DE1188761B - Verfahren zur Herstellung von Pactamycin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C12d

Deutsche Kl.: 30 h - 6

Nummer: 1188 761

Aktenzeichen: U 9294IV a/30 h

Anmeldetag: 28. September 1962

Auslegetag: 11. März 1965

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Pactamycin durch Züchtung des Streptomyces pactum var. pactum NRRL 2939 auf üblichem biologischem Wege und Gewinnung des Antibiotikums aus der Kulturlösung durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel. Der genannte Mikroorganismus ist bei der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, US. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA., hinterlegt.

. Das Pactamycin stellt eine amphotere Substanz dar, welche das Wachstum bestimmter Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, wie Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsieila pneumoniae, Proteus vulgaris und Salmonella typhi, und von Tumorzellen zu hemmen vermag. Es kann allein oder in Verbindung mit anderen, antibakterielle oder Antitumorwirkung aufweisenden Mitteln verwendet werden und eignet sich z. B. zur Bekämpfung der durch B. subtilis bei Seidenraupen verursachten Infektionen und zur Unterdrückung oder Verringerung der beim Versand und beim Lagern von Fischen durch diesen Mikroorganismus hervorgerufenen Geruchsbildung. Außerdem verhindert es das Wachstum von bestimmten, Schneidöle verunreinigenden Mikroorganismen und kann als Desinfektionsmittel für zahnärztliche und medizinische Geräte verwendet werden, die mit Staphylococcus albus oder Staphylococcus aureus verunreinigt sind sowie als Desinfektionsmittel für gewaschene und gestapelte, mit Staphylococcus aureus verunreinigte Nahrungsmittelbehälter.

Der Streptomyces pactum var. pactum NRRL 2939 hat auf den meisten Medien ein graues bis blaugraues Luftwachstum. Die Unterseite ist grau bis olivgrau. Die Sporen werden von sehr kompakten Spiralen getragen und sind mit feinen Härchen bedeckt. Seine Wachstumseigenschaften auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt:

Tabelle I

Verfahren zur Herstellung von Pactamycin

Anmelder:

The Upjohn Company, Kalamazoo, Mich.

(V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Beil, A. Hoeppener

und Dr. H.-J. Wolff, Rechtsanwälte, Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Als Erfinder benannt:

Alexander Demetrios Argoudelis, Clarence DeBoer,

Thpmas Eugene EbIe,

Ross Robert Herr, Kalamazoo, Mich. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 2. Oktober 1961 (142192)

Tabelle II

Assimilation von Kohlenstoffverbindungen in synthetischen Medien

D-Xylose (+)
L-Arabinose (+)
Rhamnose (+)
D-Fructose (+)
D-Galactose +

	Agar-Medium	Aussehen auf Ekts Oberseite	ichroin Unterseite
1.	Bennetts	graublau	braun
2.	Czapeks Saccharose	Spur, grauweiß	farblos
3.	Maltose-Trypton	grauweiß	gelb
4.	Pepton-Eisen	keine	gelb
5.	0,1% Tyrosin	Spur, grauweiß	blaßgelb
6.	Kasein-Stärke	grauweiß	blaßgelb

* A.Dietz, Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification, Annals of the N. Y., Academy of Science, 60, S. 152 bis 154, 1954.

Cellobiose + Salicin

Raffinose (+) Phenol

Dextrin + Kresol

Inulin (+) Na-Formiat

Lösliche Na-Oxalat Stärke +

D-Glucose + Glycerin + Na-Tartrat —

D-Mannose + Dulcit (+) Na-Salicylat —

Maltose + D-Mannit (+) Na-Acetat +

Saccharose (+) D-Sorbit (+) Na-Citrat (—)

Lactose (+) Inosit (+) Na-Succinat (—)

Kontrollprobe (+) + Positive Assimilation.

(+) Positive Assimilation — nur geringes Wachstum. (—) Geringes Wachstum — keine Assimilation.

— kein Wachstum.

* T. G. Pridham und D. Gottlieb, »Assimilation of Carbon Compounds in Synthetic Medium«, J. Bact, 56, 107 bis 114, 1948.

