиноза. Така културата А83543.1 имаше модел на клетъчната стена тип IV и модел на захарта тип А /Льошвалие и Льошвалие, вж по-горе/. Клетките не стдъркат миколови ки селини.

Определянето на фосфолипидите в целите клетки разкри наличието на фосфадитилхолин и кардиолипин. Не беше открит фосфатидилетаноламин. Така кулаурата А83543.1 има фосфолипиден модел тип РШ[ М.П. Льошвалие, А,Е. Льошвалие, А.Е. Стерн, Фосфолипиди в таксономията на актиномицелите, в Actincmycetes, zbl· Bakt. Suppl. 11 , К.П.

Шаал и Г.Пулверер, (eds.), G. Blecher Verlag, Bev York, 1J81J ♦

Основният открит менахинон беше Ж-9 /Н^/. Бяха отбелязани малки количества МК-9 /Ηθ/.

Нанасяне на фаги

Няколко фаги strep tomy се te,Saccharopoly ерата, Amycalatopsis бяха нанесени върху А83543.1. Не се наблюдаваха петна.

Идентичност на А83543.1

Както казахме по-горе културата А83543.1 има модел на клетъчната стена тип IV и модел на захарта на цялата клетка тип А. Следните тринадесет рода имат този модел на клетъчна химична структура: у_вcardia, Bhodacocue, Corynehacterlumi, Caseohacter, Mycobacteriaa, Paenla(Mleropolyspora) , Pseud anocardla, Saccharamoaospora, Saccharoses ly sp ora,Actiaop olyspara.Any colata,Amy c olatapsis , Kihdelsp araagii··» Тези родове се отличават от наличието или отсъствието на миколови киселини от състава на мастните киселини и от видовете на фосфолипидите и менахиноните. Taenia, Psendonocardia и Saecharopcly врата имат химикотаксономични характеристики еднакви с тези на А83543.1, но тези родове се различават от А83543.1 по свойствата на морфологията и културата.

Веда Taenia (Micropolysporal има гладки спори и къси вериги от спори, които се носят както от въздушните така и от субстратните хифи. Неговите въздушни хифи са редки и бели на цвят. Той е топлолюбив и нараства при 60 °C. А83543.1 не притежава тези свойства и се различава от Taenia* въздушните,

Видът PseudonocarcLia има спори както върхуУгака и върху суб- 26 стратните хифи. Той се отличава с акропетално тълкуване и бластоспори. Притежава характерна зигзагообразна морфология на хифите. Хифите бяха описани като съчленени, но не с преградки[вж А. Хенсен и Д.Шафер, ”Коригирано описание на вида Pseudanocardia Henssen и описание на нова разновидност Pseidonocardia spinosa Schafer ”, J. Syat. Bacteriol» , 21:29-34 /1971/] . Той нараства много бавно. Отсъства фрагментация или се наблюдава много рядко. А83543.1 не притежава тези свойства.

Видът Saccharopolyspora се характеризира с обвивка на спорите и ясно разграничим мехурчест на веригата от спори. Тази характеристика е особено подчертана при А83543.1. При вида Saccharopolyspara също се наблюдава фрагментация. Типовата разновидност s» hirsuta беше изолирана от резенки захарна тръстика. Основната 1дглщура,от която беше получена А83543.1, беше изолирана от продукти при пресоването на захарна тръстика. Тъй като А83543.1 има много от свойствата на този вид, то се приема, че това е щам на Saccharopolyspora.

Единствените верни оповестени разновидности на този вид Saccharopoiyspora са S.exythrpea и S. hirsuta. Известни подвидове са

S. hirsuta subsp. taberi и S. hirsuta suBsp. koheusis , Културата A83543.1 се различава от тези щамове или по въздушния иГфбратния /цвета на обратната страна/ цветове или по произвеждането на разтво рими пигменти.

Биохимичното подобие беше оценено чрез съставяне на таблица с коефициенти на подобие, основаващи се на възможно най-голямо количество биохимични измервания. Бяха използвани коефициент на Jsccard. Sj и прост коефициент на сходство S^. [вж В. Курилович, А.Паш киевич, В. Бозницка, В. Вуржатковски и Т. Шулга, Числена таксономия на стрептомицели, Полско медицинско издателство, 1975, стр.37J Наблица VII обобщава тези коефициенти на сходство/подобие/.

- 27 Таблица VII; Коефициенти на подобие за А83543.1 и вида Saccharopolyspara.

Култура	SffllL	si
A83543U	100	100
S. hirsuta subBp. taherl	68	57
S. hirsute subsp. kobensis	67	60
S. erythtaea	63	54
S. hirsuta	55	50

Анализът на мастните киселини на А83543.1 и известната разновидност SaccharopolyspQfa показа, че и двете култури имат както наситени така и мастни киселини с разклонена верига. Съставът на мастните киселини на А83543.1 е подобен, но не и еднакъв със състава на другите разновидности. Таблица VIII дава сравнение на съставите на мастните киселини на А83543.1 и на познатата разноввдност Sac char opolj ерата.

Основния анализ на състава на мастните киселини, показан в Таблица VIII, разкрива разсейване,, което е достатъчно, за да се приеме, че културите са отделни отделни разновидности на един и същ вид. Основната схема на съставките по данните от таблица VIII е представена на фигура 12.

Таблица IX дава сравнение на физиологичните характеристики на А83543.1 с характеристиките на съществуващите видове и подвидове Saaehar op oly sp ora.

Таблица YUI: Състав ($) на мастните киселини в А83543.1 и щамовете Saccharopolyspora

	CO CN	V ω	£ 1	UN 1	kD CXJ	O' 1 V	O 1	CN 4*	4· t>	CN CO	C4· l>
•	•	•	• 1	1 ·	•	• 1	1 ·	- ·	•	•	·
UN	V	UN	•3·	CN	k£>	4-	CJ	V“		kO
V					<NJ	V

о 4 о- UN αι

О Ф Ф гw · · · ·· г Ο Ν νDν cj

σ?	o	t>	UN	4··			UN
UN	CN	O·	kO	l>	C\J	UN	V
•	•	·	•	- ·	•	' ·	·
Ο-	UN	4*·	5Γ	CJ	V		Γ
ν-	V

O Ю •rl V		o <0 •H Φ	Рч
g ₽ч
o	•p °	3 o	o	o	42	M	o
n		ft n	<0	<0		o	и
H	«4 H	Й H	H	H	4 Д O	CM	H

туберкулостеаринова киселина

Таблица ΊΧ: Сравнение на физиологичните характеристики на А83543.1 и Sac char opolyspora

- 30 Таблица IX: Сравнение на физиологичните характеристики на А83543.1 и Saccharopolyspora (продължение) co

§§₊|S_+Ig§! ₊

+ + + + + + + I I I S till • ·

O

не е изпълнен

II a

- 31 Направените сравнения показват, че А83543.1 се различава достатъчно от предварително /по-рано/ описания ввд Sac char opoly арата ,за за да бзде нов вид на Sac char opolyspora и за който беше избрано наименованието Saccharopolyspora apinosa . Името splxtosa отразява наличието на шипове по спорите на този вид.

Щамовете А83543.3, А83543.4 и А83543.5 са твърде сходни макроскопически на щама А83543.1, за да бедат класифицирани като щамове на SaccJjaropolyspora spinosa . Четирите щцма се различават по количеството А83543, произвеждано от тях. А83543.3 произвежда приблизител· но четири пъти повече А83543 отколкото А83543.1, а щамовете А83543.4 и А83543.5 произвеждат приблизително осем до девет пъти повече, отколкото произвежда щама А83543.1.

1Ькто се набладава и при други организми, характеристиките на културите, произвеждащи А83543, съгласно настоящото изобретение, Saccharopolyspora splaoea, IRBD 18395, ΗΒΗΧ 18537, ЖВЖЬ 18538 и IRBL 18539, продължават да претърпяват промени. 1кка мутантите на тези щамове могат да бвдат получени чрез физични или химични методи, които са известни в тази област. Например, други щамове могат да се подучат чрез обработка с химикали като ж-метил-ж-нитро-Ж-нитрозогуанидин. Естествените предизвиканите мутанти на щамовете на Saceharojpolyspora spluaea KRBIi 18395, ЖКВЬ 18537, ЖВВХ 18538 и

18539_г които запазват способностите за произвеждане на извлекаемо от количество А83543, са част^това. изобретение.

Средата, която се използва за нарастване на културите Sacchaпт уppotq «ρϊ^-·»пяй може да бвде която и да е от няколко среди. Обаче за икономия в производството, оптимална производителност и лесно извличане на продуктите се предпочитат определени среди. 15ка например предпочитани източници на въглерод при масова ферментация са гликозата и малтозата, въпреки че могат да се използват също и рибоза, ксилоза, фруктоза, галактоза, маноза, манит, разтворимо ни

- 32 шесте, картофен декстрин, метилолеат, масла като соено и други подобни.

Предпочитани източници на азот са пацуково брашно, пептинизирано мляко и изварено соено брашно, въпреки че могат да се използват и рибено брашно, течност за натопяване на семена, дрожден екстракт, /месен/ хидролизиран с ензими казеин, говежди екстракт и други подобни.

