ES2796379T3 - Receptor nicotínico de acetilcolina de Rhipicephalus y plaguicida que actúa sobre el mismo - Google Patents

Receptor nicotínico de acetilcolina de Rhipicephalus y plaguicida que actúa sobre el mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2796379T3
ES2796379T3 ES17703670T ES17703670T ES2796379T3 ES 2796379 T3 ES2796379 T3 ES 2796379T3 ES 17703670 T ES17703670 T ES 17703670T ES 17703670 T ES17703670 T ES 17703670T ES 2796379 T3 ES2796379 T3 ES 2796379T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
rhipicephalus
polypeptide
nucleic acid
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17703670T
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas Turberg
Melania Akköse
Miral Puinean
Martin Williamson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Animal Health GmbH
Original Assignee
Bayer Animal Health GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Animal Health GmbH filed Critical Bayer Animal Health GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2796379T3 publication Critical patent/ES2796379T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43527—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from ticks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/22—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom rings with more than six members
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9, o un fragmento de la misma, que codifica un fragmento funcional de una subunidad del receptor nACh.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptor nicotínico de acetilcolina de Rhipicephalus y plaguicida que actúa sobre el mismo
Referencia a un listado de secuencias
El presente documento incluye un listado de secuencias.
Campo de la invención
Se desvela una subunidad del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR, siglas del inglés nicotinic acetylcholine receptor) de garrapatas de Rhipicephalus. También se desvela un procedimiento de identificación de un compuesto capaz de modular la actividad de dicha subunidad del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) de garrapatas de Rhipicephalus.
Antecedentes
El siguiente análisis de los antecedentes, se proporciona simplemente para ayudar al lector a comprender la invención y no se admite que describa o constituya un estado de la técnica anterior a la presente invención.
Desde el punto de vista económico, médico y veterinario, una gran cantidad de garrapatas del género Rhipicephalus son importantes porque son vectores de organismos patógenos. Las enfermedades transmitidas por garrapatas de este género incluyen fiebre de la costa este, anaplasmosis, babesiosis, rickettsiosis, fiebre botonosa, enfermedad de Lyme, fiebre Q, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas y fiebre hemorrágica de Crimea-Congo. Aunque la mayor parte de los miembros del género Rhipicephalus son nativos de África tropical, algunas garrapatas, como la garrapata canina marrón (Rhipicephalus sanguineus), también denominada garrapata de las perreras o garrapata canina pantropical, y Rhipicephalus bursa, también se encuentran en el sur de Europa.
Un miembro importante del género Rhipicephalus es Rhipicephalus microplus (anteriormente Boophilus microplus), que se considera que es la garrapata más importante del ganado a nivel mundial. Rhipicephalus microplus puede encontrarse en una variedad de hospedadores tales como ganado bovino, búfalo, caballo, burro, cabra, oveja, ciervo, cerdo, perro, así como en algunos animales salvajes. La garrapata afecta particularmente al ganado bovino en las regiones tropicales y subtropicales. Las infestaciones pesadas en los animales pueden disminuir la productividad y dañar las pieles. R. microplus también puede transmitir babesiosis o "fiebre del ganado bovino" (causada por Babesia bigemina y Babesia bovis) y anaplasmosis (causada por Anaplasma marginale). Otro vector de babesiosis es Rhipicephalus annulatus.
Ambas especies, R. microplus y R. annulatus, fueron básicamente erradicadas de los Estados Unidos en 1943, sin embargo, existen en México y, a pesar de una zona de cuarentena permanente a lo largo de la frontera mexicana, son frecuentes brotes en la frontera mexicana. R. microplus también ha planteado un problema importante para la industria ganadera en el norte de Australia durante casi 100 años. En la actualidad, las garrapatas se limitan a una zona del norte y este de Australia a través del movimiento controlado del ganado bovino y por las condiciones climáticas que limitan su propagación.
En América Central y del Sur, cerca de 175 millones de bovinos están expuestos a R. microplus, lo que corresponde a aproximadamente un 70 % del ganado bovino criado en esta región. Como ejemplo adicional, R. microplus es una de las garrapatas más importantes que infestan a animales que producen productos de lácteos de la India, particularmente de la región de Punjab. Se sugirió que R. microplus se introdujo en el Este y en Sudáfrica desde Madagascar, donde originalmente había llegado con ganado bovino del sur de Asia. En Sudáfrica, R. microplus se ha establecido ahora, entre otras, en zonas a lo largo de las costas sur y este de las provincias del Cabo occidental y oriental, y también está presente en las regiones costeras de Mozambique, Tanzania y Kenia. La garrapata también se encuentra en partes de las provincias orientales y centrales de Zambia, en todo Malawi y al este y norte del lago Malawi en Tanzania. R. microplus también se encuentra en África occidental, principalmente en Costa de Marfil, Benin, Burkina Faso y Mali. Existen serias preocupaciones de que esta garrapata podría extenderse a toda la región de África occidental.
La garrapata del ganado bovino más común y extendida en África es Rhipicephalus decoloratus, la garrapata azul africana. Similar a R. microplus, el ganado bovino es el principal hospedador de esta garrapata, pero también se alimenta en caballos, burros, ovejas, cabras y los sitios de alimentación preferidos de todas las fases en el ganado bovino son, el lomo, las extremidades superiores, el cuello, los hombros, la papada y el vientre. La garrapata es, hasta cierto punto, responsable de la transmisión de la babesiosis, anaplasmosis (causada por Anaplasma marginale) y teileriosis (causada por Borrelia theileri) en el ganado bovino, en ovejas, cabras y caballos en África occidental, África del este y África del sur. Los elands pueden ser portadores asintomáticos de A. marginale y por tanto podrían servir como un reservorio de infección para el ganado bovino doméstico. Se sospecha que R. decoloratus es también un vector de Babesia trautmanni, causante de la babesiosis porcina.
Aparte de las enfermedades que transmiten, tanto R. decoloratus como R. microplus pueden tener un impacto significativo en la producción ganadera. Algunos de los efectos más relevantes incluyen irritación, pérdida de peso y daños en el cuero. Comparando vacas Holstein-Friesian de media lactancia infestadas con R. microplus durante 15 semanas, y vacas de control no infestadas, se informa desde Australia, que durante el período de prueba, las vacas de control produjeron 2,86 l más de leche y 0,14 kg más de materia grasa al día y habían ganado 10,6 kg más de peso vivo que las vacas infestadas.
El vector principal de Theileria parva, causante de la fiebre de la costa este y de la enfermedad de Corridor en el ganado bovino, es un miembro más del género Rhipicephalus, concretamente Rhipicephalus appendiculatus, la garrapata marrón de la oreja. Se plantea la hipótesis de que la saliva de R. appendiculatus contiene una toxina y si un gran número de garrapatas infestan a un animal, esta toxina puede interferir con los procesos inmunitarios del hospedador, produciendo una pérdida de condición y brotes de babesiosis, anaplasmosis y cowdriosis (hidrocarditis) en animales que anteriormente eran inmunes a estas enfermedades. Las infestaciones graves pueden conducir al arrugamiento de la oreja y pueden producirse infestaciones de la oreja con las larvas de Chrysomya bezziana. La garrapata también es responsable de la transmisión de Rickettsia conorii a seres humanos.
Otro miembro más del género Rhipicephalus, concretamente R. zambeziensis, es el vector de la enfermedad de Corridor (causada por Theileria parva), de la teileriosis bovina benigna (causada por Theileria taurotragi) y de la erliquiosis causada por Erhlichia bovis).
El control químico utilizando acaricidas es clave en los esfuerzos para erradicar el género Rhipicephalus, tal como R. microplus y R. decoloratus, sin embargo, las garrapatas han desarrollado resistencia a la mayoría de los agentes utilizados hasta ahora, tales como los organofosfatos, piretroides, amidinas y lactonas macrocíclicas. Por tanto, sería ventajoso tener más medios disponibles que puedan servir para controlar a las garrapatas del género Rhipicephalus.
Sumario
Se puede considerar que la presente divulgación está relacionada, en general, con el control de uno o más ectoparásitos de Rhipicephalus al proporcionar la secuencia de ácido nucleico y el polipéptido así codificado del nAChR de Rhipicephalus y por tanto proporcionar un procedimiento para identificar los compuestos adecuados para el control de las garrapatas del género Rhipicephalus
La molécula de ácido nucleico según la presente invención contiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 0 SEQ ID NO: 9. La molécula de ácido nucleico también puede ser un fragmento de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 9, al tiempo que dicho fragmento codifica un fragmento funcional de una subunidad del receptor nACh.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico según la invención, contienen una o más regiones reguladoras tales como un promotor. Dicha región reguladora respectiva está unida operativamente a las secuencias anteriores.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido. El polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico de la secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 9.
El polipéptido puede expresarse mediante un vector que incluya las secuencias de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 9.
El polipéptido es una subunidad de un receptor nACh, que es una subunidad funcional del receptor nACh. En algunas realizaciones, el polipéptido según la invención, está incluido en un homopentámero. Del mismo modo, puede considerarse que el homopentámero respectivo define el receptor nACh.
En realizaciones en las que el polipéptido define un fragmento de una subunidad del receptor nACh, este fragmento generalmente se define por una secuencia de aminoácidos de una longitud continua.
Las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, que son secuencias de nucleótidos seleccionadas del listado que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9, son heterólogas a muchas células hospedadoras en las que se pueden transfectar para la expresión de los respectivos polipéptidos codificados de ese modo y, por lo tanto, estas secuencias heterólogas de ácido nucleico pueden incluirse en una célula hospedadora que contenga entonces una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 9. La secuencia heteróloga de ácido nucleico también puede ser un fragmento funcional de dicha secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 9. Dicho fragmento codificado por la secuencia heteróloga de ácido nucleico es una parte de una subunidad funcional del receptor nACh.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de identificación de un compuesto capaz de modular la actividad de un receptor nACh de Rhipicephalus. El procedimiento incluye poner en contacto un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del listado que consiste en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9, con un compuesto que se sospecha que modula la actividad de un receptor nACh de Rhipicephalus. El procedimiento incluye además detectar la actividad del polipéptido según el tercer aspecto.
El procedimiento puede ser un procedimiento in vitro. En dicho procedimiento, el polipéptido puede incluirse en una célula hospedadora. Como ejemplo adicional, el procedimiento también puede basarse en el uso de un polipéptido enriquecido. El procedimiento también puede basarse en el uso de un polipéptido aislado o purificado. El polipéptido también puede, por ejemplo, reconstituirse en una capa lipídica, tal como una doble capa lipídica.
La detección de la actividad del polipéptido se basa generalmente en el uso del polipéptido según la presente invención, ya sea incluido en una célula hospedadora o de otra manera, en forma de un pentámero. El polipéptido puede usarse en forma de un homopentámero.
La detección de la actividad del polipéptido de acuerdo con esto puede incluir detectar una corriente, tal como una corriente interna, de un catión. Como ejemplos de un catión adecuado se incluyen, pero sin limitación, Na+ y K+. La detección puede realizarse, por ejemplo, mediante una medición del voltaje. La detección puede realizarse, por ejemplo, a través de una técnica de detección espectroscópica, fotoquímica, fotométrica o fluorométrica adecuada, generalmente en combinación con un colorante. La detección de la actividad del polipéptido puede incluir una medición de control. Dicha medida de control puede basarse en el uso de un ligando del polipéptido según el tercer aspecto. Un ligando del polipéptido es, por ejemplo, acetilcolina. Además, una medición de control puede basarse en el uso de un compuesto que se sabe que no causa ninguna corriente cuando se pone en contacto con el polipéptido. Una medición de control también puede basarse en el uso de un compuesto que se sabe que bloquea la actividad del polipéptido.