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Tabelle III Eigenschaften der Kulturen

Medium	Oberseite	Unterseite	blau	Sonstige Merkmale
Einfache Gelatine	blaßgrau		gelbbraun	gelbes Pigment, teilweise Verflüssigung
Nährgelatine	grauweiß	—	blaßgrauweiß	gelbes Pigment, teilweise Verflüssigung
Nährnitratlösung			gelb	farbloses vegetatives Wachstum, das auf die Unterlage fällt, gelbes Pigment, keine Reduktion
Synthetische Nitratlösung ..	blaßgrauweiß	—	blaßgelbbraun	Oberflächenhäutchen, überall leichtes Wachstum; Spur gelbes Pigment, Reduktion
Lackmusmilch	blaßgrauweiß	blaßgelb	Oberflächenhäutchen, Peptonisierung; pH 7,1
Pepton-Eisenagar	blaßgraurosa	cremefarben	kein Dunkelwerden mit H8S
Calciummaleat-Agar	blaßgrauweiß	gelbbraun	Maleat nicht verflüssigt
Magerrnilch-Agar	blaßgraurosa	gelbbraun	gelbes Pigment; Casein wird hydrolysiert
Glucose-Asparagin-Agar ...	blaßlavendelrosa	blaßgrauweiß	blaßgelbbraunes Pigment
Tyrosin-Agar	blaßgrauweiß	blaßgelbes Pigment, Tyrosin löslich gemacht
Xanthin-Agar	blaßgrauweiß	blaßgelbes Pigment; Xanthin wird wäh rend des Wachstums geing gelöst
Maltose-Trypton	lavendelgrau mit baumwollartigen weißen Flocken	kein Pigment
Benetts Agar	blaugrau	gelbbraunes Pigment; grauweißes Luft wachstum bei 18 und 240C; blaugrau bei 28 und 370C; gelbe Unterseite bei 18 und 240C; gelbbraun bei 28 und 37°C; kein Wachstum bei 550C
Czapeks Saccharose-Agar ..	blaßgrauweiß	kein Pigment; blaßgrauweißes Luftwachs tum bei 18, 24, 28° C; grau bei 370C, gelbe Unterseite bei 18 und 240C, grauweiß bei 28°C; graubraun bei 370C; kein Wachstum bei 550C

Erfindungsgemäß wird der Streptomyces pactum var. pactum NRRL 2939 in einem wäßrigen, eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Spurenelemente enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen in einer submersen oder Oberflächenkultur gezüchtet. Hierbei wird die Temperatur zwischen etwa 18 und 4O⁰C und vorzugsweise zwischen etwa 26 und 3O⁰C gehalten. Gewöhnlich wird innerhalb von etwa 2 bis 10 Tagen eine optimale Bildung des Antibiotikums erreicht. Während der Fermentation ist das Kulturmedium normalerweise etwa neutral oder alkalisch. Der End-pH-Wert ist vom Anfangs-pH-Wert des Nährmediums abhängig und, falls vorhanden, von den zugesetzten Puffersubstanzen. Der pH-Wert wird vor der Sterilisierung vorzugsweise auf etwa 6 bis 8 eingestellt.

Zur Durchführung des Verfahrens in großem Maßstab bevorzugt man die vegetative Form des Mikroorganismus als Impfstoff. Hierdurch wird eine Verzögerung bei der Erzeugung des Antibiotikums verhindert und die Kapazität der Anlage besser ausgenutzt. Den vegetativen Impfstoff erhält man dadurch, daß man ein Nährmedium mit einer Bodenoder Schrägkultur impft und die erhaltenen Kulturen aseptisch in große Kessel oder Tanks überführt, die das gleiche oder ein anderes Nährmedium enthalten, wie es für die Herstellung des vegetativen Impfstoffs verwendet wurde.

Das neue Antibiotikum, Pactamycin, stellt eine bifunktionelle Verbindung der empirischen Formel C₂₈H₄₀N₄O₈ dar. Die basische Funktion hat einer pKa'-Wert von etwa 6,25 bis 25, der pKa'-Wert det sauren Funktion beträgt 9,00 bis 9,60. Das Antibiotikum ist gut löslich in niederen Alkanolen, z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol und den Butanolen; in niederen Alkylestern von niederen Alkancarbonsäuren, z. B. Äthylacetat, n-Butylacetat und Amylacetat, sowie in chlorierten niederen Alkanen, z. B. Methylenchlorid, _ Chloroform und Äthylendichlorid. In Benzol und Äther ist es etwas löslich, dagegen unlöslich in technischem η-Hexan (Siedepunkt 60 bis 68⁰C) und in Cyclohexan. In Wasser ist es bei pH-Werten unter 5,0 und übei 9,5 löslich. Am isoelektrischen Punkt (pW-Wert etwa 8,3) ist seine Löslichkeit in Wasser am geringsten.