Между хранителните неорганични соли, които могат да се включа^т в средата, са обикновените разтворими соли, които могат да отделят цинкови, натриеви, магнезиеви, калциеви, амониеви, хлоридни, карбона тни, сулфатни, нитратни и други подобни йони.

Основните елементи с микроконцентрация, необходими за растеж и. развитие на организма снцо трябва да се включат в средата. Тези елементи с микроконцентрация обикновено се срещат като примеси в други заместители на средата в количества, които са достатъчни за да отговорят на изискванията на организма за растеж.

В случай, че разпенването създава проблеми, към средата за масова ферментация може да се добави малко количество /т.е. 0,2 мл/л/ противоразпенващо вещество като полипропиленгликол. Обаче при културите, които произвеждат А83543 традиционните противоразпенващи на вещества забавят произвеждането А83543. Разпенването може да се контролира чрез включване на соено масло или Ь—101 /фирма BAST / в средата /1-3 %/. Ако разпенването продължава може да се добави ощв масло.

Процентното стдъркание на дадена съставка на А83543 може да се изменя чрез промени в средата. Например, добавянето на валин или на изомаслена или пропионова киселини увеличава процента на произвежданата съставка A83543D .

За произвеждане на значителни количества А83543 се предпочита аеробна ферментация в дълбока хранителна среда 8 биореактори с разбъркване. Малки количества А83543 могат да се получат чрез

- 33 стръсквана в колба култура. Поради временното задържане на производството, което обикновено се свързва със заразяването на големите биореактори със споровата форма на организма, предпочита се използването на растителен инокулат. Растителната посевна култура се приготвя чрез изкуствено заразяване на малък обем от средата със спорова форма или гъбични частици от организма, за да получим свежа активно нарастваща култура на организма. След това растителния инокулат се прехвърля в по-голям биореактор. Средата с растителна посевна култура може да бъде същата като|средата за по-големи ферментации, но друга среди също са подходящи.

А83543 ее произвежда чрез организми създаващи А83543, когато се отглеждат при температури между около 24 °C и около 33 °C. Оптималните температури за получаването на А83543 вероятно са в границите между 28-30 ®С.

Както е прието ори аеробните процеси в дълбока хранителна среда в съда се вдухва стерилен въздух от дъното, като в същото време средата се разбърква с традиционно турбинно работно колело. Изобщо степента на аерация и скоростта на разбъркване трябва да бъдат достатъчни, за да се поддърока нивото на разтворения кислород на или над, 35 % и нивото на насищане с въздух на или над 50 %, като вътрешното налягане в съда е 0,34 атмосфери.

получаването на съставките на А83543 може да се^роследи по време на ферментацията чрез изследване на екстракти от хранителната среда. ЙПто се използва системата, описана в Пример 1, ВН е полезен инструмент за тази цел.

Като се проследява получаването им в условията на аеробна ферментация в. дълбока хранителна среда, съставките на А83543 могат да се отделят от ферментационната среда с помощта на традиционните за тази област методи. Културата А83543, получена по време на ферментация_гяв организмите, произвеждащи А83543, се наблвдава както в

- 34 Жфзовдтака и в хранителната среда. Вероятно културата А83543 е мастноразтворима. ТЬка, ако при ферментацията се използва значително количество масло, целият извлек от хранителната среда θ по-ефективен. Ако се използват малки количества масло, по-голямата част от А83543 е в мицелите. В този случай по-ефективно извличане на А83543 ее осъществява като първоначално се филтрира средата, за да се овделк хранителната среда от мицелната маса /биомасата/.

А83543 може да се извлече от биомасата по много начини, ^цин предпочитан метод включва измиването на отделената биомаса с вода за отстраняване на останалата хранителна среда,,, смесването на биомасата с полярен разтворител, в който А83543 е разтворима, например метанол или ацетон,, отделяне и концентриране на разтворителя, извличане на концентрата с неполярен разтвор и/или му чрез адсо^бент силикагел с обърната фаза като ЕР-С8 или RP-C18 или чрез полимер с голяма порестост като НР-20 и друт*и подобни.

Активният материал се отмива от адссГбзнта с помощта на подхо дящ, разтворител като например смеси от ацетонитрилхметанол, съдържащи малки количества тетрахидрофуран.

Ио подобна методика А83543 може да се раздели на отделните съставки А83543А, А83543В, А83543С, А83543В А83543Е, A83543F,

А83543В и A83543J и псевдоагликона А83543А. ^цин предпочитан метод на отделяне използва обратно-фазова хроматография със силикагел /С|₈ или Cq/.

Като друга възможност твърдите съставки на културата включващи компонентите на средата и мицела могат да се използват като източ ник на А83543 без екстракция или отделяне, ио з^предпочитане след отстраняване на водата. Например, след получаване на А83543 цялата ферментационна хранителна среда може да се изсуши чрез лиофилизация, чрез сушене в барабан или чрез азеотропно дестилация и сушене. След това изсушената хранителна среда може да се използва направо, нап

- 35 ример, чрез прякото й смесване в предварителната хранителна смес.

Инсектиццдна и акарицидна активност

Съединенията съгласно това изобретение са много полезни за контролиране на насекомите и кърлежите. Ето защо настоящото изобретение е насочено също и към методите за ограничаване на насекомите и кърлежите, което от своя страна означава, прилагане в локуса на насекомото или кърлежа на такова количество А83543, което потиска развитието на насекомото или кърлежа.

ί»

Съединенията А83543 показват активност^някои насекоми и кърлежи. По-специално съединенията са активни срещу Spodoptera ertdaiHa. , който е представител на клас Ципокрили насекоми /lepidoptera /.Други типични представители на този клас са: Сатросарва Ровите 11а , Xaspeyrasla poaoaella » iectnidae , Plodla Interpiufiftella , Toartricidae , Heliothis armigera „Heloithis xea » Pyrausta nuhilaris » Geometidae, Pactipajhaca goasyplella , Psychidae , leomstege strict!calls » baphygaa fruglperda , дрешен молец, гъсеница на зелева пеперуда и други гъсеници.

Съединенията показват активност и срещу Aphis gosaypii , който а представител на клас насекоми НошвдФета . Други представители на този клас са Eiythroaeura comes, Knrpoasca liblca, fepoasca plavescene> Psylla pyricola » Psylla mall r Hellococcus hohemlens » E*lacandtam βοφκΐ t; Alexrro-dldae , и Hetemptera, Hemiptexfe * както и някои други Aphididae.

Освен това съединенията А83543 показват активност срещу stoColiseta iuoimata mw-ry .t Calliphoxe Ticcioa , и срещу комарите, които са предстя в и те ли на класа насекоми Mptera . Друг типичен представител a Musca domestica .

Съединенията А83543 са подходящи за намаляване на популациите на насекомите и кърлежите като се използват за потискане развитието на насекомите и кърлежите чрез прилагане в лодуса на насеко- 36 мото или кърлежа на такова количество А83543, което ограничава развитието на насекомите или кърлежите.

Локус на насекомите или кърлежите означава средата, в която насекомите или кърлежите живеят или квдето се намират яйцата им включително въздуха около тях, храната, която поемат или предметите, с които влизат в контакт. Например растителноядните насекоми или кърлежи могат да се контролират чрез прилагане на активно съединение към растителните части, които насекомите или кърлежите ядат или обитават и по-специално листната част.

Смята се, че съединенията са подходящи и за предпазване на текстилни и книжни изделия, складирани зърна или семена чрез прилагане на активно вещество/съединение/ тсъи тях.

Терминът потискане на насекомо или кърлеж се отнася др намаляване на броя на живите насекоми или кърлежи или до намаляване на броя на жизнените яйца на насекомите или кърлежите. Степента на намаляване, постигната от съединението, зависи, разбира се, от количеството на приложеното съединение, вида на използваното съединение и вида на насекомото или кърлежа, срещу които е използвано съединението. Трябва да се използва такова количество,, което поне да обездейства насекомото или кърлежа.

Термините количество, което обездейства насекомото и количество, което обездейства кърлежа се използват за да посочат количеството, което е достатъчно да предизвика измеримо намаляване на популацията на третираното насекомо или кърлеж. Обикновено се използва количество в границите от около 1 до около 1000 ррм /или 0,01 др 1 кг/хектар/.

Съгласно един предпочитан вариант на изобретението настоящото изобретение се отнася до метод за потискане на податливо насекомо от клас lepidopteie в съответствие с който към растението се прилага ефективно количество от съединението А83543 за обездействане

- 37 на насекомото в съответствие с настоящото изобретение.

Друго предпочитано решение по изобретението е свързано с метод за потискане на хапещите мухи от клас Diptera по животни съгласно който животното се третира орално или парентерално с ефективно количество от съединението А83543 за потискане на насекомото-вредител.

ПРОВЕРКА ВЪРХУ КЪРЛЕЖИ/НАСЕКОМИ

Съединенията А83543 бяха изпитани за акарицидна и инсектицвдна активност по следния начин.