La detección de la actividad del polipéptido puede incluir comparar la actividad detectada del polipéptido, cuando se pone en contacto con un compuesto que se sospecha que modula la actividad de un receptor nACh de Rhipicephalus, con una medición de control. La detección de la actividad del polipéptido también puede incluir comparar la actividad detectada con un valor umbral. Un valor umbral respectivo puede ser un valor predeterminado.
El procedimiento puede ser un procedimiento para determinar si un compuesto tiene actividad agonista o antagonista en relación con un receptor nACh de Rhipicephalus.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la situación y clasificación de las diversas subunidades de los receptores nicotínicos de acetilcolina de R. microplus.
La Figura 2 representa la secuencia de ADNc clonada de nAChRa5 de R. microplus (Rma5), SEQ ID NO: 1. La secuencia incluye la metionina START (de inicio) y el codón STOP (de terminación).
La Figura 3 representa la secuencia de aminoácidos de la secuencia clonada de nAChRa5 de R. microplus(Rma5), SEQ ID NO: 2. Los bucles esperados en el polipéptido plegado se indican con líneas, las regiones transmembrana (TM) esperadas se indican con recuadros.
La Figura 4 representa la secuencia de ADNc clonada de una primera variante de corte y empalme de nAChRa6 de R. microplus (Rma6), SEQ ID NO: 3, incluyendo la metionina START y el codón STOP. La región subrayada representa la diferencia con una segunda variante de corte y empalme identificada, representada en la figura 16.
La Figura 5 representa la secuencia de aminoácidos de la secuencia clonada de la primera variante de corte y empalme de nAchRa6 de R. microplus (Rma6), SEQ ID NO: 4. Los bucles esperados en el polipéptido plegado se indican con líneas, las regiones transmembrana (TM) esperadas se indican con recuadros.
La Figura 6 representa los resultados de experimentos sobre la formación de receptores nicotínicos de acetilcolina funcionales de R. microplus en ovocitos de Xenopus. El ADNc de longitud completa de subunidades identificadas de nAChR de R. microplus, se clonaron en el vector pCR4 o pGEMHE, y la identidad de la(s) subunidad(es) respectiva(s) se evaluó mediante secuenciación. El ARNc se sintetizó y se inyectó en ovocitos desfoliculados de Xenopus, y después de 72 horas, se analizó la presencia de receptores funcionales, utilizando la técnica de fijación de voltaje de dos electrodos.
La Figura 7 muestra la expresión de nAChRa5 y nAChRa6 de R. microplus durante las fases de vida de R. microplus. La expresión génica se normalizó en función de la expresión génica del canal de sodio.
La Figura 8 representa la secuencia completa de ácido nucleico de nAChRa5 de R. microplus (Rma5), SEQ ID NO: 20, como se identifica en el transcriptoma de R. microplus. La secuencia incluye las UTR (untranslated regions, regiones no traducidas) 5' y 3'. Los extremos 5' y 3' se confirmaron después de amplificación RACE (siglas del inglés, Rapid Amplification of cDNA Ends, amplificación rápida de extremos de ADNc), clonación y secuenciación.
La Figura 9 representa la secuencia completa de ácido nucleico de nAChRa6 de R. microplus (Rma6), SEQ ID NO: 21, ensamblada después de amplificación RACE en los extremos 5' y 3', clonación y secuenciación. La secuencia incluye las UTR (untranslated regions, regiones no traducidas) 5' y 3'.
La Figura 10 muestra curvas de respuesta a la dosis de acetilcolina y espinosad en ovocitos de Xenopus que expresan homopentámeros de Rma5 (subunidades de SEQ ID NO: 2).
La Figura 11A representa un trazado representativo que muestra una respuesta de un homopentámero de Rma5 (subunidades de SEQ ID NO: 2) a la aplicación de acetilcolina (ACh, 300 j M).
La Figura 11B representa un trazado representativo que muestra una respuesta de Rma5 de R. microplus a la aplicación de espinosad (30 |jM).
La Figura 12A muestra una respuesta representativa de Rma6 a ACh (10 j M) antes de la aplicación previa de 30 j M de espinosad.
La Figura 12B muestra una respuesta representativa de Rma6 a ACh (10 j M) después de la aplicación previa de 30 j M de espinosad.
La Figura 13 representa una curva de respuesta a la dosis de acetilcolina en ovocitos de Xenopus que expresan homopentámeros de Rma6 (subunidades de SEQ ID NO: 4).
La Figura 14A representa respuestas representativas de homopentámeros de Rma6 a ACh (10 j M) después de una aplicación previa de espinosad durante 15seg. Los valores indicados son la concentración de espinosad utilizada en la aplicación previa durante 15 seg en j M. Se utilizaron las siguientes concentraciones: 0 j M, 0,1 j M, 0,3 j M, 1 j M, 3 j M, 10 j M y 30 j M. La Figura 14B representa una
trazados para facilitar la referencia. Se muestran trazados de las siguientes concentraciones: 0 j M, 0,3 j M, 3 j M y 30 j M.
La Figura 15 muestra una respuesta representativa de Rma6 a imidacloprid (100 j M).
La Figura 16 representa la secuencia de ADNc clonada de una segunda variante de corte y empalme de nAChRa6 de R. microplus (Rma6), SEQ ID NO: 5, incluyendo la metionina START y el codón STOP. La región subrayada representa la diferencia con la primera variante de corte y empalme identificada, representada en la figura 4.
La Figura 17 representa la secuencia de aminoácidos de la secuencia clonada de la segunda variante de corte y empalme de nAChRa6 de R. microplus (Rma6), SEQ ID NO: 6. La región subrayada difiere de la primera variante de corte y empalme identificada, representada en la figura 5.
Descripción detallada
En el presente documento se proporcionan medios para explorar la idoneidad de compuestos como agentes plaguicidas para el control de garrapatas de Rhipicephalus. En particular, se proporciona un sistema de ensayo que se basa en técnicas que están bien establecidas en la materia. Además, se proporcionan compuestos fácilmente disponibles y obtenibles que son adecuados para el control de garrapatas de Rhipicephalus. También se proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican subunidades del receptor nicotínico de acetilcolina y polipéptidos que representan dichas subunidades de receptores.
Definiciones
Salvo que se indique de otra manera, los siguientes términos o expresiones que se utilizan en el presente documento, que se incluyen en la descripción y en las reivindicaciones, tienen las definiciones dadas a continuación.
La palabra "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere a un valor que está en un intervalo de error aceptable para el valor particular, determinado por un experto en la materia, que dependerá, en parte, de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, según la práctica en la materia, "aproximadamente" puede significar un valor de 1 o mayor de 1, que se incluye en una desviación estándar. El término "aproximadamente" también se utiliza para indicar que la cantidad o el valor en cuestión puede ser el valor designado o algún otro valor que sea aproximadamente el mismo. Como se describe en el presente documento, la frase pretende transmitir que valores similares promueven resultados o efectos equivalentes. En este contexto, "aproximadamente" puede referirse a un intervalo superior y/o inferior de hasta el 10%. En algunas realizaciones, la palabra "aproximadamente", se refiere a un intervalo que está por encima y por debajo de un determinado valor que es de hasta el 5 %, tal como de hasta el 2 %, hasta el 1 % o hasta el 0,5 % por encima o por debajo de ese valor. En una realización, "aproximadamente" se refiere a un intervalo de hasta el 0,1 % por encima y por debajo de un valor determinado.
El término "detectar" o "detectando", así como el término "determinar" o "determinando", cuando se usa en el contexto de una señal, tal como una corriente, se refiere a cualquier procedimiento que pueda usarse para detectar el flujo de iones. La detección puede realizarse tanto a nivel cualitativo como cuantitativo. Cuando en el presente documento, las palabras "detectar", "detectando", "determinar" o "determinando", se usan en combinación con las palabras "nivel", "cantidad" o "valor", se entiende que, generalmente, se refieren a un nivel cuantitativo más que cualitativo. Por consiguiente, un procedimiento, como se describe en el presente documento, puede incluir una cuantificación de una corriente.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto, tal como un compuesto plaguicida, es una cantidad - ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis - suficiente para proporcionar un beneficio deseado en el control de plagas, en particular, para reducir el número de organismos causantes de plagas en un sujeto, tal como un animal. Un beneficio respectivo también puede ser una reducción en la reproducción o viabilidad de un organismo causante de plaga, o un beneficio en el tratamiento o gestión de una afección patológica no deseada, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados a la presencia de la afección. Dicha afección puede estar asociada a una infestación o ser el resultado de la misma.
Se entiende que la expresión "consiste esencialmente en" permite la presencia de componentes adicionales en una muestra o una composición, que no influyen en las propiedades de la muestra o de una composición. Como ejemplo ilustrativo, una composición farmacéutica puede incluir excipientes si esencialmente esta consiste en un principio activo.
La expresión "que expresa" y el término "expresión", en referencia a un polipéptido, deben entenderse en el sentido habitual utilizado en la materia. Una célula expresa un polipéptido mediante la transcripción de un ácido nucleico en ARNm, seguido de la traducción a un polipéptido inicial, que se pliega y posiblemente además se procesa para obtener un polipéptido maduro. Los polipéptidos mencionados en la presente divulgación, también se transportan a la superficie de la célula respectiva y se integran en la membrana celular. Por lo tanto, la afirmación de que una célula está expresando dicho polipéptido, indica que el polipéptido se encuentra en la superficie de la célula e implica que la maquinaria de expresión de la célula respectiva, ha sintetizado el polipéptido.
Con respecto al propio proceso biológico respectivo, el término "expresión" y las frases "expresión génica" o "que expresa", se refieren a todas las rutas reguladoras que transforman la información codificada en la secuencia de ácido nucleico de un gen, primero en ARN mensajero (ARNm) y después en un polipéptido. Por consiguiente, la expresión de un gen incluye su transcripción en un ARNhn (ARN heterogéneo nuclear) primario, el procesamiento de este ARNhn en un ARN maduro y la traducción de la secuencia de ARNm en la secuencia de aminoácidos correspondiente del polipéptido. En este contexto, también se observa que la expresión "producto génico" no sólo se refiere a un polipéptido, incluido, por ejemplo, un polipéptido maduro (incluida una variante de corte empalme del mismo) codificado por ese gen y a una proteína precursora respectiva cuando proceda, sino también al ARNm respectivo, que puede considerarse como el "primer producto génico" durante el transcurso de la expresión génica.
Por "fragmento", en referencia a un polipéptido, tal como una molécula receptora, se entiende cualquier secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido correspondiente, siempre que sea más corta que la secuencia de longitud completa y sea capaz de realizar la función de interés de la proteína, en el caso de un receptor ionotrópico en forma de un canal iónico dependiente de ligando, la difusión de iones, incluyendo una corriente resultante, a través del canal, en respuesta a un ligando específico.