Nach einem bevorzugten Verfahren wird das gesamte Kulturmedium, gegebenenfalls nach Einstellung auf einen etwa neutralen oder darunterliegendem

pH-Wert, zweckmäßig auf einen pH-Wert zwischen 2 und 4, auf 40 bis 80⁰C erhitzt und filtriert. Hierbei kann ein Filterhilfsmittel, z. B. Diatomeenerde, verwendet werden. Das Filtrat wird auf eine Temperatur von 0 bis 5°C gekühlt. Dann wird der pH-Wert des Filtrats mit einer geeigneten Base, z. B. Natriumhydroxyd, auf einen Wert über 7,5, vorzugsweise auf pH 7,5 bis 8,5, eingestellt. Anschließend wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und das Antibiotikum aus dem Lösungsmittelextrakt gewonnen. Gegebenenfalls kann man den Lösungsmittelextrakt ansäuern und so das Antibiotikum in Form des Säureanlagerungssalzes gewinnen, z. B. durch Einstellen des pH-Wertes mit einer wäßrigen Lösung einer Säure, die mit dem Antibiotikum ein wasserlösliches Salz bildet, z. B. mit Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Essigsäure auf unter 7,5, vorzugsweise auf pH 2 bis 6 und Eindampfen der abgetrennten wäßrigen Lösung. Das Extraktionsverfahren kann man, bevor das Salz gewonnen wird, wiederholen, um eine Reinigung zu bewirken. Hierbei kann man zusätzlich das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel austauschen, um den Reinigungseffekt zu verstärken. Hierfür eignet sich Methylenchlorid, das Verunreinigungen aus den wäßrigen Lösungen der Salzform auswäscht. Methylenchlorid kann auch zur Extraktion der freien Base aus wäßrigen Lösungen der Base verwendet werden.

Eine andere Möglichkeit zur Gewinnung des Antibiotikums besteht in der Adsorption auf Kationenaustauscherharzen vom Carbonsäure- und auch vom Sulfonsäuretyp. Geeignete Carbonsäureharze sind die durch Mischpolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol erhältlichen Polyacrylsäureharze (vgl. Ion Exchange Resins, S. 87, 2. Ausgabe [1958], John Wiley and Sons, Inc.). Als Sulfonsäureharze eignen sich die am Kern sulfonierten, mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharze (vgl. a. a. O., S. 84).

Aus dem Kationenaustauscherharz wird das in Salzform vorliegende Antibiotikum mit angesäuertem Wasser ausgewaschen, dessen pH-Wert vorzugsweise unter dem pKa' des verwendeten Kationenaustauscherharzes liegt. Befriedigende Ergebnisse werden bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 6 erreicht. Der Säure-Überschuß im Eluat wird mit einer Base, z.B. Natriumhydroxyd oder einem stark basischen Anionenaustauscherharz, neutralisiert und der pH-Wert auf 7,5 bis 8,5 eingestellt. Darauf wird das Antibiotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Für die Neutralisierung geeignete Anionenaustauscherharze sind chlormethylierte, gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetzte Polystyrole, die mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin quaternisiert sind (vgl. a. a. O., S. 97 in Verbindung mit S. 84).

Für die Adsorption können auch oberflächenaktive Adsorptionsmittel, z. B. Silikate, Entfärbungskohle und Entfärbungsharze, verwendet werden, aus denen das adsorbierte Material mit einem Lösungsmittel eluiert wird. Ein geeignetes kapillaraktives Harz dieser Art ist das in der USA.-Patentschrift 2702263 beschriebene Harz.

Das auf diese Weise isolierte Antibiotikum kann durch mehrfache Umwandlung von der Salz- in die Basenform und umgekehrt mit gegebenenfalls zwischengeschalteten anderen Behandlungsarten, wie Lösungsmittelextraktionen, chromatographischen Behandlungen und fraktionierten Flüssigkeits-Flüssigkeits-Extraktionen gereinigt werden.

Für die fraktionierte Flüssigkeits-Flüssigkeits-Extraktion in chromatographischen Trennkolonnen oder in Gegenstromverteilungsvorrichtungen eignen sich die folgenden Lösungsmittelsysteme: Äthylacetat —Wasser 1:1; Cyclohexan—Äthylacetat—Wasser 1:1:1,5.

Zur Reinigung kann die in der Salz- oder Basenform vorliegende Verbindung auch in schwer lösliche Formen, z. B. das Pikrat, übergeführt werden, die sich für den gleichen Zweck wie die freie Base eignen und die in die freie Base oder mit anderen Säuren wie Salz-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Oxal-, Milch-, Malein-, Fumar-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Helianthin-, Reineckes oder Azobenzolsulfonsäure wieder in andere Salze übergeführt werden können.