Всяко изпитвано съединение беше приготвено чрез разтваряне на съединението в смес ацетон/алкохол /1:1/, съдържаща 23 г Toxinml R/смерсуд^онат/нейонен емулгатор/ и 13 г *ТахЬяп1 s/cMec сулфонат/нейанен емулгатор/ на литър. След това тези смеси бяха разредени е вода до получаване на посочените концентрации.

Върху котиледони на тиква бяха поставени Tetranychns urticae loeh и Aphis gosaypXL Glows» които се закрепиха от двете страни на листа. Други растения от същата третирана група н^бяха заразени. След това листата бяха напръскани с 5 мл от експерименталния разтвор с помощта на разпрашавада пръскачка DeTilhiso при налягане 10 фунта на квадратен инч. И дветфовърхности на листата бяха напръсквани до протичане и след това оставени да изсъхнат в течение на един час. След това два незаразени листа бяха отрязани и поставени в бледо на Натри, съдържащо Spodoptera eridania Стаи®».

Бяха изследвани и други насекоми чрез същите/подобни/ състави и методи на изпитвана .

След, стандартните периоди на излагане/третиране/ беше пресметнат процента на смъртността. Резултатите са посочени в дадените по-нататък таблици. Използват се следните съкращения :

- 38 Съкратено обозначение

В¥

СЛ

СВИ

СЪН

СВИ

SAH

SM

Научно наименование

Anthanomus grardls

Aphis gos^ypii

He Hothi s sea

Dalbulus maidie

Biabrotica unde cimpxuxct ata howardi

Spadoptera eridania

Tetraaychna urticae

Таблица X: Активност на A83543A спрямо навоизлипени ларви на СВИ

Третиране	Дни а	Дозировка/РРМ/	% Потискане
Местно в	1	1.00	20.00
		5.00	100.00
		10.00	100.00
		50.000	100.00
		100.00	100.00
В храната г	4	1.00	30.00
		5.00	100.00
		10.00	100.00 •
		50.00	100.00
		100.00	100.00
На яйцата д	6	10.00	0.00
		50.00	0.00
		100.00	30.00
Местно в	1	0.50	10.00
		1.00	40.00
		5.00	80.00
		10.00	100.00
		50.000	100.00
		100.00	70.00

- 39 Таблша X /продължение/; Активност на А83543А спрямо новоизлю-

Третиране	Дни а	Дозировка /ррш/	% Потискане
В храната	3	0,50	15.00
		1.00	45.00
		5.00	1.00.00
		10.00	100000
		50.00	100.00

^а Брой дни между третирането и наблвдението

С 6 Средно за две изпитвания ^в Обработка с 1 мл от рецептурния А83543А ^г В храната представлява обработка на повърхността с А83543А, която може да изсъхва и да се обезпаразитява

Λ Яйцата се третират локално с А83543А и поставените под контрол яйца изцяф се излшваж.

Таблица И: Контролиране в проценти на новоизлюпени ларви иа OW чрез съставките на А83543 *

р Съставка	РРМ ** фдкь
0,5	1	5	10
А	55 fif	100 /а/	100 /а/	100 /а/
В	85 /е/	80 /с/	100 /а/	100 /а/
с	5 /ж/	85 /W	93 /Ьс/	100 /а/
D	88 /d/	90 /ас/	100 /а/	100 /а/
Е	28 /ef/	58 /а/	100 /а/	100 /а/
₽	0 /g/	o /е/	0 /g/	95 /»Ъ/
C	0 /g/	0 /g/	20 /g/	80 /с/

Третиранията с еднаква буква в скобите са сходни при ниво 0,05.

Метод за местно третиране с пипета с 20 ларви/реплика и 4 реплики? между третиране и набладение - един ден.

Таблица XII: Активност на А83543А спрямо ларвите на SAV
Етад. на развитие Третцране	Дни а	Дазд9Р.ка/ррп/% Потискане
Новоизлюпени	По листата/	3	1.00	10.00
	Храстовиден		5.00	40.00
	обикновен		10.00	100.00
	ЙОв: В		50.00	100.00
			100.00	100.00
Новоизлюпени	Местно г	3	1.00	0.00
			5.00	60.00
			10.00	100.00
			50.00	100.00
			100.00	100.00
Йавоизлюлени	По листата/	4	0.50	0.00
	Храстовиден		1.00	66.67
•	обикновен		5.00	100,00
			10.00	100.00
			50.00	100.00
Втори възрас-	Местно р	1	1.00	0.00
стен стадий			5.00	0.00
			10.00	0.00
			50.00	80.00
			100.00	100.00
Втори възрас-	По листата/	4	1.00	0.00
стен стадий	Храстовиден		5..00	0.00
	обикновен		10.00	80.00
	бо® Д		50.00	80.00
			100.00	100.00
Т^ети възрас-	Местно Л	2	1.00	0.00
тен стадий			5.00	0.00
			10.00	13,33
			50,00	73.33

Таблица XII /продължение/

Етап на развитие	Третиране	Дни а	Дозировка/РРМ/ ^Потиска]
Трети възрастен	По листата/	4	0,50	0.00
стадий	Храстоваден		1.00	0.00
	обикновен		5.00	40.00
	Йоб д		10.00	100.00
•			50.00	100.00
Пети възрастен	Местно д	2	10.00	0.00
стадий			50.00	0,00
Пати възрастен	По листата/	4	10.00	0.00
	Храстовиден		50.00	0.00
	обикновен боб	Д

^а Дни между третирането и наблюдението

Средно между изпитваните реплики ^в фна реплика ^рДва реплики ^л ® Третирано локално с 1 мл от рецептурния А83543А

ТЬбдгигта ΠΙΙ: Активност на А83543А спрямо възрастно животно ву * »

Третирана Дозировка /ррм/ % Потискане ^а

Местно 1.000.00

5,0020*00

10,0020,00

50,00 100,00

100.00 100,00 ^а Ец™ реплика; набладение 3 дни след третиране ® Рецептурен А83543А /1 мл/ изсипан върху възрастни насекоми в бледо на Патри

- 42 Таблица XIV: Активност на А83543А при оранжерийни изпитвания

Културно растение	спрямо различни вредители по културните растения
Вредител	Дозировка/РРМ/	% Потискане а
Зърнени култури	CRY	30	100
		15	50
		7,5	10
		3,75	0
Тиква	SAW	250	100
		125	100
		62,5	100
		31.25	55
		15.63	40
		7.8	20
		3..9	20
		1,9	0
Тиква	£К	250	70
		125	40
		62 г5	20
		31,25	0
ί Тиква	СА	100	0
		50	0
Зърнени култури	CIH	200	90
		100	30
		50	0
Храстовиден	SAY	100	100
обикновен бо£		50	80
		25	40
		12,5	0

- 43 Таблица Х1У/продължение/ : Активност на А83543А при оранжерийни изпитвания спрямо различни вредители по културните растения Културно растение Вредител Дозировка /РРМ/ % Потискане ^а

Храстовиден	SK	100	100
обикновен боб		50	80
		25	30
		12,5	10
		6,25	0
Тиква	СА	100	80
		50	40
		25	0
Зърнени култури	CBV	6	30

0

ТНблица XV дава сравнение за ефективността и продтлжителността на третирането с А83543А и третирането с ме томил / aethaayL/ при изпитвания на открито в експериментални сздове срещу Spcdaptera aridania·

Таблица XV: Ефективност на А83543 спрямо Spodaytera aridanla ПРИ ИЗПИТВАНИЯ НА ОТКРИТО В експериментални съдове

Третиране А83543А	Дозировка РРМ 63	Дни след третирането а
1 100	£ 88	2 90	14 5
А83543А	125	100	88	95	90
А83543А	250	100	з®	100	100
А83543А	500	100	100	100	100
Метомил	63	100	20	15	0
Метомил	125	100	35	40	20
Метомил	250	100	85	45	40
Метомил	500	100	М **	85	60
Никакво	0	0	0	0	0
Никакво	0	0	0	0	0
а Резултатите дават	смъртността	в

- 44 Таблица XVI обобщава ЬС 50, леталните концентрации, при които изпитваното съединение потиска 50 % от третираното насекомо или кърлеж, като са дадени стойностите за А83543А в сравнение с познатия инсектицид метомил.

Таблица XVI: Летални концентрации 50 / IC 50/ за А83543 ^а

Обект	50 /рр /
А83543	Метомил
CRY	15	6
	>250	5.4
SM	150	71.4
SAW/по листата	1.3	11.4
CBw/при контакт *	0^6	14.5

^а Дозировката за CRW е в теглови единици в почвата; при всички други е дадена концентрацията при пръскане

Съставките на А83543 са активни спрямо ларвите на Aedas aegjpti при стандартни изпитвания ин витро на ларвицвд за комари. Таблицц. XVII и XVIII обобщават активноста на съставките на А83543 при тези изпитвания.

Таблипа XVII: Активност ин витро на А83543В и А83543С спрямо ларвите на комар в първи възрастен стадий

Съставка на А83543 Минимална концентрация за потискане /мкг/мл/ ^а

А 0.016, 0.031 ⁶

В 0.016

С 0.031 ^а Най-ниската концентрация, която води до 100 % потискане олед 24 ч / върху пластинки за мияротитруване/

Изпитвания на две серии.