Un nAChR (receptor nicotínico de acetilcolina) funcional, como se usa en el presente documento, es un receptor que muestra una actividad de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR), según lo evaluado por cualquier técnica de detección in vitro o en vivo desvelada en el presente documento o conocida por los expertos en la materia. La posesión de cualquier actividad de este tipo, que pueda evaluarse mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia y que se proporciona en el presente documento, es suficiente para designar un receptor como funcional. Cuando se hace referencia a una subunidad funcional de un nAChR, una subunidad respectiva tiene la capacidad de combinarse con otras subunidades y/o fragmentos de subunidades funcionales, de un nAChR, formando así un nAChR funcional. Como procedimientos para detectar la proteína del nAChR y/o la actividad del mismo, se incluyen, por ejemplo, ensayos que miden la unión de la nicotina, el flujo de iones 86Rb, el flujo de entrada de Ca2+, y/o la respuesta electrofisiológica de células que contienen una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una o más subunidades del receptor. Dado que no todas las combinaciones de las subunidades alfa y beta pueden formar receptores funcionales, para caracterizar completamente una subunidad particular y las células que la producen, se deben someter a ensayo numerosas combinaciones de subunidades alfa y beta. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, "funcional", con respecto a un nAChR recombinante o heterólogo, o a un fragmento del mismo, significa que el canal receptor tiene la capacidad de proporcionar y regular la entrada de iones permeables al nAChR (receptor nicotínico de acetilcolina), tales como, por ejemplo, Na+, K+, Ca2+ o Ba2+, en respuesta a un estímulo y/o a ligandos de unión con afinidad conocida por el receptor. Habitualmente, será ventajoso, seleccionar un entorno en el que dicha actividad del nAChR pueda diferenciarse de cualquier actividad del nAChR endógeno que pueda producir la célula hospedadora, por ejemplo, a través de medios electrofisiológicos, farmacológicos y otros medios conocidos por los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, una molécula "heteróloga" de ácido nucleico o una secuencia "heteróloga" de ácido nucleico, es una molécula y secuencia de ácido nucleico, respectivamente, que no aparece de manera natural como parte del genoma de la célula en la que se encuentra, o una secuencia de ácido nucleico que se encuentra en una ubicación o ubicaciones en el genoma que difiere de la que aparece en la naturaleza. Habitualmente, una molécula y/o secuencia heteróloga de ácido nucleico lleva, o es, una secuencia que no es endógena a la célula hospedadora y se ha introducido artificialmente en la célula. La célula que expresa una secuencia heteróloga de ácido nucleico puede contener ADN que codifica los mismos productos de expresión, o diferentes productos de expresión. Una secuencia heteróloga de ácido nucleico no necesita expresarse y puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora o mantenerse de manera episómica.
El término "inhibir" una garrapata se refiere a una disminución en el número de garrapatas vivas, independientemente de su fase de vida, o una disminución en el número de garrapatas adultas, larvas ninfas o huevos viables. El grado de reducción alcanzado por un compuesto depende, por supuesto, de la tasa de aplicación del compuesto, del compuesto particular utilizado y de la especie de garrapata diana. Se debe utilizar al menos una cantidad inactivadora.
El término "aislado(a)" indica que la(s) célula(s) o el (los) péptido(s) o la(s) molécula(s) de ácido nucleico, se ha(n) eliminado de su entorno fisiológico normal, por ejemplo, una fuente natural, o que se sintetiza un péptido o ácido nucleico. El uso del término "aislado(a)" indica que una secuencia de origen natural se ha eliminado de su entorno celular normal (es decir, cromosómico). Por tanto, la secuencia puede estar en una solución acelular o colocada en un entorno celular diferente. Una o más células aisladas pueden incluirse, por ejemplo, en un medio diferente, tal como una solución acuosa que se proporcionó originalmente, o colocarse en un entorno fisiológico diferente. Habitualmente, las células, los péptidos o la(s) molécula(s) de ácido nucleico aislados, constituyen una fracción más alta de las células, péptidos o molécula(s) de ácido nucleico totales presentes en su entorno, por ejemplo, solución/suspensión según corresponda, que en el entorno del que fueron recogidos. Un polipéptido o una molécula de ácido nucleico aislado es un oligómero o un polímero de aminoácidos (2 o más aminoácidos) o nucleótidos acoplados entre sí, incluyendo un polipéptido o una molécula de ácido nucleico que se aísla de una fuente natural o que se sintetiza. El término "aislado" no implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos o cadena de nucleótidos presente, sino que carezca esencialmente, por ejemplo, con una pureza de aproximadamente 90-95 % o mayor, por ejemplo, de material que no sea de aminoácido ni de ácido nucleico, respectivamente, asociado con ello de manera natural.
El término "lugar", cuando se utiliza en relación con las garrapatas, se refiere al entorno en el que vive una garrapata o en el que están presentes sus huevos, larvas o ninfas, incluido el aire que las rodea, el alimento que ingieren o los objetos o materiales con los que se pone en contacto. Un compuesto activo puede aplicarse, por ejemplo, a la hierba donde viven las larvas. Las garrapatas adultas pueden controlarse aplicando el compuesto activo al animal que está infestado, por ejemplo, por vía tópica. La administración oral de los compuestos desvelados en el presente documento puede realizarse mezclando el compuesto en el alimento o en el agua que bebe el animal, en complementos vitamínicos o minerales, o administrando formas de dosificación oral tales como brebajes, comprimidos, bolos, bloques salinos sal o cápsulas. Se contempla que los compuestos también podrían ser útiles para proteger textiles, papel, grano almacenado, o semillas aplicando un compuesto activo a dicha sustancia.
Un compuesto que "modula la actividad de un nAChR" se refiere a un compuesto que altera la actividad del nAChR de modo que la actividad del nAChR es diferente en presencia del compuesto que en ausencia del compuesto o señal. Dichos compuestos pueden incluir agonistas, agonistas inversos y antagonistas. El término agonista se refiere a una sustancia, tal como ACh, que activa la función del receptor. El término agonista también se refiere a un agonista parcial. Habitualmente, un agonista de un nAChR se une al sitio de unión del agonista del receptor natural, es decir, el sitio de unión a acetilcolina. No obstante, un agonista de un nAChR también puede unirse a un sitio que se solape con el sitio de unión a acetilcolina, pero que no sea idéntico a éste. La expresión agonista inverso es aplicable a un receptor que muestra un nivel de actividad constitutivo, también denominado intrínseco o basal, en ausencia de cualquier ligando. Para dicho receptor, un agonista aumenta la actividad de un receptor por encima de su nivel basal. Un agonista inverso puede unirse al receptor de una manera comparable a la de un agonista, tal como ACh, pero disminuye la actividad por debajo del nivel basal. Un agonista, incluyendo un agonista inverso, puede inducir o no la desensibilización del receptor. Sin limitarse a la teoría, puede contemplarse que exista una forma inactiva y activa de un AChR unido a ligando. La idea subyacente, también denominada modelo de activación del receptor de dos estados, puede suponerse que es análoga a la del concepto de Michaelis y Menten de que la conversión enzimática de un sustrato prosigue como un proceso de dos etapas que implica la formación de un complejo inactivo. Como resultado, se puede hacer una distinción entre la unión del ligando y la activación del receptor, y se pueden contemplar diferentes estados del receptor con parámetros cinéticos que determinan la tasa de conversión entre estos estados. El término antagonista se refiere a una sustancia que interfiere con la función del receptor. Habitualmente, el efecto de un antagonista y de un agonista inverso se observa como un bloqueo de la activación por parte de un agonista. Un antagonista puede ser un antagonista competitivo o no competitivo. Un antagonista competitivo, o bloqueador competitivo, interactúa con el sitio específico del agonista, o cerca del mismo, por ejemplo, ACh, para el mismo sitio o uno muy cercano. Un antagonista o bloqueador no competitivo inactiva el funcionamiento del receptor al interactuar con un sitio que no sea el sitio que interactúa con el agonista del receptor natural, es decir, el sitio de unión a acetilcolina.
Como se usa en el presente documento, nAChR o receptor nACh significa receptor nicotínico de acetilcolina.
La expresión "molécula de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario o una combinación de los mismos. Como ejemplos de ácidos nucleicos se incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos o usando química de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico bloqueado (LNA, siglas del inglés locked nucleic acid molecules), moléculas de ácido proteonucleico (PNA, siglas del inglés protein nucleic acid), moléculas de ácido nucleico de alquilfosfonato y alquilfosfotriéster y moléculas de tecto-ARN (por ejemplo, Liu, B., y col., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077). El LNA tiene una cadena principal de ARN modificada con un puente de metileno entre el C4' y el O2', proporcionando a la molécula respectiva una mayor estabilidad de la doble cadena y resistencia a nucleasas. Las moléculas de ácido nucleico de alquilfosfonato y alquilfosfotriéster pueden considerarse que son como una molécula de ADN o ARN, en la que los grupos fosfato de la cadena principal del ácido nucleico se neutralizan intercambiando los grupos P-OH de los grupos fosfato en la cadena principal del ácido nucleico por un grupo alquilo y por un grupo alcoxi, respectivamente. El ADN o ARN puede ser de origen genómico o sintético y puede ser monocatenario o bicatenario. Dicho ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADN sintético de ADNc, un copolímero de ADN y ARN, oligonucleótidos, etc. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótidos no naturales y/o puede estar unido a una etiqueta de afinidad o a un marcador.
Se conocen muchos análogos de nucleótidos y pueden utilizarse para los ácidos nucleicos que se utilizan en los procedimientos descritos en el presente documento. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene una modificación, por ejemplo, en la base, en el azúcar o en los residuos de fosfato. Como ejemplo ilustrativo, se sabe que la sustitución de los residuos 2'-OH de ARNip por residuos 2'F, 2'O-Me o 2'H mejora la estabilidad in vivo del ARN respectivo. Las modificaciones en el residuo de base pueden ser una modificación natural o sintética de A, C, G y T/U, de una base diferente de purina o pirimidina, tal como uracil-5-ilo, hipoxantin-9-ilo y 2-aminoadenin-9-ilo, así como de una base de nucleótidos no purínica o no pirimidínica. Otros análogos de nucleótidos actúan como bases universales. Como ejemplos de bases universales se incluyen 3-nitropirrol y 5-nitroindol. Las bases universales pueden formar un par de bases con cualquier otra base. Las modificaciones de bases a menudo se pueden combinar, por ejemplo, con una modificación de azúcar, tal como, por ejemplo, 2'-O-metoxietilo, por ejemplo, para conseguir propiedades exclusivas, tales como mayor estabilidad de la doble cadena.
Las expresiones "unido de manera operativa" o "unido operativamente", como se usan en el presente documento, se refieren a la relación funcional de los ácidos nucleicos con las secuencias de nucleótidos reguladoras y efectoras, tales como promotores, potenciadores, sitios de parada transcripcionales y traduccionales, y otras secuencias de señal. Por ejemplo, la unión operativa de ácidos nucleicos con un promotor se refiere a la relación física y funcional entre los ácidos nucleicos y el promotor, de tal manera que la transcripción de dichos ácidos nucleicos se inicia desde el promotor mediante una ARN polimerasa que reconoce y se une específicamente a los ácidos nucleicos y que los transcribe. Para optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser ventajoso eliminar o alterar partes de un clon no traducidas en los extremos 5' y/o 3', por ejemplo, para eliminar posibles codones de iniciación (es decir, de inicio) de traducción alternativos extra, u otras secuencias que puedan interferir con la expresión o reducirla, ya sea a nivel de la transcripción o de la traducción. En algunas realizaciones, para mejorar la expresión, pueden insertarse sitios consenso de unión a ribosoma inmediatamente en el extremo 5' del codón de inicio. Para la expresión de subunidades del nAChR en ovocitos de anfibios, también puede ser ventajoso, rodear la secuencia codificante de la subunidad, con secuencias no traducidas de los extremos 5' y 3', del gen de la p-globina de Xenopus, para una producción óptima de proteínas.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de restos de aminoácidos y no están limitados a una determinada longitud mínima del producto. Cuando en la técnica los dos términos se usan simultáneamente, esta doble denominación explica el uso de ambos términos juntos.
Se entiende que el término "purificado" es una indicación relativa en comparación con el entorno original de la célula, representando así una indicación de que la célula es relativamente más pura que en el entorno natural. Por lo tanto, incluye, pero no solo se refiere a, un valor absoluto en el sentido de pureza absoluta de otras células (tal como una población celular homogénea). En comparación con el nivel natural, generalmente, el nivel después de purificar la célula será al menos 2-5 veces mayor (por ejemplo, en términos de células/ml). Se contempla expresamente la purificación de al menos un orden de magnitud, tal como aproximadamente dos o tres órdenes, incluyendo, por ejemplo, aproximadamente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Puede desearse obtener la célula al menos esencialmente exenta de contaminación, en particular, exenta de otras células, a un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo, a una pureza de aproximadamente 95 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 %. Con respecto a un ácido nucleico, un péptido o una proteína, lo anterior se aplica según corresponda. En este caso, la purificación del ácido nucleico, del péptido o de la proteína será, por ejemplo, generalmente al menos 2-5 veces mayor (por ejemplo, en términos de mg/ml).