Die Wirksamkeit von Pactamycin gegenüber Bakterien, Tumorzellen und Fungi ist in den Tabellen I bis III zusammengestellt:

Tabelle I Antibakterielle Wirksamkeit von Pactamycin

Testorganismus

Bakterien:

Bacillus subtilis

Staphylococcus aureus ...

Staphylococcus albus

Streptococcus hemolyticus

Streptococcus fecalis

Streptococcus viridans ...

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae ...

Pasteurella multocida

Proteus vulgaris

Salmonella typhi

Salmonella pullorum

Pseudomonas aeruginosa .

Mindest-

hemmkonzen-

trationen

y/ccm

0,8

0,2

0,05

1,6

1,6

3,2

6,5

0,8

0,012 110 35

1,6 110

Tabelle II Antimorwirksamkeit von Pactamycin

Tumor

Ehrlich-Carcinom

Gliom-26

Ca-755

Iglesias-Nebennierentumor Crabb-Hamster-Sarcom .. Fortner-Adenocarcinom

des Dünndarms

Rous-Sarcom

L-1210G

Menschliches Melanom

(ME-I)

Menschliches Chlorioncarcinom bei Hamstern ...

Dosis

mg/kg

1 1 2 1 0,5

0,5

1,5 0,75

Tumorhemmung*

0/ /0

39 35 30 47 7 bis

25 30 40*

58 90

Toxizität

* Prozentuale Zunahme der Überlebensdauer.

Tabelle III
Wirksamkeit von Pactamycin gegen Fungi

IO

	Wachstums	_
Fungi	hemmung*	—
	lOOOy/ccmj lOy/ccm	—
Nocardia asteroides	+	—
Blastomyces dermatidis	-j-	—
Coccidioides immitis	+	—
Geotrichum sp	-f-	—
Hormodendrum compactum ..	+	—
Phialophora verrucosa	+	—
Cryptococcus neoformans	+	—
Histoplasma capsulatum	-J-	—
Sporotrichum schenkii		—
Monosporium apiospermum ..	+	—
Trichophyton rubrum	+	—
Microsporum canis	-f-	—
Trichophyton interdigitale	+
Candida albicans Abbott	-|-
Trichophyton violaceum	+

20

* + = vollkommene Hemmung;
— = keine Hemmung.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. In ihnen sind alle angegebenen Prozente Gewichtsprozente und alle Lösungsmittelteile Volumteile, falls nichts anders angegeben ist.

Den Inhalt der beiden Tanks verwendete man zum Impfen von zwei 380-1-Gärtanks, die jeweils 2501 des folgenden sterilen Mediums enthielten.

Hefe(Pabst) 25 g/l

Restmelasse 50 g/l

Glucosemonohydrat 15 g/l

Der pH-Wert wurde mit 50%ig^er wäßriger NaOH-Lösung auf 6,4 gebracht; anschließend wurde CaI-

ciumcarbonat zugegeben 5 g

Specköl 5 ccm/1

Leitungswasser Rest

Beide Gärtanks wurden 5 Tage bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 100 l/Min, und einer Rührgeschwindigkeit von 200 UpM auf einer Temperatur von 32°C gehalten.

Hierbei wurden die folgenden pH-Werte und biologischen Aktivitäten festgestellt:

35

Beispiel 1

a) Fermentation

Eine Bodenprobe von Streptomyces pactum var. pactum NRRL 2939 wurde zum Beimpfen von zehn 500-ccm-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die jeweils 100 ecm des folgenden Mediums enthielten:

Glucosemonohydrat 25 g

Baumwollsaatmehl 25 g

Leitungswasser zum Auffüllen auf 11

' Vor der Sterilisation des Mediums betrug der pH-Wert 7,2. Der Mikroorganismus wurde 3 Tage bei 28 ⁰C auf einer mit 250 UpM betriebenen Drehschüttelvorrichtung gezüchtet.