- 45 Таблица XVIII; Активност на съставките на А83543 спрямо ларвите

Съставка

D

Е

Р

G в четвърти възрастен стадий ^а Контрол в проценти ^а

60, 70 ^{6 а} За ЗА ч след обработка с 0,332 РРМ Резултати от две изпитвания.

Полеви опити /изпитвания в полеви условия/

А83543А беше изпитан в полеви условия. При тези изпитвания А83543А показа активност спрямо гъсеницата на зелевата nenegjga и гъсеницата на зелевата педомерка /' Geometidae/ върху аспержи и спрямо популация от соева педомерка / Geometidae //75 %/ к Laphygaa frugiperta № #/ върху соя.

Инсектицидни състави

Съставите на това изобретение се прилагат под формата на състави, които също представляват част от това изобретение. Тези състави съдържат количество от съединението А83543, което обездейства насекомото ежа и фитологично приемлив инерт-ен носител. Активната

съставка, т.е. съединението А83543 може да бъде под формата на:1/ единична съставка на А83543, 2/ смес от две или повече съставки, 3/ оеделена смес на А83643 или 4/ А83543 заедно с изсушената част на ферметационната среда» в която се произвежда, т.е. суровата изсушена ферметационна хранителна среда.

Съставите представляват или концентрати,, които се диспергират във вода за по-нататъшно използване или прахообразни или гранулира

- 46 ни състави, които се използват без допълнителна обработка.

Съставите се приготвят съгласно методи и рецепти, които са традиционни в селскостопанската химия, но които са нови и важни поради наличието на едно или повече от съединенията съгласно това изооретение

Дисперсиите, чрез които съединенията или суровия изсушен материал се прилагат, най-често представляват водни суспензии или ецулсии, приготвени от концентрати на съединенията или суровия материал, такива водоразтворими, водосуспендируеми или емулгируеми състави са или твтрди тела /ббикювено познати като омокряеми прахове/ или течности /обикновено познати като емулгируеми концентрати или водни суспензии.

Омокряемите прахове,., които могат да бтдат уплътнени до образуване на диспергиращи ее във вода гранули представляват' представляват фина смес от активното вещество/съединение/, инертен носител и повърхностно-активни вещества. Концентрацията на активното съединение обикновено от около 1 %, за предпочитане от 10 %, до около 90 % но тегло. Инертният носител обикновено се избира между атапулгитна глина, монтморилотнитни глини, диатомова пръст или пречистени силикати.

Ефективните повърхностно-активни вещества, представляващи от около 0,5 до около 10 % от омокряемия прах, се избират измежду су$фонираните лигнини, кондензираните нафталинсулфонати, нафта лин сулфонатите, алкилбензолсулфонатите, алкилсулфатите и нейонните повтрхностно-активни вещества като етиленокисните адукти на алкилфенолите.

Оиулгируемите концентрати на съединенията представляват подходяща концентрация на едно съединение като от около 50 др около 500 г/л течност са еквивалентни на около 10 % до около 50 разтворено в инертен носител, който е или водосмесваем разтворител или смес от водонесмесваем органичен разтворител и ецулгатори.

Подходящитя органични разтворители включват ароматните съедине

- 47 ния и. по-специално ксилоли и нефтените фракции и по-специално нафталиновите и олефиновите фракции на нефта с висока точка на кипене като например ароматни тежки бензини. Могат да се използват и други органични разтворители като терпенови разтворители,включващи смолести производни, алифатни кетони като циклохексанон и сложни алкохоли като 2-етоксщетанол.

Подходящи емулгатори за емулгируемите концентрати се избират от традиционните нейонни повърхностно-активни вещества като упоменатите по-горе.

Водните суспензии представляват суспензии на водонеразтворимите съединения съгласно това изобретение, диспергирани във воден носител в концентрация в границите от около 5 др 50 тегловни Суспензиите се приготвят чрез фино смилане на съединението и енергичното цу разбъркване в носителя, състоящ, се от вода и повърхностно-активни вещрства,. избрани от разгледаните по-горе ввдове. За увеличаване на плътността и вискозитета на водния носител могат да се добавят и инертни съставки като неорганични соли и синтетични или естествени смоли. Често е най-подходящо смилането и смесването на съединението да се извършват едновременно като се^риготвя водна смес и се хомогенизира в устройство като пясъкоструен апарат, топкова мелница или бутален хомогенизатор.

Съединенията могат да се използват и под формата на гранулирани състави, които са особено подходящи за прилагане в почвата.

гранулираните състави обикновено свдържат от около 0„5 до около 10 тегловни £ ат съединението, диспергирани в инертен носител,, който се състои изцяло или в по-голямата си част от глина или подобно евтин продукт,

ТЬзи състяви обикновено се приготвят чрез разтваряне на съединението в подходящ разтворител и прилагането му към гранулиран носител, който предварително обработен за подходяща форма на частици

- 48 те в границите от около 0,5 до 3 мм. Такива състави могат да се приготвят и чрез забъркване на тестообразна или пастообразна маса от носителя и съединението, натрошаването и вземането й до получаване на желания размер на частиците.

Праховете, стдържащи съединенията, се приготвят чрез фино смесване на съединението в прахообразна форма с подходящ прахообразен носител като каолинова глина, смляна вулканична скала и други подобни. Най-подходящо θ праховете да ездаржат от около 1 до около 10 % от съединението.

Ако възникне .някаква причина еднакво практично е съединението да се прилага под формата на разтвор в подходящ, органичен разтворител, обикновено лек нефт, като например инсектицидните масла, които се използват широко в селскостопанската химия.

Инсектицидите и акарицидите обикновено се прилагат под формата на дисперсия на активната съставка в течйй носител. Обикновено под термина дозировки се разбира концентраия на активната носителя. Най-широко използвания носител е водата.

на активната съставка в

Съединенията съгласно изобретението могат да ефрилагат и под формата на аерозолен състав. При тези състави активното съединение е разтворено или диспергирано в инертен носител, който е носеща смес, която създава налягане. Аерозолният състав се поставя в контейнер, отквдето сместа се дозира през разпрашаващ вентил. Носещите смеси представляват или халогенови въглеводороди с ниска точка на кипене, които могат да се смесват с органични разтворители, или водни суспензии уплътнявани с инертни газове или газообразни въглеводороди.

Д^ствителното количество от съединението, което трябва да се прилага в ловуса на насекомите и кърлежите няма критичен характер и може лесно да ое определи от специалистите с оглед, на посочените примери. Изобщо се предполага, че концентрация от 10 до 5000 РИЙ на съединението ще осигурят добър контрол. При по-голяма част от съеди- 49 ненията са достатъчни концентрации от 100 до 1000 РРМ. За 1ултурни растения като соя и памук подходяи^ дозировка на съединенията е от около 0,01. до 1 кг/хектар, като обикновено сфрилага под формата на пулверизационна течност от 5 до 50 галона/акър.

Локуса, в който Се прилага съединението, може да бтде всяко място, обитавано от насекомо или кърлеж, например зеленчукови растения, плодни дървета, лозя и декоративни растения.

Поради особената способност на яйцата на кърлежите да са устойчиви на токсично въздействие може да се наложи повторно третиране за да се контролират новопоявилите се личинки какъвто е случая и при други известни акарициди.

Ектопаразитицидно действие

Съединенията А83543 са активни и спрямо представителите на клас насекоми Sijterau

Таблици XIX - XXI обобщават изследванията ин витро със съединенията А83543А и А83543> .

Таблипа XIX: Ефективност ин витро на А83543А спрямо личинките на Phorela reglnr

100

Активност I

0,5

0,25

100

100

100

100

100

100

Активност « % смъртност

- 50 Таблица XX: Ефективност ин витро на А83543А спрямо възрастни

Stomoxy calcltrans

Доза /РРШ 1	24 часова активност1 48 часова активност1
	100	100	100
	500	100	100
	25	100	100
	10	100	90
	5	80	100
	2.	70	90
с	1	10	60
	0,.5	0	10
	1 Активност = % смъртност	•

При изпитванията ин виво съединенията А83543 показаха системна инсектицвдна активност при морски прасета и овце срещу личинки на Calliphora viccina и възрастни Stomoxy calcitrans без очевидни признаци на токсичност. Представителните съединения А83543А и А83543 бяха изпитани на лабораторни и целеви* ' животни/обекти/ за определяне диапазона на активността. Следните изпитвания са примерни :

Системни изпитвания с морски свинчета

При това изпитване се използват възрастни морски свинчета. Съединенията, които се изпитват, са разтворени във воден поливинилпиролидон или в полиетиленгликол 200, като подходящо количество от разтвора се прилага или орално или чрез инжектиране в корема/интраперисе тонеално/. Използват различни дози от съединението, както е посочено в таблиците по-нататък.