En el presente documento, la palabra "recombinante" se usa para describir una molécula de ácido nucleico que, debido a su origen, manipulación, o ambas cosas, no está asociada a toda o a una parte de la molécula de ácido nucleico con la que está asociada en la naturaleza. Generalmente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye una secuencia que no aparece de manera natural en el organismo o en la célula de tipo silvestre respectivo. Habitualmente, una molécula de ácido nucleico recombinante se obtiene mediante genomodificación, normalmente construida fuera de una célula. Generalmente, una molécula de ácido nucleico recombinante es esencialmente idéntica y/o esencialmente complementaria, a al menos una parte de la molécula de ácido nucleico correspondiente que se produce en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico recombinante puede tener cualquier origen, tal como un origen genómico, de ADNc, de mamífero, bacteriano, vírico, semisintético o sintético. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína/polipéptido, significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante.
Condiciones "rigurosas" es un término comúnmente utilizado en la técnica. Las condiciones rigurosas son condiciones en las cuales una primera secuencia de ácido nucleico solo se hibridará con una segunda secuencia de ácido nucleico, si las dos secuencias tienen una alta homología. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Se pueden seleccionar condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 5-10° C inferiores al punto de fusión (Tf) térmico para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. Como ejemplo, condiciones de hibridación rigurosas pueden ser una hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6 x, SDS al 0,5 % a una temperatura de aproximadamente 68° C seguido de uno o más lavados en SSC 2 x, SDS al 0,5 % a temperatura ambiente. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es una hibridación en SSC 6 x a una temperatura de aproximadamente 45°°C, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2 x, SDS al 0,1 % a una temperatura de aproximadamente 50-65° C.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, también dirigido a un individuo, se refiere a un animal, generalmente un mamífero. Un sujeto puede ser una especie de mamífero tal como ganado bovino o una cabra. El sujeto también puede ser una oveja. En algunas realizaciones, el sujeto es un caballo. El sujeto también puede ser un perro o un gato. En algunas realizaciones, el sujeto es un hurón o una chinchilla. En algunas realizaciones, el sujeto es un cerdo. El sujeto también puede ser un mono, un conejo, un ratón, una rata, una cobaya, un hámster, un simio o un ser humano.
El término "variante", como se usa en el presente documento, puede referirse a una secuencia de nucleótidos, en la que la secuencia difiere de la secuencia más predominante en una población, por ejemplo, en un nucleótido, en el caso de las mutaciones puntuales descritas en el presente documento. Por ejemplo, algunas variaciones o sustituciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un nAChR, pueden alterar un codón de tal manera que se codifica un aminoácido diferente lo que produce un polipéptido variante. El término "variante" también puede referirse a un polipéptido en el que la secuencia difiere de una secuencia dada como se explica más adelante. Una variante puede ser, por ejemplo, un polipéptido en el que la secuencia difiere de la secuencia más predominante en una población. Una secuencia polipeptídica puede diferir, por ejemplo, en una posición que no cambie la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado, es decir, un cambio conservado. Una secuencia del nAChR mutada, puede codificar polipéptidos variantes.
Las expresiones "que comprende", "que incluye", "que contiene", "que tiene", etc., se leerán en forma amplia o abierta y sin limitaciones. Las formas en singular, tales como, "un", "uno(a)", "el" y "la", incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, cuando se hace referencia a un "vector" se incluye un solo vector, así como una pluralidad de vectores, ya sea el mismo, por ejemplo, el mismo operón, o uno diferente. Del mismo modo, cuando se hace referencia a una "célula" se incluye una sola célula, así como una pluralidad de células. A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que la expresión "al menos", que precede a una serie de elementos, se refiere a cada elemento de la serie. Las expresiones "al menos uno(a)" y "al menos uno(a) de" incluyen, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más elementos. Además se entiende, que pueden usarse ligeras variaciones por encima y por debajo de un intervalo establecido para obtener esencialmente los mismos resultados que los de un valor dentro del intervalo. Además, a menos que se indique lo contrario, la divulgación de los intervalos está pensada como un intervalo rango continuo que incluye todos los valores entre el valor mínimo y el máximo.
El alcance y el significado de cualquier uso de un término (o expresión) será obvio a partir del contexto específico en el que se utiliza el término (o la expresión). determinadas definiciones adicionales de los términos (y expresiones) seleccionados, utilizados a lo largo del presente documento, se dan en el contexto apropiado de la descripción detallada, según corresponda. A menos que se defina lo contrario, todos los demás términos (y expresiones) científicos y técnicos utilizados en la descripción, en las figuras y en las reivindicaciones, tienen su significado habitual tal como lo entiende comúnmente un experto en la materia.
Acción de los compuestos sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina
El control de garrapatas y ácaros se ha centrado en el uso de acaricidas, tales como compuestos de organofosfatos, carbamatos, piretroides, formamidina, amidinas y lactonas macrocíclicas, aunque con éxito limitado. Por otro lado, uno de los insecticidas más ampliamente utilizados es el neonicotinoide imidacloprid. Se sabe que los neonicotinoides, tal imidacloprid, son específicos para el tejido nervioso de los insectos sin afectar a mamíferos o ácaros de la misma manera. Las garrapatas, que son arácnidos en lugar de insectos, también se han considerado como prácticamente no afectadas por el imidacloprid. Por lo tanto, los presentes inventores, se quedaron sorprendidos cuando descubrieron que polipéptidos específicos codificados por secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 9, mostraban especificidad en respuesta a moduladores de los mismos.
La acetilcolina es un neurotransmisor que actúa en el sistema nervioso autónomo y en la conexión neuromuscular. En el cerebro, la acetilcolina actúa como neuromodulador. Los receptores de acetilcolina son canales iónicos regulados por agonistas (nAChR) o receptores acoplados a proteína G (mAChR) que a su vez activan canales iónicos. Los nAChR pertenecen a la superfamilia de canales iónicos regulados por neurotransmisores y definen un complejo transmembrana pentamérico (para una revisión general, véase, por ejemplo, Tomizawa y Casida, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. [2005] 45:247-268). La unión de la acetilcolina con un nAChR provoca un giro de 15° de las hélices del receptor, produciendo una apertura transitoria de un poro central que define un canal iónico integral selectivo de cationes. In vivo, esto produce el flujo de entrada de sodio y calcio extracelular en la célula, y el flujo de salida de potasio intracelular fuera de la célula, alterando el equilibrio del potencial de membrana. Cuando el flujo de entrada de Na+ domina sobre el flujo de salida de K+, se produce la despolarización. Los nAChR generalmente tienen un dominio de unión a ligando N-terminal extracelular largo, cuatro regiones transmembrana y un extremo C extracelular.
Se sabe que la selectividad de los insecticidas neonicotinoides es en gran parte atribuible a las diferencias en la unión a los nAChR de insectos en comparación con mamíferos. La nicotina-(-) y la acetilcolina tienen un átomo de nitrógeno cuaternario (sp3), un aceptor de enlaces de hidrógeno, concretamente, un nitrógeno de piridina frente a un oxígeno carboxilo, y un "punto ficticio" que impone direccionalidad al nitrógeno de piridina y al oxígeno, respectivamente (Tomizawa y Casida, 2005, citado anteriormente). A diferencia de esto, los neonicotinoides tienen un grupo nitro o ciano o un residuo electronegativo equivalente, y muestran coplanaridad entre esta punta y un residuo de guanidina/amidina sustituido.
Los nAChR pueden formar homopentámeros y heteropentámeros. En el cuerpo, los receptores de tipo muscular se encuentran en forma de heteropentámeros que contienen las subunidades ai, pi, y y 5 (forma embrionaria), o en forma de heteropentámeros que contienen las subunidades ai, pi, 5 y £ (forma adulta). Se han descubierto subtipos neuronales como subunidades a2-aio homoméricas o como subunidades heteroméricas de un tipo de subunidad a respectiva y subunidades p2-p4. En el caso de los nAChR heteroméricos que contienen subunidades no a, se ha observado que la acetilcolina se une en la interfaz de las regiones N-terminales de las subunidades a y no a. En el caso de homómeros o heteropentámeros que contienen dos subunidades a diferentes, se cree que el sitio de unión de la acetilcolina se forma en la interfaz de dos subunidades a adyacentes (Matsuda y col., Mol. Pharmacol. [2009] 76 :i-i0 ).
El sitio de unión al agonista de un nAChR está formado por seis bucles de aminoácidos (bucles AF) distintos. En general, se cree, que en la superficie extracelular de un heteropentámero de un canal de cationes receptor de nAChR hay dos sitios de unión al agonista. Se cree que un homopentámero hay cinco sitios de unión al agonista formados por bucles A-F en los bordes adyacentes de las subunidades. El residuo 2-nitroimino-imidazolidina de un insecticida común, el imidacloprid, experimenta interacciones particulares con restos de tirosina en el bucle C de los receptores de las especies Lymnaea stagnalis y Aplysia californica, también encontrado en receptores de insectos (Matsuda y col., 2009, citado anteriormente). En las secuencias de las subunidades a5 y a6 de Rhipicephalus de la presente divulgación, también se encuentra este resto de tirosina, véanse las figuras 3 y 5.
Además, imidacloprid forma enlaces de hidrógeno CH-n con un anillo de triptófano en el bucle B de los nAChR de Lymnaea stagnalis y Aplysia californica. El residuo de triptófano respectivo está muy conservado y también está presente en las secuencias de las subunidades a5 y a6 de Rhipicephalus de la presente divulgación. No se cree que este anillo de triptófano esté implicado en la selectividad de los nAChR de insectos por imidacloprid (Matsuda y col., 2009, citado anteriormente).
Además, se ha descubierto que el grupo nitro de imidacloprid forma un enlace de hidrógeno con un resto de glutamina en el bucle D de los nAChR de Lymnaea stagnalis y Aplysia californica. Los restos correspondientes de los nAChR de insectos son básicos y, por tanto, pueden fijar el grupo nitro de los neonicotinoides a través de una fuerza electrostática. Por lo general, en esta posición se encuentran restos sin carga o con carga negativa, en especies de vertebrados, y se ha pensado que esta posición juega un papel clave en la insensibilidad de los neonicotinoides (Erdmanis y col., Biochemistry [20i2] 5 i, 4627-4629). No obstante, las subunidades a3 y a4 de Homo sapiens, también contienen un resto básico en esta posición, mientras que las subunidades a7 de los receptores de vertebrados tienen una glutamina en la posición homóloga en el bucle D. El imidacloprid es un agonista parcial de los últimos receptores. Una subunidad p de un nAChR de la araña lobo, y una subunidad p de la garrapata del ciervo (Ixodes scapularis), contienen una glutamina en esta posición (Erdmanis y col., 20i2, citado anteriormente).
En las secuencias de la subunidad a5 de Rhipicephalus, puede identificarse un resto de glutamina, sin embargo, en relación con las secuencias de Lymnaea stagnalis y Aplysia californica este se mueve por una posición en la dirección C terminal, véase la figura 3. En la posición de la glutamina en los receptores de Lymnaea stagnalis y Aplysia californica, la subunidad a5 de Rhipicephalus tiene un resto ácido en forma de una cadena lateral de ácido aspártico. Las secuencias de la subunidad a6 de Rhipicephalus, no contienen ningún resto de glutamina en el bucle D esperado, véase la figura 5. En lugar de un resto básico, la subunidad a5 de Rhipicephalus tiene un resto ácido y la subunidad a6 de Rhipicephalus tiene treonina, proporcionando así un grupo hidroxi para un posible enlace de hidrógeno. Sin embargo, la forma en la que en el bucle D de las subunidades de Rhipicephalus estos dos restos podrían unirse al imidacloprid, seguiría siendo especulativa.
Como también se explica más adelante, las subunidades a5 y a6 de Rhipicephalus muestran diferentes características en la unión al ligando. Se descubrió que las respuestas a la ACh eran no desensibilizantes con Rma5, mientras que se descubrió que las respuestas a la ACh eran desensibilizantes con Rma6. Se descubrió que Rma6 estaba activado por un neonicotinoide, mientras que Rma5 estaba activado por un compuesto de espinosina. Estudios anteriores han demostrado que cuando en el bucle D de la subunidad alfa7 del pollo el resto de glutamina se muta a un resto ácido, las respuestas al imidacloprid se reducen significativamente (Shimomura y col., British Journal of Pharmacology [2002] i37, i62-i69). Las diferencias de secuencia entre las subunidades a5 y a6 de Rhipicephalus, pueden explicar las diferencias encontradas por los inventores, cuando se analizaron las corrientes iónicas a través de los receptores de estas dos subunidades.
Además, se han identificado mutaciones del resto X en el motivo YXCC del bucle C de las subunidades a del nAChR que influyen fuertemente en la sensibilidad neonicotinoide de los nAChR (Matsuda y col., 2009, citado anteriormente). Se sabe que la subunidad a5 de Rhipicephalus tiene un resto de prolina en esta posición, que es estéricamente rígido y que contribuye a la formación de un giro. La subunidad a6 de Rhipicephalus tiene una alanina, que proporciona un resto no polar pequeño. En la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se puede encontrar un resto de prolina,
i0
mientras que en las subunidades a4 de vertebrados hay un glutamato. En Lymnaea stagnalis y Aplysia califomica, esta posición está ocupada por una serina, que, en Lymnaea stagnalis, se pone en contacto con una glutamina en el bucle F, también presente en las subunidades de Rhipicephalus. En Aplysia califomica la serina forma un enlace de hidrógeno con el NO2 de imidacloprid. En vertebrados, las subunidades a2 y a4, que tienen un resto de ácido glutámico en esta posición, puede suponerse una repulsión electrostática cuando se ponen en contacto con restos ácidos en el bucle F (Matsuda y col., 2009, citado anteriormente).
La expresión de las subunidades a del nAChR en los ovocitos es generalmente difícil de conseguir. Los presentes inventores se sorprendieron al descubrir que las subunidades a5 y a6 de Rhipicephalus se expresaban muy bien. Por tanto, el uso de nAChR formados por estas subunidades, es particularmente adecuado para procesos de identificación y/u optimización, tales como técnicas de exploración, de un compuesto que actúa como un modulador de los mismos.
La expresión de la subunidad a5 del nAChR de Rhipicephalus no parece variar entre las diferentes fases de vida de la garrapata, véase la figura 7. Por consiguiente, cuando se aplica un compuesto eficaz en la modulación de la actividad de la subunidad a5 del nAChR de Rhipicephalus, se puede esperar que el efecto afecte de la misma manera a adultos, larvas y ninfas. La expresión de la subunidad a6 del nAChR de Rhipicephalus está regulada positivamente, de manera significativa, en adultos en comparación con ninfas y larvas, véase la figura 7. Si se aplica un compuesto eficaz en la modulación de la actividad de la subunidad a6 del nAChR de Rhipicephalus, se puede esperar que el efecto afecte de la misma manera a adultos, larvas y ninfas. Siendo la fase parasitaria de Rhipicephalus microplus de aproximadamente 20 a 25 días, una aplicación repetida después de aproximadamente tres semanas puede, por tanto, ser ventajosa en algunas realizaciones. Este periodo de tiempo puede variar para otras garrapatas de Rhipicephalus.
Finalmente, debe entenderse que en diversos fragmentos de este documento, Rhipicephalus microplus sirve como ejemplo ilustrativo. Sin embargo, en el presente documento se proporcionan procedimientos y agentes para controlar diversas especies del género Rhipicephalus. Otros dos ejemplos ilustrativos son Rhipicephalus annulatus y Rhipicephalus appendiculatus. Incluso, otros dos ejemplos más son Rhipicephalus aquatilis y Rhipicephalus armatus. Otro ejemplo de una garrapata que puede controlarse usando un procedimiento, un uso, y un compuesto como se describe en el presente documento, es Rhipicephalus arnoldi. Dos ejemplos más son Rhipicephalus bequaerti y Rhipicephalus bergeoni. Otro ejemplo adecuado es Rhipicephalus boueti. Otros dos ejemplos son Rhipicephalus bursa y Rhipicephalus camicasi. Otros dos ejemplos ilustrativos de garrapatas a controlar son Rhipicephalus capensis y Rhipicephalus carnivoralis. Dos ejemplos más son Rhipicephalus complanatus y Rhipicephalus compositus. Otros dos ejemplos son Rhipicephalus congolensis y Rhipicephalus cuspidatus. Otro ejemplo de una garrapata que puede controlarse es Rhipicephalus decoloratus. Otros dos ejemplos son Rhipicephalus deltoideus y Rhipicephalus distinctus. En algunas realizaciones, la garrapata que se controla es una o ambas de Rhipicephalus duttoni o Rhipicephalus dux. Otros dos ejemplos son Rhipicephalus evertsi y Rhipicephalus exophthalmos. Dos ejemplos más son Rhipicephalus sanguineus y Rhipicephalus senegalensis. Una gran cantidad de miembros adicionales del género. Rhipicephalus puede controlarse, tal como Rhipicephalus follis, Rhipicephalus fulvus, Rhipicephalus geigyi, Rhipicephalus gertrudae, Rhipicephalus glabroscutatum, Rhipicephalus guilhoni, Rhipicephalus haemaphysaloides, Rhipicephalus hoogstraali, Rhipicephalus humeralis, Rhipicephalus hurti, Rhipicephalus interventus, Rhipicephalus jeanneli, Rhipicephalus kochi, Rhipicephalus kohlsi, Rhipicephalus leporis, Rhipicephalus longiceps, Rhipicephalus longicoxatus, Rhipicephalus longus, Rhipicephalus lounsburyi, Rhipicephalus lunulatus, Rhipicephalus maculatus, Rhipicephalus masseyi, Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus moucheti, Rhipicephalus muehlensi, Rhipicephalus muhsamae, Rhipicephalus neumanni, Rhipicephalus nitens, Rhipicephalus oculatus, Rhipicephalus oreotragi, Rhipicephalus pilans, Rhipicephalus planus, Rhipicephalus praetextatus, Rhipicephalus pravus, Rhipicephalus pseudolongus, Rhipicephalus pulchellus, Rhipicephalus pumilio, Rhipicephalus punctatus, Rhipicephalus pusillus, Rhipicephalus ramachandrai, Rhipicephalus rossicus, Rhipicephalus scalpturatus, Rhipicephalus schulzei, Rhipicephalus escultus, Rhipicephalus serranoi, Rhipicephalus simpsoni, Rhipicephalus simus, Rhipicephalus sulcatus, Rhipicephalus supertritus, Rhipicephalus theileri, Rhipicephalus tricuspis, Rhipicephalus turanicus, Rhipicephalus warburtoni, Rhipicephalus zambeziensis y Rhipicephalus zumpti.
Secuencias de ácido nucleico que codifican subunidades del receptor nicotínico de acetilcolina y los oolioéotidos correspondientes
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 98 % con la SEQ ID NO: 10. La SEQ ID NO: 10 se representa mediante la siguiente secuencia:
LVAE VDET WS AREND SS SPPPPPLSHEKRLMDSLLRHYD AS VRPVKNS SEP VIIRLGITLTQI
FDLDEKNQVLTTIVWLDQEWFDEYLTWDPLEFGNFSNLRLPCHKIWLPDIVLYNNADDYT
RGYFQTRAMIDPQGRVFWPPPTKFRSTCPVDVTYFPFDDQVCTMKFGSWIYDGLQVDIQN
RTSEYDLVNYMPNGEWELLEARMVRNVVYYPCCPDQPFPDITVVLVMRRKTLYYMYNV
YLPCIMMSVLTLLVFCLPPDSGEKIALGYTVLLAFSYFMLAIAEKMPETSESIPLLGIYLTAV
MAITSISVVMTVIVLNFHYRGPSRKEVPAWLRRLLLNKSSSSRGWFSKPARRKTVGDNHV
HFYDLPSRTAASKDRSDLDDDVDGSRRPAADDTFRLVVDSVVIGSEDRYTRGEYAEHSAS
NESPSPVLHGDMSRNNASGSARHRRCRAGAASGGSTKRVQEEVLRTLRYLMEKQQREEH
LTRTVNEWRQMALVIDRTLFWFFLIITAVSSVCFLVVIPI
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 % con la SEQ ID NO: 10. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de longitud continua de aproximadamente 150 o más aminoácidos. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 200 o más, tal como 250 o más aminoácidos. El polipéptido codificado puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 300 o más aminoácidos. Dicho fragmento representa un polipéptido, que puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 98 % con la Se Q ID NO: 10. El polipéptido codificado incluye una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 99 % con la SEQ ID NO: 10.
Cualquier fragmento de un polipéptido desvelado en el presente documento puede incluir una secuencia que contenga dos o más bucles como se indica en las figuras 3 y 5. El experto en la materia conoce el mapeo de estos bucles, y se ha demostrado su relevancia con respecto a la unión con el ligando (por ejemplo, Shimomura y col., 2002, citado anteriormente). Un fragmento puede incluir, por ejemplo, una secuencia que contenga los bucles B y D. Un fragmento puede incluir una secuencia que contenga los bucles C y D. Un fragmento respectivo puede incluir una secuencia que contenga tres o cuatro bucles como se indica en las figuras 3 y 5. Como ejemplo, un fragmento puede incluir una secuencia que contenga los bucles B, C y D. Un fragmento también puede incluir una secuencia que contenga los bucles B, C, D y F. Un fragmento de un polipéptido desvelado en el presente documento puede incluir una secuencia que contenga cinco bucles como se indica en las figuras 3 y 5. En algunas realizaciones, un fragmento de un polipéptido descrito en el presente documento, puede incluir los seis bucles A a C, como se ilustra en la figura 3 o en la figura 5.
El polipéptido codificado puede contener una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99,5 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,8 %, con la SEQ ID NO: 10. Un fragmento incluido en un polipéptido codificado también puede representar un polipéptido que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 99,5 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,8 %, con la SEQ ID NO: 10.
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede ser una molécula de ácido nucleico que se hibride con la secuencia de la SEC ID NO: 10 en condiciones de hibridación rigurosas. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede ser una molécula de ácido nucleico que se hibride con la secuencia de la SEC ID NO: 10 en condiciones de hibridación muy rigurosas.