На 30 минута /освен в посочените случаи/ от морските свинчета се взема кръв и кръвните проби се центрофугират. Стоматологични тампони се напояват с кръвния серум, поставят се в блвда на Натри и излагат на възрастните Storn^y calcitrans г ларвите на Calliphora viccina се поставят в епруветки. След 24 ч и след 48 ч насекомите

Таблица ΣΧΙ: Ефективност ин витро на А83543А и A83543D

«X on co

8 V '	8 V	8 V	О о V	8	8
8	8	О о	о о	8	»
V	V	V ·
О о	8	о о	8	о 1>	о UN
V	V	V ·	V
О CO	О UN	о on	8	о	О

	UN (Q	0J V
un	OJ ф	ON
·*		м
UN (М ·	ν О	о
		X

- 52 се оглеждат и се преброяват мъртвите екземпляри. Резултатите от изпитванията се записват като процент на убитите насекоми.

Системно изпитване с овце

Изпитванията се провеждаха с овце като се използва метода, описан по-горе за изпитване с морски сринчета. Изпитваното съединение се прилага чрез инжектиране в корема или вената или в търбуха; при тези изпитвания кръвни проби се взимат след. 24 часа.

Резултатите от системните изпитвания с морски свинчета и овце като се използват съединенията А83543А и A83543D са обобщени в та( блици XXII - XXV.

А83543А не показа хелминтицвдна активност при овцете,., третирани с единична интраперитонеална или интраруминална доза от 50 мг/кг живо тегло или при мишки, експериментално заразени с чревен нематод Жеиа±оввАг«14ев dubius „ при оралното прилагане с доза 500 мг/ кг живо тегло.

При изпитванията ин витро А83543А уби 30 % от НаевапсЪпя соаtoxtoB при концентрация 100 ода .·

<0 II II II II

В ft Й Й 8

р*	S P* P*	Я P1 P*	S F F	P*
4· CM	Q Ю 4« ro cm	Q Ю 4* ГО CM	Q Ю 4· ГО CM	m	4· CM

Таблица XXY: Инсектицида н анализ на А83543А в кръвта на овце, контролно заразени е Haemonchus contoriais - 48 часа излагане ин витро на насекомите на взет от овцете серум³

I Ф'о

ΙΌ

ί Ч й й Й

- 57 Ектопаразитицвдни методи

Ето защо това изобретение се отнася също и до метод за контрол /борба/ на популацията на ектопаразитни насекоми, които се хранят с кръвта на гостоприемника като този метод обхваща прилагането на ефективно количество от съединеннието А83543 спрямо животното-гостоприемник. Ектопаразитните насекоми включват паразитни насекоми и акариди^ Прилагането на съединението спрямо животното може да бвде кожно,, орално и през кожата.

Паразитните насекоми и акариди включват видовете, които са кръвосцучещи както и плътоядни и които паразитират през целия си жизнен цикъл или само през част от него, като например само през ларвения стадий или през стадия на възрастно насекомо. Представителни видове са следните :

horse fly	Tabanus spp.
stable fly	Stomoxys calcitrans
black fly	Simulium spp.
horse sucking louse	Haematopinus asini
mange mite	Sarcoptes scabiei
scab mite	Psoroptes equi
horn fly	Haematobia irritans
cattle biting louse	Bovicola bovis
shortnosed cattle louse	Haematopinus
	eurysternus
longnosed cattle louse	Linognathus vituli
tsetse fly	Glossina spp.
cattle follicle mite	Demodex bovis
cattle tick	Boophilus microplus and
	B. decoloratus
Gulf Coast tick	Amblyomma maculatum
Lone Star tick	Amblyomma americanum
ear tick	Otobius megnini
Rocky Mountain
wood tick	Dermacentor andersoni
screwworm fly	Cochliomyia hominivorax
assassin bug	Reduvius spp.
mosquito	Culiseta inornata

brown ear tick	Rhipicephalus
African red tick	appendiculatus Rhipicephalus evertsi
bont tick	Amblyопипа sp.
bont legged tick	Hyalomma sp.
hog louse	Haematopinus suis
chigoe	Tunga penetrans
body louse	Haematopinus ovillus
foot louse	Linognathus pedalis
sheep ked	Melophagus ovinus
sheep scab mite	Psoroptes ovis
greenbottle fly	Phaenicia sericata
black blow fly	Phormia regina
secondary screw-worm	Cochliomyia macellaria
sheep blow fly	Phaenicia cuprina
bed bug	Cimex lectularius
Southern chicken flea	Echidnophaga gallinacea
fowl tick	Argas persicus
chicken mite	Dermanyssus gallinae
scalyleg mite	Knemidokoptes mutans
depluming mite	Knemidokoptes gallinae
dog follicle mite	Demodex canis
dog flea	Ctenocephalis canis
American dog tick	Dermacentor variabilis
brown dog tick	Rhipicephalus sanguineus

Методът съгласно изобретението може да се използва за предпазване на селскостопански и домашни животни от ектопаразити. Например, съединенията могат успешно да се прилагат при коне, едър рогат добитък, овце, свине,, кози, кучета, котки, и т.н. както и при екзотични животни, като камили, лами, сърни, и други видове, които обикновено се наричат диви животни. Съединенията могат успешно да се прилагат при домашни и други птици като пуйки, пилета, патици и т.н. Основно методът намира приложение при селскостопанските животни и найвече при едрия рогат добитък и овцете. Дозата, времетраенето и начина на ефективно приложение се изменят значително в зависимост от паразита, степента на опаразитяване и други фактори. Прилагането мо-

- 59 же да се осъществява периодично през целия жизнен цикъл на гостоприемника или само във върхови моменти на паразитна атака. Изобщо ектопаразитен контрол се осъществява чрез местно прилагане на течни състави, съдържащи от около 0,00005 до 95.0 % от съединението, за предпочитане до 5 %,но най-предпочитана е концентрацията на съединението до 1 %. Е-фективен паразитен контрол се постига при дозировки от около 5 др около 100 мг/кг.

Съединенията сфрилагат по традиционните ветеринарни методи. Обикновено съединенията са във вид на ектопаразитицидни състави, които съдържат съединение и физиологично приемлив носител. Например, течните състави могат просто да се напръскат по животните, които трябва да бъдат контролирани за ектопаразити. Животните могат да бъ дат третирани и с такива приспособления като гумени чесалки, на които да е намотано парче плат, съдържащо токсичното вещество и с които животното влиза в контакт. Използват се също така резервоари с дезинфекционни разтвори,с чиято помощ може да се прилага активното съ единение към гостоприемника.

Настоящите съединения показват системна ектопаразитицидна активност. Съединенията притежават способността да проникват в тъканите на гостоприемника,спрямо който е било приложено съединението. Па разитиращите насекоми, които в последствие се хранят с кръвта или други живи тъкани на гостоприемника, умират. Съединенията се прила гат кожно, орално или през кожата.

Това изобретение се отнася също и до ектотапаризитицидни състави, състоящи се от физиологично приемлив инертен носител и съединение А83543. Тези състави могат да се приготвят с помощта на методи, познати в тази област, например чрез разтваряне на съединението в едно или много физиологично приемливи спомагателни средства или разтворители.

Оралнотс|прилагане може да се осъществи чрез смесване на съединението с храната или водата на животните или чрез прилагане на

- 60 дозирани форми като таблетки, капсули, хапчета или имплантанти. Прилагането през кожата се осъществява чрез подкожни интраперитонеални и интравенозни инжекции на подходящи за инжектиране състави.

Съединенията могат да бъдат в обичайната си форма за орално прилагане като течности за вливане, таблетки или капсули. Такива състави, разбира се, изискват орално приемливи инертни носители. Съединенията могат да бъдат и във вид на разтвор или суспензия, подходящи за инжектиране, например подкожно, кожно, интраруминално, интраперитонеално, мускулно или венозно. В някои случаи съединенията са под формата на една от съставките на обикновената животинска храна. В този вариант настоящото съединение първо приема вцца на предварителна смес, в която съединението е диспергирано в течен или раздробен твърд носител. Предварителната смес може да съдържа от около 2 до 250 г от съединението на фунт. На свой ред предварителната смес се преработва в готовата храна чрез обикновено разбъркване.

Тъй като ектопаразитната атака обикновено се наблндава в значип телна част от жизнения цикъл на госториемника предпочита се съединенията съгласно настоящото изобретение да се прилагат под форма, която осигурява продължителен период на обезпаразитяване. Традиционните методи включват използването на матрица» която физически потиска разтварянето и която е восъчно полутвърдо тяло като растителните восъци или полиетиленгликол с високо молекулно тегло. Добър начин за прилагане на съединенията е използването на хапчета със забавено действие като тези на Наби /ЬаЪу /, патент на САЩ й 4,251,506 и на Симпсън /Simpson /, британски патент' В 2,059,767. При тези хапчета съединението е калсулирано в полимерна матрица като тази на Невин / Nevin/, патент на САЩ И? 4,,273,920. Забавеното освобождаване на съединенията съгласно това изобретение може да се постигне с помощта на имплантант, като например от силикон-съдъркаща гума.

За да ©е илюстрира по-пълно прилагането на това изобретение да- 61 дени са следните примери:

ПРИМЕР 1

Метод на изпитване на А83543 чрез ВГХ

Следният аналитичен ВГХ метод се използва за контролиране на ферментацията за получаването на А83543 :

Центрофугира се проба хранителната среда, отлива и се отстранява надутаечната течност (супернатант). Към биомасата се добавя достатъчно метанол, за да може пробата първоначалния си обем, размесва се и сместа престоява минимум 15 минути. Сепернатантът се центрофугира и се филтрира през филтър 0,45 мкм.