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, también puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 98 % con la SEQ ID NO: 11. La SEQ ID NO: 11 se representa mediante la siguiente secuencia:
LLTAPQDSEQGAHERRLLADLLANYNTLERPVLNESEPLILSFGLTLQQIIDVDEKNQLIITNIWLT
LD WIDVNLRWNPKDY GGV QDLRIPPNKIWKPD VLMYN SADEKFDGTYPTNVWRSN GS CNYIP
PGIFKSTCKIDITWFPFDDQKCDLKFGSWTYHGYQLDLRVNSEEGGDLTTYIPNGEWDLIGVPG
VRNVREYACCPEPYIDITYTIHIRRRTLYYGFNLIIPCVLISSMTLLGFTLPPDTGERLTLGVTILLSL
TVFMLQLAETMPPTSDAVSIIGTYFACIMIMVAFSWMTVWLNYHHRNQETTEMPALIRTVFLV WLPWLLRMEPPGQKANRRSLFLNSKMKELELKERSSRSLLANVLDI
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 96 % con la SEQ ID NO: 11. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de longitud continua de aproximadamente 150 o más aminoácidos. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 200 o más, tal como de aproximadamente 250 o más aminoácidos. El polipéptido codificado puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 300 o más aminoácidos. Dicho fragmento representa un polipéptido, que puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, tal como de aproximadamente 96 %, con la SEQ ID NO: 11. El polipéptido codificado incluye una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, tal como de aproximadamente 96 %, con la SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 98% con la SEC ID NO: 12. La SEQ ID NO: 12 se representa mediante la siguiente secuencia:
IAVLLTAPQDSEQGAHERRLLADLLANYNTLERPVLNESEPLILSFGLTLQQIIDVDEKNQLIITNI
WLTLDWIDYNLRWNPKDYGGVQDLRIPPNKIWKPDVLMYNSADEKFDGTYPTNVWRSNGSC
NYIPPGIFKSTCKIDITWFPFDDQKCDLKFGSWTYHGYQLDLRVNSEEGGDLTTYIPNGEWDLIGV
PGVRNYREYACCPEPYIDITYTIHIRRRTLYYGFNLIIPCVLISSMTLLGFTLPPDTGERLTLGYTIL
LSLTYFMLQLAETMPPTSDAVSIIGTYFACIMIMVAFSWMTVWLNYHHRNQETTEMPALIRTV
FLVWLPWLLRMEPPGQKANRRSLFLNSKMKELELKERSSRSLLANVLDID
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 96 % con la SEQ ID NO: 12. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 150 o más aminoácidos. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 200 o más, tal como de aproximadamente 250 o más aminoácidos. El polipéptido codificado puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 300 o más aminoácidos. Dicho fragmento representa un polipéptido, que puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 95 %, tal como de aproximadamente 96%, con la SEQ ID NO: 12. El polipéptido codificado incluye una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, tal como de aproximadamente 96 %, con la SEQ ID NO: 12.
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, también puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 98 % con la SEQ ID NO: 13. La SEQ ID NO: 13 se representa mediante la siguiente secuencia:
LLTAPQDSEQGAHERRLLADLLANYNTLERPVLNESEPLILSFGLTLQQIIDVDEKNQIITTNVW
LNLDWIDVNLRWNPKDYGGVQDLRIPPNKIWKPDVLMYNSADEKFDGTYPTNVWRSNGSC
NYIPPGIFKSTCKIDITWFPFDDQKCDLKFGSWTYHGYQLDLRVNSEEGGDLTTYIPNGEWDLI
GVPGVRNVREYACCPEPYIDITYTIHIRRRTLYYGFNLIIPCVLISSMTLLGFTLPPDTGERLTLGVT
ILLSLTVFMLQLAETMPPTSDAVSIIGTYFACIMIMVAFSWMTVYVLNYHHRNQETTEMPALIRT
VFLVWLPWLLRMEPPGQKANRRSLFLNSKMKELELKERSSRSLLANVLDI
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 96 % con la SEQ ID NO: 13. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 150 o más aminoácidos. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 200 o más, tal como de aproximadamente 250 o más aminoácidos. El polipéptido codificado puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 300 o más aminoácidos. Dicho fragmento representa un polipéptido, que puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 95 %, tal como de aproximadamente 96%, con la SEQ ID NO: 13. El polipéptido codificado incluye una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, tal como de aproximadamente 96 %, con la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento puede codificar un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 98% con la SEC ID NO: 14. La SEQ ID NO: 14 se representa mediante la siguiente secuencia:
IAVLLTAPQDSEQGAHERRLLADLLANYNTLERPVLNESEPLILSFGLTLQQIIDVDEKNQIITTNY
WLNLDWIDVNLRWNPKDYGGVQDLRIPPNKIWKPDVLMYNSADEKFDGTYPTNVWRSNGSC
NYIPPGIFKSTCKIDITWFPFDDQKCDLKFGSWTYHGYQLDLRVNSEEGGDLTTYIPNGEWDLIG
VPGVRNVREYACCPEPYIDITYTIHIRRRTLYYGFNLIIPCVLISSMTLLGFTLPPDTGERLTLGVTI
LLSLTVFMLQLAETMPPTSDAVSIIGTYFACIMIMVAFSWMTVWLNYHHRNQETTEMPALIRT
VFLVWLPWLLRMEPPGQKANRRSLFLNSKMKELELKERSSRSLLANVLDID
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede contener una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 96% con la SEQ ID NO: 14. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 150 o más aminoácidos. El polipéptido codificado también puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 200 o más, tal como de aproximadamente 250 o más aminoácidos. El polipéptido codificado puede contener una secuencia de aminoácidos que sea un fragmento de una longitud continua de aproximadamente 300 o más aminoácidos. Dicho fragmento representa un polipéptido, que puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 95 %, tal como de aproximadamente 96 %, con la SEQ ID NO: 14. El polipéptido codificado incluye una secuencia de aminoácidos que es un fragmento que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, tal como de aproximadamente 96 %, con la SEQ ID NO: 14.
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede contener una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99.5 %, con la SEQ ID NO: 2. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,5 %, con la SEQ ID NO: 2. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede consistir en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,5 %, con la SEQ ID NO: 2.
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede contener una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99.5 %, con la SEQ ID NO: 4. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,5 %, con la SEQ ID NO: 4. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede consistir en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,5 %, con la SEQ ID NO: 4.
Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede contener una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99.5 %, con la SEQ ID NO: 6. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,5 %, con la SEQ ID NO: 6. Una molécula de ácido nucleico desvelada en el presente documento, puede consistir en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 99 %, incluyendo al menos aproximadamente 99,5 %, con la SEQ ID NO: 6.
Las variantes de un polipéptido proporcionadas en el presente documento, pueden prepararse mediante genomodificación de proteínas y/o modificación química, introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, o mediante síntesis proteica/peptídica. Se puede obtener una variante mediante cualquier combinación de una o más deleciones, sustituciones, adiciones e inserciones en la secuencia de ácidos nucleicos y/o aminoácidos, siempre que el polipéptido obtenido defina una subunidad funcional del receptor nACh. En algunas realizaciones, una variante de un polipéptido proporcionado en el presente documento, difiere en hasta cinco sustituciones de una secuencia particular de un polipéptido proporcionado en el presente documento. Una sustitución en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido proporcionado en el presente documento, puede ser una sustitución conservativa. Como ejemplos de sustituciones conservativas se incluyen:
1. La sustitución de alanina (A) por valina (V);
2. La sustitución de arginina (R) por lisina (K);
3. La sustitución de asparagina (N) por glutamina (Q);
4. La sustitución de ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E);
5. La sustitución de cisteína (C) por serina (S);
6. La sustitución de ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D);
7. La sustitución de glicina (G) por alanina (A);
8. La sustitución de histidina (H) por arginina (R) o lisina (K);
9. La sustitución de isoleucina (I) por leucina (L);
10. La sustitución de metionina (M) por leucina (L);
11. La sustitución de fenilalanina (F) por tirosina (Y);
12. La sustitución de prolina (P) por alanina (A);
13. La sustitución de serina (S) por treonina (T);
14. La sustitución de triptófano (W) por tirosina (Y);
15. La sustitución de fenilalanina (F) por triptófano (W);
y/o
16. La sustitución de valina (V) por leucina (L) y viceversa.
Las secuencias descritas en el presente documento pueden incluir una o más, tal como dos o tres, de dichas sustituciones conservativas. En algunas realizaciones, un polipéptido según la presente divulgación, incluye una secuencia que tiene cuatro o más sustituciones conservativas en comparación con una secuencia desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones, un polipéptido incluye una secuencia que tiene cinco o más sustituciones conservativas. En algunas realizaciones, un polipéptido contiene seis o más, tal como siete o más, sustituciones conservativas con respecto a una secuencia desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir ocho o nueve de dichas sustituciones conservativas. En algunas realizaciones, un polipéptido según la presente divulgación, puede incluir diez o más de dichas sustituciones conservativas, por ejemplo, once, doce o más, de dichas sustituciones conservativas.
Las sustituciones no conservativas pueden conducir a cambios más sustanciales, por ejemplo, con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilicidad, hidrofobicidad o conformación del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido incluye una o más, tal como dos sustituciones no conservativas. En algunas realizaciones, el polipéptido incluye tres o cuatro sustituciones no conservativas. El polipéptido también puede incluir cinco o más, por ejemplo, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más, de dichas sustituciones no conservativas.
Cabe destacar, que los presentes inventores, han identificado dos variantes de corte y empalme de nAChRa6 de R. microplus. Las secuencias de aminoácidos correspondientes tienen la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 6, como se representa en las figuras 5 y 17. Las variantes de corte y empalme pueden considerarse variantes como se describió anteriormente. La presencia de subunidades de variantes, cortadas y empalmadas de manera diferente, es importante porque los receptores pueden tener un perfil farmacológico diferente y/o las variantes pueden expresarse preferentemente en diferentes tejidos/fases de vida (Hosie y col., Neuroscience [2001] 102, 3: 709-714; Kita y col., Biochem Mol Biol [2014] 45: 1-10). Las transcripciones de corte y empalme alternativas de la subunidad nAChRa6 se han caracterizado anteriormente en insectos (por ejemplo, Grauso y col., Genetics [2002] 160, 4: 1519-1533; Rinkevich y Scott, Insect Molecular Biology [2009] 18(2): 233-242; Puinean y col., J Neurochem [2013] 124 (5): 590-601) encontrándose diferentes isoformas para los exones 3 y 8. En la garrapata R. microplus se descubrieron dos variantes alternativas del exón 3 después de la secuenciación de la transcripción y se denominaron 3a (SEQ ID NO: 5) y 3b (SEQ ID NO: 3) en consenso con la anotación utilizada en otros estudios. Ambas isoformas forman receptores funcionales cuando se expresan en ovocitos de Xenopus.
Identificación de compuestos adecuados
En un procedimiento de identificación de un compuesto capaz de modular la actividad de un receptor nACh de Rhipicephalus, se puede emplear una variedad de técnicas conocidas en la materia. Habitualmente, dichas técnicas permiten la formación de una respuesta electrofisiológica detectable contra un agonista conocido. La respuesta respectiva puede detectarse en forma de mediciones de corrientes iónicas. Para realizar esta tarea, en el comercio se dispone de instrumentos electrofisiológicos automatizados que utilizan matrices planas. Dado que un flujo de iones a través de un canal influye en el potencial de membrana, la respuesta respectiva también puede detectarse utilizando un procedimiento electrofisiológico. Como ejemplo, pueden emplearse mediciones convencionales de electrofisiología de pinzamiento zonal. También pueden detectarse cambios en el potencial de membrana un sistema de coloración, por ejemplo, usando un colorante fluorescente. A este respecto, puede emplearse, por ejemplo, un lector de placa fluorescente con capacidades cinéticas. Pueden utilizarse formatos de placa de 96, 384 o 1536 pocillos. La respuesta respectiva también puede detectarse basándose en un cambio en la concentración de iones en un lado de una membrana. Esto puede realizarse mediante una señal electromagnética, por ejemplo, mediante un colorante detector que indica la presencia y/o ausencia de determinados iones metálicos. De nuevo, pueden emplearse placas de 96, 384 o 1536 pocillos. Por ejemplo, puede detectarse un flujo de iones utilizando, como un detector de iones quimioluminiscente, indicadores de flujo de iones, bien establecidos, codificados genéticamente, aecuorina y una proteína fluorescente genomodificada. La concentración de iones también se puede medir directamente usando espectroscopia de absorción atómica o isótopos marcados.
Cuando se usan uno o más colorantes de detección de potencial de membrana, puede aprovecharse la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) si se utiliza un par de colorantes. Se puede usar un primer colorante anclado a fosfolípidos, tal como una cumarina, y un segundo colorante hidrófobo que se redistribuya rápidamente en la membrana según el campo transmembrana.
Donde se desee, un ion fisiológico que pasa a través del receptor nACh in vivo, puede reemplazarse por un ion no fisiológico que pueda pasar a través del poro que define un canal. Como una ilustración, el talio pasa fácilmente a través de muchos canales de potasio y puede detectarse con sondas fluorescentes que pueden cargarse en las células.
Para tener en cuenta los cambios conformacionales durante la regulación, puede desearse usar un formato de ensayo que pueda controlar la regulación del canal para identificar un compuesto con selectividad funcional. En este sentido, las técnicas de electrofisiología automatizada, los detectores bioquímicos y los lectores de placa, proporcionan una gama de opciones para implementar un ensayo de canal iónico, que pueda detectar la modulación de canales específicos del estado o independientes del estado.
Como ejemplo, las células u ovocitos que expresan un polipéptido, como se desvela en el presente documento, en forma recombinante, pueden ponerse en contacto con un compuesto de ensayo, y el (los) efecto(s) modulador(es) del mismo puede(n) evaluarse comparando la respuesta mediada por el AChR en presencia y en ausencia del compuesto de ensayo. La respuesta mediada por el AChR de las células de ensayo, o de las células de control, habitualmente células que para nada expresan los nAChR, o células que no expresan un polipéptido como se desvela en el presente documento, también puede compararse con la presencia del compuesto.
De acuerdo con una realización particular del procedimiento, se puede producir una respuesta electrofisiológica detectable en una célula tal como un ovocito. El procedimiento generalmente incluye expresar un polipéptido, como se desvela en el presente documento, en una superficie celular, tal como una superficie celular de un ovocito. El procedimiento también puede incluir poner en contacto el ovocito con uno o más compuestos de ensayo e identificar la respuesta electrofisiológica.
Como se desvela en el presente documento, un procedimiento puede incluir la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora adecuada. En la materia hay técnicas respectivas bien establecidas. En algunas realizaciones, un ácido nucleico, como se desvela en el presente documento, puede incluirse en un casete de expresión. Un casete de expresión generalmente incluye un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés, que está unida operativamente a una o más señales de terminación. También puede incluir secuencias necesarias para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. La región codificante puede codificar un polipéptido de interés y también puede codificar un ARN funcional de interés, incluyendo, pero sin limitación, ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección en sentido o antisentido. El casete de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser un casete de origen natural, pero que se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. En algunas realizaciones, el casete de expresión puede ser heterólogo con respecto al hospedador; es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no aparece de manera natural en la célula hospedadora y se introdujo en la célula hospedadora o en un ancestro de la célula hospedadora mediante un suceso de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión, puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicie la transcripción solo cuando la célula hospedadora se exponga a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta o un animal, el promotor también puede ser específico para un tejido, órgano o fase de desarrollo particular
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento, por ejemplo, una molécula de ARN, puede inyectarse y expresarse en un ovocito. En la materia, las técnicas para inyecciones citoplasmáticas de ARN están bien establecidas. Las inyecciones de ácido nucleico pueden realizarse, por ejemplo, en ovocitos desnudos usando, por ejemplo, un microelectrodo de vidrio y un sistema de inyección disponible en el comercio. Las cantidades de moléculas de ácido nucleico inyectadas en un ovocito pueden variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 ng por ovocito, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ng de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden inyectarse en volúmenes de tampón que varían de 10 a 100 nl, incluyendo, por ejemplo, un volumen de tampón de aproximadamente 50 nl.
Como se ha explicado anteriormente, en algunas realizaciones, se puede detectar una respuesta electrofisiológica usando técnicas de fijación de voltaje. Los ovocitos pueden fijarse mediante voltaje, por ejemplo, con un fijador de dos electrodos. Se perfunde un tampón fisiológico adecuado a través de los ovocitos y se obtiene un registro de referencia. Después de obtener un registro de referencia, los ovocitos pueden perfundirse con una solución de registro apropiada (por ejemplo, NaCh 2 mM, MgCh 1 mM, KCl 96 mM, Na-HEPES 5 mM, CaCh 1 mM). Las soluciones de ovocitos pueden, por ejemplo, diluirse (p. ej., en H2O destilada) a partir de soluciones de reserva. Los compuestos de ensayo pueden usarse, por ejemplo, en forma de soluciones de reserva, habitualmente conservando las condiciones iónicas y osmóticas de la solución de registro. después, se puede preparar una dilución en soluciones de registro a una concentración final deseada. Los ovocitos se perfunden con una solución de registro final.
Para registrar corrientes transmembrana, se dispone de amplificadores comerciales. Los electrodos generalmente se llenan con una solución iónica adecuada, y las respuestas se pueden registrar a temperatura ambiente mientras la membrana del ovocito se sujeta con voltaje al potencial de membrana deseado (por ejemplo, -80 mV). También se pueden usar otras configuraciones y equipos conocidos en la materia.
En algunas realizaciones, se puede detectar una respuesta electrofisiológica usando una técnica denominada "pinzamiento zonal". Generalmente, una pequeña zona de la membrana celular se aísla en la punta de una micropipeta presionando la punta contra la membrana. Se ha sugerido que si se establece un cierre hermético entre la micropipeta y la zona de la membrana, la corriente eléctrica puede pasar a través de la micropipeta solo a través de los canales iónicos en la zona de la membrana. Si esto se logra, la actividad de los canales iónicos y su efecto sobre el potencial de membrana, resistencia y corriente, puede monitorizarse. Si el potencial eléctrico a través de la membrana permanece constante, la corriente que se la suministra es igual a la corriente que fluye a través de los canales iónicos en la membrana. El cierre de los canales iónicos en la membrana hace que aumente la resistencia de la membrana. Si la corriente aplicada permanece constante; el aumento de la resistencia está en proporción directa a un aumento del potencial eléctrico a través de la membrana.
Un procedimiento para identificar compuestos que modulen la actividad del nAChR (receptor nicotínico de acetil colina) (por ejemplo, agonistas y antagonistas), habitualmente requiere una comparación con un control. Un tipo de célula de "control" o cultivo de "control" es una célula o un cultivo que se trata esencialmente de la misma manera que la célula 0 el cultivo expuesto al compuesto de ensayo. La única diferencia con la célula o el cultivo de ensayo es que la célula/cultivo de control no está expuesto a un compuesto de ensayo. Por ejemplo, en un procedimiento que se basa en una técnica electrofisiológica de fijación de voltaje, la misma célula puede someterse a ensayo en presencia y en ausencia de un compuesto de ensayo, simplemente cambiando la solución externa que baña la célula. Otro tipo de célula de "control" o cultivo de "control" puede ser una célula o un cultivo de células que sean idénticas a las células transfectadas, excepto que las células empleadas para el cultivo de control no expresan los nAChR funcionales. En esta situación, la respuesta de la célula de ensayo frente al compuesto de ensayo se compara con la respuesta (o la falta de respuesta) de la célula negativa al receptor (control) frente al compuesto de ensayo, cuando las células o los cultivos de cada tipo de célula se exponen esencialmente a las mismas condiciones de reacción en presencia del compuesto que se está analizando.
En algunas realizaciones, una medición puede compararse con un valor umbral predeterminado. En algunas realizaciones, un valor umbral predeterminado puede establecerse basándose en datos recogidos de mediciones anteriores usando compuestos que se sabe que modulan, por ejemplo, activan o inhiben, la actividad del nAChR. En algunas realizaciones, como valor umbral puede utilizarse un determinado percentil de dichos datos. El intervalo de los valores de un conjunto de datos obtenido de las células se puede dividir en 100 partes iguales, es decir, se pueden determinar porcentajes del intervalo. Un percentil representa el valor dentro del intervalo respectivo por debajo del cual cae un determinado porcentaje de los datos, en otras palabras, el porcentaje de los valores que son más pequeños que ese valor. Por ejemplo, el percentil 95 es el valor por debajo del cual se encuentra el 95 por ciento de los datos. En algunas realizaciones, la actividad del nAChR puede considerarse disminuida o baja si está por debajo del percentil 90, o por debajo del percentil 80. En algunas realizaciones, la actividad del nAChR puede considerarse disminuida o baja si está por debajo del percentil 70.
En algunas realizaciones, se usa un sustrato para uso en la exploración descrita en la solicitud de patente europea EP 1 621 888 en relación con una membrana biológica.
Para que la invención pueda entenderse y ponerse en práctica fácilmente, se describirán ahora realizaciones particulares mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Los ejemplos ilustran técnicas que pueden utilizarse en los procedimientos desvelados en el presente documento, así como realizaciones ejemplares de aislamiento y expresión de una molécula de ácido nucleico y un polipéptido descritos anteriormente.
Materiales
Las garrapatas que se utilizaron en este estudio se criaron en Bayer Anima1Health (Monheim, Alemania), en fases de vida recogidas por separado, ultracongeladas en nitrógeno líquido y transportadas en nieve carbónica. Al llegar, las muestras se conservaron a -80° hasta que se necesitaron.
Secuenciación y análisis de transcriptoma
ARN total de alta calidad extraído de un grupo de larvas, ninfas y adultos de R. microplus se envió a Eurofins Genomics (Alemania) para la preparación y normalización de una biblioteca de ADNc. El ADNc se secuenció utilizando tecnología Illumina HiSeq2002, utilizando dos carriles completos con un protocolo de extremos emparejados de 1x100 pb.
Después del análisis del transcriptoma, se identificó una secuencia completa de una supuesta subunidad nAChRa5 (Rma5) y de una supuesta subunidad nAChRa6 (Rma6) parcial. La secuencia parcial de Rma6 se extendió utilizando amplificación RACE en el extremo 3'. Para amplificar la región codificante del gen, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos, que después se clonó en el vector pCR4-TOPO y se verificó mediante secuenciación.
Clonación molecular de Rma5 y Rma6
A partir de un grupo de larvas, ninfas y adultos de garrapatas de ganado bovino, se extrajo ARN total utilizando Trizol (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. A partir de ARN total, se sintetizó ADNc amplificado por RACE, utilizando el kit de FirstChoice RLM-RACE (Ambion) y el kit de transcripción inversa Maxima H (Thermo). La secuencia de la subunidad a6 del nAChR, extraída de la base de datos del transcriptoma, carecía de parte del extremo 3', por lo tanto, inicialmente, se realizó una amplificación por RACE en el extremo 3' para obtener la secuencia que faltaba. Secuencias de Rma5 y Rma6 de longitud completa se amplificaron usando la polimerasa KAPA HiFi (KAPA Biosystems) y las transcripciones se ligaron en el vector pCR4-TOPO TA (Life Technologies). Células de E. coli competentes One Shot Top10 (Life Technologies) se transformaron usando los productos ligados y se cultivaron durante la noche a 37° C en placas de agar con LB que contenían ampicilina. Colonias tanto de Rma5 como de Rma6 se cultivaron en caldo LB, el ADN plasmídico se aisló usando el kit miniprep de plásmido PureLink™ Quick siguiendo el protocolo del fabricante y el ADN se secuenció utilizando los cebadores M13 Rev y M13 Uni (Eurofins Genomics) específicos de vectores.
El análisis filogenético de las secuencias reveló que la secuencia de Rma5 se agrupaba con otras subunidades alfa 5 de insectos (no dípteros) y que tenía una identidad por encima del 70 % con nAChRa5 de Ixodes scapularis, véase la figura 1. La secuencia de Rma6 tiene una identidad de aproximadamente 60% con otras subunidades alfa 6 de insectos y una identidad de 86 % con nAChRa6 (subunidad a6 del nAChR) de I. scapularis.
Además, después de la clonación y secuenciación de diversas muestras de ARN de R. microplus, han identificado dos variantes de corte y empalme alternativas para el exón 3 de la subunidad alfa6 del nAChR.