Като друг варйнт цялата хранителна среда може да се извлече с ацетонитрил (1:4 хранителна среда:разтворител) или ацетон.

Система ВГХ: Опора на колонката: 8-х колонка 100 мм, силикагел? мкм, сферичен C^g ( ^Nova 018, Waters)

Подвижна фаза: CH^ON/MeOH/BgO (45/45/10) съдържаща 0,05 % амини ев ацетат

Дебит: 4 мл/мин

Откриване : УВ при 250 нм

Време на задържане: А83543А- 3,6 - 3,7 мин

А83543

643 - 4,4 - 4,5 мин,

ПРИМЕР 2

Приготвяне А83543 с култура А83543.1

А. Ферментация при разклащане на колбата

Културата Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 под формата или като лиофилизиран пелет или поддържана с течен азот суспензия се използва за посявка в растителна среда със състав А или В (среда В се предпочита при масово производство) :

Растителна_среда_А_

Съставка Количество (%)

Соев бульон Trypticase 3.0 на фирмата Baltimore Biological Laboratories

- 62 Съставка

Дровден екстракт

Глюкоза

Малтоза

Количество

0,3

0,2

0,5

0,4

Дейонизирана вода - достатъчно количество до 1 л pH не се регулира

Растителна__среда_В

Съставка Количество

Хидролизиран с ензим каееин на фирмата3.0

NZ Amine A, Sheffield Products, P.O.Box 638, Norwich, NT 13815

Дровден екстракт0,3

MgS0₄.7H₂00,2

Глюкоза<ф,0

Дейонизирана вода - достатъчно количество до 1 л рй 6,2, регулира се на 6,5 с NaOH

Съдове със скосено дъно или пластинки могат да се приготвят като към растителната среда А или В се прибави 2,5$ агар. Скосеният съд с посявка се инкубира при 30 °C за около 10 до 14 дни. Зрялата култура се остъргва със стерилен инструмент, за да се разровят спорите и да се отстрани мицелната мрежа. Около една четвърт от разровените спори и така нараствалата култура се използва за посяване на 50 мл растителна среда в първи стадий. Като друг вариант средата в първи стадий може да бъде засята чрез ампула от течен азот.

Когато култулата се поддържа в течен азот,ампулите се изготвят като се използват равни обеми растителна култура (48-72 ч инкубация, 30 °C) и суспендираща среда. Суспендиращата среда съдържа лактоза (100 г), глицерин (200 мл) и дейонизирана вода (достатъчно количество до 1 л).

Ампулата от течния азот се използва за засяване на 100 мл расI

- 63 тителна среда в 500 милилитрови Ерленмайерови колби (или 50 мл среда в 250 милилитрови колби). Културите се инкубират при 30 °C в течение на 48 часа във вибрационно (клатещо се) сито, въртящо се по

2-инчова (5,08 см) окръжност със скорост 250 оборота/минута.

Инкубираната култура (5$ обемно съотношение с инокуланта) се използва за посяване на 100 мл производствена среда със следния със тав:

Произв^дствена__с£еда_1

Съставка

Глюкоза

Количество (%)4

Растителен белтък, частично хидролизиран с ензим на фирмата Sheftone Н, Sheffield Products1,5—3

Брашно от памуково семе на фирмата Pcoflo, Traders

Protein, Ρ.Ο.ίΒοχ 8407, Memphis, TN 381081,0

CaCOg (реактив или технически чЩст)0,3

Соено масло1,0

Обикновена вода - достатъчно количество до1 л (при предварителна стерилизация pH се регулира на 7,0 с NaCH )

Посятата производствена среда се инкубира в 500 милилитрови Ерленмайерови колби при 28-30 °C за 6 до 8 дни в клатещо се сита, въртящо се по дву-инчова окръжност със скорост 250 оборота/минута.

Б. Фермантатт^и в разбъркван биореактор

За да се приготви по-голям обем инокулат се използва 10 мл сре да в първи стадий, приготвена както е описано в раздел А, за посяване на 400 мл растителна среда във втори стадий, която има същия състав като състава на растителната среда в първи етап. Тази среда във втори стадий се инкубира в дву-литрова Ерленмайерова колба с широко гърло за около 48 часа при 30 °C върху клатещо се сито, въртящо се по дву-инчова окръжност със скорост 250 оборота/минута.

Така приготвената инкубирана растителна среда във втори етадий се използва за засяване на 80 до 115 литра стерилна производствена среда, приготвена както е описано в раздел А. При необходимост се добавя соено масло за контролиране на ценообразуването.

Посятата производствена среда се оставя да ферментира в 165 литров разбъркват биореактор в течение на 5 до 8 дни при температура 28 °C. Подаването на въздух и скоростта на бъркалката се контролират с компютър, за да се поддържа нивото на разтворения кислород на или над 50% насищане с въздух.

ПРИМЕР 3

Изолиране на__А83543А_х

Ферментационната хранителна среда (225 л), приготвена както е описано в Пример 2, беше филтрирана с помощта на филтър ( 1 % Hyfio ) и отделената биомаса беше изплакната с вода (около 50 л). След това в течение на около 1 час биомасата беше разбърквана с метанол (около( 100 л) и филтрирана.

Метаноловия филтрат беше концентриран до обем от около 1 литър. Концентратът беше екстрахиран три пъти с диетилов етер (всеки път с по 1 литър). Комбинираните етерни екстракти бяха концентрирани до обем от около 200 мл.

Част от концентрата (8 мл) беше изследван хроматографски чрез силикагелова колонка ( SP-S Lobar _t размер 8, Е.М· Scienci, а Division of Е.М. Industries, Inc.)·

Тази процедура беше потворена общо 12 пъти (цикли). Използваните уреди и метода на осъществяване на подготвителната хроматография в режим Autoprep {а описани както следва :

Цялата система ВГХ Autoprep се състои от три помпи ЕРХ на фирмата Sainin Rabbit , модул за налягане, колектор на фракции модел 20 1Б на фирмата Gilson , датчик за поглъщане ISC0-V⁴ и компютър Apple Macintosh Plus . Цялата система се подрежда съгласно инструкциите, дадени в Ръководството за ВГХ методи Dynanax на фирма- 65 _Ta Rainin Instrument Company, Inc, Режима ВТХ Autoprep се възползва от автоматизирането на системата, за да се позволи подготвителните разделяния да бъдат провеждани повторно при възможно идентични условия с възможно идентични резултати. Събирането и обединяването на съответните фракции от множество цикли предоставя такава производителност при хроматографиране, че няма необходимост от голяма колонка.

Двете смеси разтворители (А) и (В) се използват равностойно при дебит 8,0 мл/мий.

Системи разтворители

Разтворител	Количество (мл)
А	В
СН^ОН	95	100
сн^си	95	100
HgO	10	-

Използваната изократжчна смес съдържа 60 % разтворител В.

Продължителността на всеки цикъл е 28 минути. Елюатите от първите 16 минути на всеки цикъл се пренебрегват. Следващите елюати се взимат на шест равни интервала, всеки от по 2 минути (16 мл).

Автоматично комбинираните фракции от всеки от 12-те цикъла доведе до шест окончателни фракции (хроматографски разделяния).

Наличието на активни съединения А83543 се определя чрез анализиране на в£яка окончателна фракция за активност на ларвите на комарите и чрез аналитична ВТХ.

След това активните фракции се комбинират съгласно тяхната активност и ВТХ профили и допълнително се пречистват като се използва същата ВТХ Autoprep и система разтворители, но с висока разрешителна способност, подготвителна колонка 21.4 мм х 25 см (фирма Bainin Dynamax ) , предварително опакована със силикагел 8 мк С-18 обърната фаза за установяване на съставките А83543 А, В, С и D

- 66 Съставките А и 0 кристализират от CHgOH/HgO.

МСОП на 83543 е показана на фигура 5; а МСББА. на А83543 е показана на фигура 9.

ПРИМЕР 4

Пречистване на А83543А и ^р

Беше приготвена ферментационна хранителна среда (10 л) както е описано в Пример 2, Раздел А, с изключение на това, че : 1) 200 мл от производствената среда бяха използвани в еднолитрови колби; 2) в производствената среда не беше поставено соено масло и 3) култивирането се осъществяваше при 30° за 4-6 дни. Хранителната среда беше филтрирана. Филтратът, съдържащ 4 мкг А83543А/мл и неустановими количества от А83543В, С и вДял, не беше използван.

Биомасата се измиваше с вода и се извличаше за един час с метанол. Екстрактът (7 л) съдържаше 72 мкг А83543А/мл и 7 мкг от А83543ВДял.

Метаноловият екстракт беше концентриран до обем 5 л и се добавяше към НР-20 (смола) (150 мл, фирма Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan ) във вода )2 л). Тази смес се разбъркваше в течение на един час.

След това сместа със смола НР-20 се поставяше в стъклена колонка. Началния отток и елйга , използващ метанол:вода (1:1, 1 л) не бяха активни. Вторият елюат, използващ метанол:вода (7:3, 1 л) съдържаше микроконценграции на А83543А. Следващият риюат, използващ метанол (1 л), съдържаше А83543А и А83543 D.