Resultados del aislamiento y clonación de Rma5 y Rma6
El transcriptoma de la garrapata del ganado bovino se ha secuenciado para determinar la secuencia de diversos canales iónicos neuronales, incluidos los nAChR. En este estudio, el ensamblaje ha producido un número de 250000 cóntigos de una longitud promedio de 950 pb. La búsqueda por BLAST de la base de datos generada usando secuencias de nAChR de insectos (nAChRal de Anopheles gambiae, nAChRa2 de Anofeles gambiae, nAChRa5 de Bombyx mori) ha extraído diversos cóntigos que codifican el nAChR que incluían una secuencia de tipo alfa5 de longitud completa y una secuencia de tipo alfa6parcial. Después de la amplificación por RACE del extremo 3' de la secuencia de tipo alfa6 y del ensamblaje de un cóntigo completo, las transcripciones, tanto de tipo alfa5 como de tipo alfa6, se amplificaron y clonaron en pCR4-TOPO. La traducción de la secuencia de nucleótidos reveló un marco de lectura abierto de 552 aminoácidos y 501 aminoácidos para alfa5 y alfa6, respectivamente.
Expresión heteróloga y registro electrofisiológico en ovocitos de Xenopus
Los plásmidos que contenían las secuencias de elección, se linealizaron usando la enzima de restricción Bcul (Spel) FastDigest (ThermoFisher) durante 30 minutos a 37° C, y para verificar la linealización completa se procesó una parte alícuota en un gel de agarosa. El ADN plasmídico se purificó con fenol:cloroformo y se precipitó con etanol. El sedimento se resuspendió en agua desionizada. El ARN protegido se sintetizó utilizando el kit mMessage mMachine T7 a partir de 1 |jg de ADN plasmídico linealizado, la muestra se purificó con fenol: cloroformo y se precipitó con isopropanol. El sedimento se resuspendió en agua desionizada a una concentración de 500 ng/jl, su integridad se analizó en un gel de agarosa y se conservó a -80° C hasta su uso posterior.
Los ovocitos de Xenopus laevis se adquirieron como ovarios enteros en el European Xenopus Resource Centre (Universidad de Portsmouth), se suministraron en menos de 24 h en solución salina modificada de Barth (MBS, Modified Barth's Saline) en hielo. Después de recibirlos, los ovocitos se trataron con 2 mg/ml de colagenasa de tipo I (Sigma-Aldrich) en solución de Barth sin calcio (NaCl 88 mM, Tris-HCl 15 mM, NaHCO32,4 mM, MgCh 0,82 mM, KCl 1 mM, pH 7,5) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los ovocitos separados se aclararon cuidadosamente en solución de Barth sin calcio, se desfolicularon manualmente y con un microinyector Drummond recibieron una inyección de 25 ng/ovocito de ARN protegido. Los ovocitos se incubaron a 18° C en solución de Barth que contenía calcio (77 mM) complementada con 4 jg/m l de kanamicina, 50 jg/m l de tetraciclina, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina. Después de 3-5 días, se realizaron registros de fijación de voltaje de dos electrodos usando un fijador de ovocitos OC-725C (instrumentos Warner) con el potencial de membrana fijado a -60mV. Los ovocitos se perfundieron continuadamente con solución de Ringer de rana (NaCl 115 mM, KCl 2,5 mM, CaCh 1,8 mM y HEPES 10 mM) y las diluciones de ligandos preparadas en solución salina de Ringer se aplicaron usando un sistema de perfusión multiválvula VC-8 (Warner Instruments). Después de la aplicación del ligando, se midió la corriente necesaria para mantener el potencial de membrana a -60 mV y se usó para el análisis de datos posterior.
Bioinformática y procesamiento de datos
Los datos de secuenciación del transcriptoma se recortaron para eliminar los cebadores usando FastQC, se normalizaron digitalmente para reducir la abundancia de las transcripciones más comunes y se ensamblaron con el programa informático Trinity. Los cóntigos se cargaron en un servidor local DeCypher (Active Motif, CA, Estados Unidos) y se investigaron utilizando el algoritmo Terra-BLAST con sondas específicas de secuencia.
La alineación de secuencias, el diseño de cebadores nucleotídicos y la relación filogenética de las subunidades del nAChR, se realizaron utilizando Genious® (Biomatters Ltd.).

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 1 y s Eq ID NO: 9, o un fragmento de la misma, que codifica un fragmento funcional de una subunidad del receptor nACh.
2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico comprende además una o más regiones reguladoras unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos.
3. Un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
4. El polipéptido de la reivindicación 3, que está incluido en un homopentámero.
5. Un procedimiento de identificación de un compuesto capaz de modular la actividad de un receptor nACh de Rhipicephalus, comprendiendo el procedimiento, poner en contacto un polipéptido según la reivindicación 3 o 4, con un compuesto que se sospecha que modula la actividad de un receptor nACh de Rhipicephalus, y detectar la actividad del polipéptido.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el polipéptido según la reivindicación 3 o 4 está incluido en una célula huésped.
7. El procedimiento de las reivindicaciones 5 o 6 , en el que detectar la actividad del polipéptido comprende comparar la actividad del polipéptido con una medición de control y/o con un valor umbral.
ES17703670T 2016-02-01 2017-01-25 Receptor nicotínico de acetilcolina de Rhipicephalus y plaguicida que actúa sobre el mismo Active ES2796379T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16153550 2016-02-01
PCT/EP2017/051492 WO2017133938A2 (en) 2016-02-01 2017-01-25 Rhipicephalus nicotinic acetylcholine receptor and pest control acting thereon

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2796379T3 true ES2796379T3 (es) 2020-11-26

Family

ID=55359388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17703670T Active ES2796379T3 (es) 2016-02-01 2017-01-25 Receptor nicotínico de acetilcolina de Rhipicephalus y plaguicida que actúa sobre el mismo

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210221859A1 (es)
EP (1) EP3411395B1 (es)
AU (2) AU2017216079B9 (es)
BR (1) BR112018015752A2 (es)
ES (1) ES2796379T3 (es)
WO (1) WO2017133938A2 (es)

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3993648A (en) 1974-05-08 1976-11-23 Shell Oil Company Tetrahydro-2-(nitromethylene)-2H-1,3-thiazines
EP0192060B1 (de) 1985-02-04 1991-09-18 Nihon Bayer Agrochem K.K. Heterocyclische Verbindungen
JPH0717621B2 (ja) 1986-03-07 1995-03-01 日本バイエルアグロケム株式会社 新規ヘテロ環式化合物
ES2161212T3 (es) 1987-08-01 2001-12-01 Takeda Chemical Industries Ltd Aminas alfa-insaturadas, su produccion y uso.
MA21697A1 (fr) 1988-12-19 1990-07-01 Dow Agrosciences Llc Composes de macrolides.
IE71183B1 (en) 1988-12-27 1997-01-29 Takeda Chemical Industries Ltd Guanidine derivatives their production and insecticides
US5202242A (en) 1991-11-08 1993-04-13 Dowelanco A83543 compounds and processes for production thereof
TW240163B (en) 1992-07-22 1995-02-11 Syngenta Participations Ag Oxadiazine derivatives
US5591606A (en) 1992-11-06 1997-01-07 Dowelanco Process for the production of A83543 compounds with Saccharopolyspora spinosa
US5434181A (en) 1993-10-26 1995-07-18 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Furanyl insecticide
GB9812783D0 (en) 1998-06-12 1998-08-12 Cenes Ltd High throuoghput screen
DE10347440A1 (de) 2003-10-13 2005-05-04 Bayer Cropscience Ag Synergistische insektizide Mischungen
EP1755395A1 (en) 2004-05-10 2007-02-28 Syngeta Participations AG Pesticidal mixtures
WO2006061147A1 (en) 2004-12-07 2006-06-15 Bayer Cropscience S. A. 1-phenyl-3-piperazine-pyrazoles and pesticidal compositions of matter thereof
WO2006061146A1 (en) 2004-12-07 2006-06-15 Merial Ltd. 5-aminopyrazole derivatives as pesticidal compounds
ES2355402T3 (es) 2006-07-06 2011-03-25 Bayer Cropscience Ag Composición plaguicida que comprende un derivado de piridiletibenzamida y un compuesto insecticida.
EP2225940B1 (en) 2009-03-05 2014-03-12 GAT Microencapsulation GmbH Oil dispersions of nAChR binding neonicotinoids
SI2953942T1 (en) 2013-02-06 2018-03-30 Bayer Cropscience Ag Halogen-substituted pyrazole derivatives such as pesticides

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017216079B9 (en) 2021-11-04
AU2017216079A1 (en) 2018-07-12
AU2021254515A1 (en) 2021-11-11
WO2017133938A3 (en) 2017-09-14
AU2021254515B2 (en) 2023-11-02
AU2017216079B2 (en) 2021-10-21
WO2017133938A2 (en) 2017-08-10
EP3411395A2 (en) 2018-12-12
BR112018015752A2 (pt) 2019-01-29
US20210221859A1 (en) 2021-07-22
EP3411395B1 (en) 2020-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Steele et al. In vivo and in vitro assessment of cardiac β-adrenergic receptors in larval zebrafish (Danio rerio)
Qin et al. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila
Mammucari et al. Molecular structure and pathophysiological roles of the mitochondrial calcium uniporter
Band et al. Hypoxia‐induced BNIP3 expression and mitophagy: in vivo comparison of the rat and the hypoxia‐tolerant mole rat, Spalax ehrenbergi
Tavernier et al. β3-Adrenergic stimulation produces a decrease of cardiac contractility ex vivo in mice overexpressing the human β3-adrenergic receptor
Miller et al. Primate trace amine receptor 1 modulation by the dopamine transporter
Finley et al. Expression and coassociation of ERG1, KCNQ1, and KCNE1 potassium channel proteins in horse heart
Sheng et al. Molecular cloning, spatiotemporal and functional expression of GABA receptor subunits RDL1 and RDL2 of the rice stem borer Chilo suppressalis
Piermarini et al. Role of an apical K, Cl cotransporter in urine formation by renal tubules of the yellow fever mosquito (Aedes aegypti)
Guo et al. Cloning, characterisation and expression profiling of the cDNA encoding the ryanodine receptor in diamondback moth, Plutella xylostella (L.)(Lepidoptera: Plutellidae)
Qi et al. Larvae of the small white butterfly, Pieris rapae, express a novel serotonin receptor
Kolosov et al. A role for tricellulin in the regulation of gill epithelium permeability
Mounsey et al. Molecular characterisation of a pH-gated chloride channel from Sarcoptes scabiei
Pelz et al. A novel inhibitory domain of Helicobacter pylori protein CagA reduces CagA effects on host cell biology
Cheng et al. Expression of pheromone biosynthesis activating neuropeptide and its receptor (PBANR) mRNA in adult female Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)
Furutani et al. Exon 3 splicing and mutagenesis identify residues influencing cell surface density of heterologously expressed silkworm (Bombyx mori) glutamate-gated chloride channels
Pataki et al. Drosophila Rab23 is involved in the regulation of the number and planar polarization of the adult cuticular hairs
Huang et al. Interaction of insecticides with heteromeric GABA-gated chloride channels from zebrafish Danio rerio (Hamilton)
Song et al. Various bee pheromones binding affinity, exclusive chemosensillar localization, and key amino acid sites reveal the distinctive characteristics of odorant-binding protein 11 in the eastern honey bee, Apis cerana
JP3623798B2 (ja) グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルをコードするｄｎａ
ES2796379T3 (es) Receptor nicotínico de acetilcolina de Rhipicephalus y plaguicida que actúa sobre el mismo
Callanan et al. Investigating the function and possible biological role of an acetylcholine-gated chloride channel subunit (ACC-1) from the parasitic nematode Haemonchus contortus
US20090117590A1 (en) Human calcium sensitive potassium channel beta3 subunit proteins, encoding nucleic acid and uses thereof
Mistry et al. Syntaxin specificity of aquaporins in the inner medullary collecting duct
Kou et al. Identification of β‐chain of FoF1‐ATPase in apoptotic cell population induced by Microplitis bicoloratus bracovirus and its role in the development of Spodoptera litura