Метанолният флвдтгбеше концентриран и смесен с 2 подобни фракции от други състави и концентриран до сухо вещество. Остатъкът беше разтворен в 75 мл метанол:ТН₽ (4:1) и утаен чрез добавяне здв 10 обема ацетонитрил. Сместа беше прецедена и филтарьт беше концентрирало сухо вещество.

Остатъкт беше разтворен в метанол (25 мл) и приложен към колон- 67 ка 5.5-Х 90-см от LH -20 Sephadex (фирма Pharmacia Ю Biotechnology Inc., U.S.A,), приготвена в метанол, събираща и анализираща 125 25-мл фракции като се използва процедурата на ВТХ, описана в Пример 1.

Фракциите, съдържащи желаните съединения, бяха смесени и концентрирани! Остатъкът беше разтворен в метанол (10 мзй и приложен към подготвителна колонка 41.5-мм х 25-см, предварително опакована със силикагел с 8 мкм С-18 обратна фаза (фирма Rain in Dynamax).

Колонката беше третирана в метанол:ацетонитрил:вода (37,5:37,5: :25). След поставяне на пробата колонката се обработваше като се използваше 180-минутен линеен градиент на следните разтворители :

Система от разтворители

Разтворител	Количество (мл)
А	В
СН^ОН	37,5	45
	37,5	45
iy>	25	10

Градиентът беше с цикъл от 100 % к до 100 % В, събирайки 25 мл фракции Фракциите, съдържащи А83543А бяха смесвани, концентрирани до сухо вещество, разтворени в t-BuCH (5 мл) и лиофилизирани, за да се получат 778 ми от чиста А83543А1

ИЧ спектър ва А83543А в СН31^ е показан на фигура 1. Спектъра от МСОП на А83543А е показан на фигура 4; МСББС спектъра на А83543А е показан на фигура 8 (диспергатор РАВ-дитиотреит:дитиоеритрит/5:1/), а спектъра на ЕУМС на А83543А е показан на фигура 10.

Фракциите, съдържащи A83543D , бяха смесени с фракции, свдържащи от 6 подобни състави и бяха концентрирани и хроматографски изследваш, както е описано по-горе, като беше използвана същата колонка, но различни разтворители. Колонката беше обработена в метанол:

- 68 :ацетонитрил:вода (40:40:20$. Системите разтворители, използвани за изследване на колонката при 180-минутен линеен градиент, бяха :

Системи разтворители

Разтворител	Количество (мл)
А	В
СН^ОН	40	95
сн^ои	40	95
	20	10

Фракциите, съдържащи A83543^D кът беше разтворен в t-BuOH A83543D .

ИЧ-спектъра на A83543^D търа на МСОП на A83543D е бяха смесени и концентрирани· Остатъ(5 мл) и лиофилизиран давайки 212 мг в CH3I3 е показан на фигура 2; а спекпоказан на фигура 6·

ЙЕИМЕР 5

Изолиране на съставките В, g, g, Е и J на А83543 и на псевдоагликон А

Ферментационната хранителна среда (8 л), приготвена по процедурата, сходна на описаните в Пример 2 процедури, беше третирана както е описано в Пример 4· фракциите от колонката от LH-20 Sephadex * съдържал^ желаните съединения, бяха смесени със съответните фракции от сходни ферментации. Тъй като съставките Е; Р, б, Н, J и псеедоагликона А се произвеждат в много малки количества, трябваше да се осъществят множество ферментации, за да се получат достатъчни количества за последващо пречистване.

Смес от малките съставки, приготвена по този начин и свдържаща приблизително 1,6 грама твърдо вещество, беше приложена към колонка за ΒΤΣ ( Rainin Dynamax ), предварително опакована ссъс силикагел 8 мкм С-18 с обърната фаза ( , както бе описано в Пример 4. Ко- 69 лонката беше третирана в CH^OHiPH^CN ;В^О (75:75:50), а градиентът беше с цикъл от 100 % за разтворител (А) до 50 %(Б), като се използваха следните системи разтворители :

Системи разтворители

Разтворител	Количество ($)
7 А	В
СН^ОН	75	95
	75	95
ВзР	50	10

събирайки 25-мл фракции· Бяха събрани следните фракции:8

Смес

Фракции

31-44

45-63

64-69

70- 80

81-130

131 - 160

Част от смес 5 (100 мл) беше концентрирана до остатък, разтворен в метанол (1 мл) и приложен в колонка за ВТХ 21«4-мм х 250-мм (Salnin Dynamax ), така както е описано в Пример 3· Колонката беше третирана като се използваше система разтворители (А) от следните системи от разтворители:

Системи разтворители

Количество (%)

Разтворител	А	В
СЕ^ОН	30	95
СН3СН	30	95
Н20 (IK HH4QAC, рИ 5.0)	40	—
HjjO	—	10

- 70 и са използваше 120-минутен линеен градиент от 100 % разтворител (А) до 50 % разтворител (В), събиращ 15 мл фракции при 7.5 мл/мин. Отмиването беше продължено при 50 % (В) за допълнителни 60 минути. Биха

събрани следните фракции :
Смес	Фракция	Съставка
1	37	Б
2	38-48	Е
3	52 - 63	В , 6
4	65-70	Н , J

Теци смеси бяха смесени дъс смеси от други хроматографски цикли използващи подобни изходни материали. Новополучените смеси след това бяха пречистени като се използваше колонкова хроматография, както бе описано noj-rope; обезсолвани със смоли НР-20 като се използваха стандартни методи и концентрирани и лиофилизирани като се получиха

следните съставки :

Съставка	Количество(мг)	Молекулно тегло*1*	щи-
Е	249	717	Фиг. 13
₽	4	717	Фиг. 14
G	104	731	Фиг. 15
Н , J £Исевдо-	87	717	Фиг. 16
агликон А	288	590	Фиг. 3

чрез мас-спектрометрия диск квг

Спектрите МСОП и ЕУМС на А83543А. псевдоагликов са показани на, съответно, фигури 7 и 11.

iwria

Като се използват процедури подобни на тези от Пример 2, Раздел

Приготвяне на А83543 с култура А83543.3

А. Ферментация с разтръскваве в колба

А, културата Saccharopolyspore spinosa KBBL·	18537 се дултивира :
колби със стръскване, но се използва растителна среда С както след
ва:
РАСТИТЕЛНА СРЕДА С
£ъ£Т£В£а_	Кодине£тдо
Ходролизиран с ензим казеин / Ж2 Amine А /	30,0 г
Дрожден екстракт	3,;0 г
MgSQ4 «.	0,2 г
Глюкоза	10,0 г
Глицерин	20 мл
Дейонизирана вода - достатъчно количество до	1 л
pH 6,6, регулира се на 7,0 чрез ЖаОЖ

Б. Фе^манхацвд £ р^абЬрйван_бцо5еаК1О11

Ампулите(с, течен азот)се приготвят с културата както е описано в Пример 2 с помощта на процедурите от Раздел Б. ЕДна ампула се използва за посяване на растителна култура в първи стадий /50 мл от среда С в 250 милилитрови колби/* която се инкубира за около 48-72 часа. Инвубираната култура от първи стадий се използва за посяване /10 мл иновулат/ на култура от втори стадий /400 мл от среда С в двулитрови колби/, която се инкубира за около 48 часа. Инвубираната култура от втори стадий /5 л/ се използва за посяване на производствена среда /115 л/ със следния състав:

Производствена среда II

Съставка^ Кодвдество_/£/д/

Глюкоза 80

Пептонизирано мляко /пептонизиран млечен хранителен 20 продукт на фирмата Sheffield Producte » допълнително непрекъснато подхранване като се започне на четвъртия ден и. може да се използва скорост на захранването от

5/мг/мл/ден/

- 72 Състав^

Кодще&Т£о_/г/д/

Брашно от памуково семе/на фирмата Profla /20

СаСО^5

Метил олеат 30мл/л

Вода - достатъчно количество до 1л /рН преди стерилизацията се регулира на 7,0 чрез КаОН/

Посятата производствена среда се оставя да ферментира в 165

литров биореактор с разбъркване за около 8 до 10 дни или по-дълго при температура 30 °C. Нивата на разтворения кислород се регулират с помощта на компютърни системи, които са настроени да ги поддържат над 50 % от насищането с въздух, както е описано в Пример 2, РазделБ.

ПРИМЕР 7

Приготвяне на А83543 с култура А83543.5

А. Фермацхацца £. додбд &ъ& £да&1щаае_

Като се използват процедури подобни на тези от Пример 2, Раздел с

А„ културата Sac char op oly врага spiaoca 1Ш 18539 се култивира в стрьскващи се колби като се използва растителна среда В.

Б. ^ермадхациа. а ^иррхактрр_с_разбъркьадеи

Ампулите от течен азот с културата се приготвят както е описано в Пример 2»_; използвайки общите процедури от Раздел Б. Щцна ампула се използва за посяване на растителна култура от първи стадий /50 мл от среда В в 250 милилитрови колби/, която се инвубира за 48 до 72. часа. Инкубираната култура от първи стадий се използва за посяване /10 мл инокулат/ на дултура от втори стадий /400 мл от среда Б в двулитрови колби/, която се инкубира за около 48 часа. Ийкубираната култура от втори стадий /2 л/ се използва за засяване на производствена среда /115 л/ с един от следните състави:

- 73 ПРОИЗВОДСТВЕНА СРЕЩА Ш

Съставка Количество / г/л /

Глюкоза	80
Растителн протеин, частично хидролизиран с	20
ензим / shaftone Н/
Брашно от пацуково семе / Prafio/	10
CaCOg	5
Метилолеат	30 мл/л
Вода - достатъчно количество до	1 л
/преди стерилизация pH се регулира на 7,0 чрез	ЖН40Ж /

ПРОИЗВОДСТВЕНА СРЕЩА IV

Съставка Количество /' % /

Глюкоза8

Брашно от пакуково семе /Prafio/3

Пап тонизирано мляко /пептонизиран млечен хранителен 2 продукт/

Течност за натопяване на семена1

СаСОд /технически чист/0,5

МетилойОат3,0

Вода - достатъчно количество до1 л /преди стерилизация pH се регулира на 7,0 чрез ЖаОТ /

Посятата производствена среда се оставя да ферментира в 165 литров биореактор с разбъркване за около 8 до 10 дни или по-дълго при температура 30 °C. Нивата на разтворения кислород се регулират по начина, описан в Пример 6.

пр» а

Приготвяне на AS3543 с култура А83543.4

Като се използват процедурите, посочени в Примери 2 и 7, културата Sac char opaly ерата spinaaa ПВЬ 18538 се култивира, но с по ^м°ЩТа на растителна среда Б. и производствена среда ΠΙ.

- 74 ПРИМЕР 9

Ферментационната хранителна среда се приготвя както е описано в Пример 3. А83543 се озделя от хранителната среда както следва :

1. Добавя се еквивалентен обем ацетон към храните-лната среда и се филтрира като се използва керамичен филтър или филтърно устройство с филтърна преса.

2. Нагласете филтрираната хранителна среда на pH 10..

3. Добавя се етилацетат / 1/2 - 1/2 от обема на хранителната среда/.

4. Озделя се етилацетатния екстракт чрез декантиране на несмесваемата водна порция; и се концентрира етилацетатния екстракт до 1/2 от обема с помощта на вавуум.

5. Извлича се концентрирания разтвор етилацетат с водна 0,1 М тартарова киселина /1/2 обем/ и се отделят фазите.

6. Озделя се разтворимия етилацетат от водната фаза чрез ваку~ умно /5 % приблизително/ изпаряване. Концентрира се водния разтвор ката се използва обратна осмоза.

7. Регулира се концентрирания воден разтвор на 10-11 pH с натриев хидроокис.

8. Озделя се утайката чрез филтиране, измива се с вода и се изсушава с вавуум като се получава А83543.

ПРИМЕР Ю

Псевдоагликон А83543А

Проба от А83543, сздържаща главно съставка А /около 100 мг/ беше разтворена в метанол /5и мл/, вода /2 мл/ и концентрирана Hd /3 мл/. Този разтвор беше концентриран до сухо вещество при 50 °C. Остатъкът беше третиран на два пъти с диетилов етер /по 200 мл всеки път/ и неразтворимия материал беше отделен. Смесените етерни разтвори, сздържащи непречистен псевдоагликон, бяха концентрирани до су

- 75 хо вещество. Остатъкът беше разтворен в метанол /20 мл/ и пречистен с помощта на описаната в Пример 3 ΒΊΧ система Jtutoprep ” до получаването на чист псевдоагликон А83543А,

ПРИМЕР 11

Псевдоагликонът A83543D се приготвя от А83543В като се изпрлзват процедури като тези, описани в Пример 10.

ПРИМЕР 12

Следните рецептури са типични за инсектидните състави, използва

ни в това изобретение.

А, Водна суспензия

А83543А 12,5 %

Texgltoi тшг-6» /нейонно повърхностно-активно веще- 1,0 % ство/

Ввадт! 200· /силициев двуокис/ 1,0$

AF-ЮО /противоразпенващо вещество на основата на 0,2$ силиций#

Разтвор ксантан /2 $/ 10,0$

Макож 10 /10 мола повърхностно-активно вещество9,0 етиленов окис нонилфенол/

Вода 66,3$

В, Екулгицуем концентрат

А83543» 12,4$ •Вххов-200· /нафталинов разтворител/ 83,6$ •Sttziaml Н /ннейонна/анйонна повърхностно-активна 2,0 % смес / •Toxienl В* / нейонна/анйонна повърхностно-активна 2,0 % смес/

ПРИМЕР 13

Следните примерни състави показват вида на рецептурите, които се използват съгласно метода на настоящото изобретение.

A, Хранителна добавка

А83543А

Оризови люспи

Лек' нефт

Б, Хранителна добавка

А83543Е

Люцерново брашно

Глина на прах

Меласа

B, Суспензия

А83543А

Нафталинсулфонатна сол

Нейонно повтрхностно^активно

Силициев двуокис

Вода

Г. Инфузивен разтвор

А83543А

Нейонно повърхностно-активно ПропиленгЛикол

Вода

Д. ИнфузивЙ&суопбнзия

А83543В

Нейонно повърхностно-активно Лек нефт

Е, Инжекционен разтвор

А83543А

Пропиленгликол %

% ί

	5
вещество	5
	1
	59
	20 %
вещество	0,8
	15
	64,2
	10 %
вещество	1
	89

% %

- 77 Ж, Инжекционна суспензия

А83543С	25
Пропиленгликол	15
Вода	60
3. Инжекционна суспензия
A83543D	30
Поливинилпиролвдон	2
Вода	68

- 78 1. Инсектициден или акарициден че включва като активна съставка

А83543 съгласно формула 1 :

състав, характеризиращ се с това, до 90 тегловни % съединение

Claims (9)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ от кздето В е Н или група, избрана от (CH3)NH (d) pl В? R⁵ И К⁶ са водород или метил;

   - 79 е метил или етил или фитологично приемлива сол от тях, кеде— то R не е водород; свързан с един или повече фитологично приемливи носители или разтворители.
2. 2. Инсектициден или акарициден състав съгласно патентна претенция L, характеризиращ се с това,, че съединението А83543 по форцула X е такова съединение, в което R , r\ R?, R^, R^ и Ηθ присъстват в една от следните комбинации :

   R R1 R³ R⁴ R» R⁶ 5 (а) Ме Н Et Me Me (Ъ) Ме н Et Me Me (с) Ме н Et Me Me (а) Ме Ме Et Me Me (а) Ме Н Me Me Me 10 (а) Н Н Et Me Me' (d) Ме Н Et Me Me (а) Ме Н Et H Me (а) Ме И Et Me H Н Ме Н Et Me Me 15 И Ме Ме Et ~ Me Me и Ме Н Me Me Me н Н Н Et Me Me и Ме н Et H Me н Ме и Et Me H 20 или сол с киселинна добавка , В която R не e водород.
3. 3. Инсектициден и акарициден състав съгласно която и да е от патентни претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че съединението А83543 е такова,, в което : R е група /а/; R^, R? и Ь? = СН^ ;

   = Н,а - етил.
4. 4. Инсектициден или акарициден състав съгласно която и да е от патентни претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че съединението А83543 е такова, в което: R е група /а/; R¹, ί³, ί⁵ и Б? · 0¾

   - 80 и χ* - етил или негова сол с киселинна добавка.
5. 5. Метод, за потискане на насекомо или кърлеж, характеризиращ се с това, че върху жизненото пространство /локус/ на насекомото или кърлежа се прилага ефективно количество от съединението А83543 или негова фитологично приемлива сол, както е определено в която и да е от патентните претенции от 1 до 4.
6. 6. Ектопаразитициден състав, характеризиращ се с това, че включва като активна съставка от 0,00005 др 95 тегловни % от съединението А83543 по формула I,както е посочено в патентна претенция 1 или негова физиологично приемлива сол, свързана с един или повече физиологично приемливи инертни носители или разтворители.
7. 7. Метод, за контролиране на популацията на ектопаразитни насеко- ми, които се хранят с кръвта на гостоприемника, характеризиращ се с прилагането спрямо гостоприемника на ефективно количество от съединението А83543 или негова физиологично приемлива сол, както се определя от патентна претенция 1.
8. 8. Метод за получаване на съединение А83543 по формула 1, съгласно която и да е от патентни претенции от 1 до 4, характеризиращ се с култивирането на щама Saccharopolyврека epdasea , селекциониран от коте 18395, ШЬ 18537, пвь 18538 или ЮИ 18539 или техен цутант, произвеждащ А83543 в хранителна среда, съдържаща усвояеми източници на въглерод, азот и неорганични соли в условията на аеробна ферментация в дълбока хранителна среда до получаването на извлекаемо количество А83543..
9. 9. Биологически чиста култура, съгласно претенция 8, Saccharopolyspora spinosa, характеризираща се с това, че е селекционирана от NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 ИЛИ NRRL 18539 ИЛИ ΤβΧβΗ МутаНТ, продуцираща А83543 .