Zwei der Schüttelflaschen wurden als Impfstoff für zwei 20-1-Tanks verwendet, von denen jeder 15 1 des folgenden sterilen Mediums enthielt:

Erster Tank	Stundet	1	pH-Wert	B. subtilis* Bioeinheiten je Kubikzentimeter	pH-Wert	B. subtilis*	108	Gewebe-
68		6,75			Bioeinheiten	355	Kultur**
92		7,7			je Kubikzentimeter	200	KB Einheit
116		8,1		6,9			je Kubik
	Zweiter Tank	7,6	140	zentimeter
		ί	165	1,6
		1,2		18,0
Stunden		230	40,0
70
94
118

* Eine Bioeinheit ist jene Menge Antibiotikum, die bei Lösung in 0,8 ecm Versuchslösung und Auftragen auf eine 12,7 mm große Scheibe unter normalen mikrobiologischen Bedingungen eine 20-mm-Hemmzone ergibt. ** Maß für die Hemmung der Proteinsynthese in einer Gewebekultur unter Verwendung von KB-Zellen.

Jene Verdünnung einer Materialeinheit, die eine 50°/„ige Hemmung der Proteinsynthese bewirkt

KB Einheit je Materialeinheit (Milligramm
von Kubikzentimeter)

1000

Glucosemonohydrat 10 g/l

Baumwollsaatmehl 10 g/l

Enzymatisch hydrolysiert« Proteine

tierischen Ursprungs 10 g/l

Specköl 2 cm/1

Leitungswasser Rest

Der pH-Wert des Mediums betrug vor der Sterilisation 7,2. Auf diesem Medium ließ man den Mikroorganismus 24 Stunden bei einer Temperatur von 28 ⁰C und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 l/Min, wachsen. Dabei wurde das Medium mit einer Geschwindigkeit von 400 UpM gerührt.

55

b) Extraktion

Das gesamte Kulturmedium des ersten Tanks (2501) wurde auf 60° C erhitzt, mit konzentrierter Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,55 gebracht und unter Verwendung von 4% Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat (2401) wurde gekühlt, mit 50%igem wäßrigem Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 8,5 gebracht und einmal mit 561 Äthylacetat extrahiert. Das extrahierte Filtrat (240 1) wurde verworfen. Der

Äthylacetatextrakt wurde mit 6 1 Wasser gewaschen. Das Waschwasser wurde verworfen; der gewaschene Äthylacetatextrakt wurde darauf mit Wasser, das mit Salzsäure auf den pH-Wert 1,95 angesäuert war, ex-

trahiert. Der wäßrige Extrakt (161) wurde mit 10%igem Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 5,5 eingestellt. Anschließend wurde er gefriergetrocknet. Man erhielt 41 g Produkt (A¹).

Der zweite Tank wurde auf die gleiche Weise behandelt. Man erhielt 22,7 g Produkt (B¹).

Nachfolgend sind die Daten für den Inhalt des ersten Tanks zusammengestellt:

gewicht von etwa 558) und ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum in

Äthanol	a	= 51,22;
5 239,5 ΐημ;	a	= 14,81;
264 (sh) ιημ;	a	= 4,88;
313 πιμ;	a	= 3,25;
356 ΐημ;

	Vo	B. Subtilis	Gesamtzahl
	lumen	Bio-	der
Fraktion		einheiten	Bio
	1	je Kubik	einheiten
		zentimeter	Million
Gesamtes Kultur	250
medium	240	330	82,5
Filtrat	56	300	72
Äthylacetatextrakt	240	750	42
Extrahiertes Filtrat	16	35	8,4
Wäßriger Extrakt		2400	38,4
Gefriergetrocknetes	41 (g)
Produkt (A1) ...	800 mg	32,8

Die Gewebekulturprüfung der Produkte (A¹) und

(B¹) ergab:

ίο 0,01 äthanolischer H₂SO₄

238 ΐημ; a = 50,45;

262 (sh) ΐημ; a = 14,65;
314 ΐημ; a = 4,75;

252 πιμ; a = 3,51;

0,01 äthanolischer KOH

238,5 ΐημ; a = 56,38;
264 ιημ; a = 16,01;

322 πιμ; a = 6,05.

In Wasser wurde eine basische Funktion vom pKa' = 7,25 und eine saure Funktion vom pKa' = 9,35 ermittelt. Der Ferrichloridtest war negativ. Infrarotabsorptionen (Figur der Zeichnung) bei folgenden Wellenlängen (cm-¹):

(A¹) 29 KBE/mg

(B¹) 91 KBE/mg

c) Reinigung

Die Produkte (A¹) und (B¹) wurden vereinigt und einer Gegenstromverteilung unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Äthylacetat und Wasser (1:1) unterworfen. Die Feststoffbestimmungen wurden nach hundertfünfzig Überleitungen durchgeführt. Die Produkte aus den Rohren 131 bis einschließlich 140 wurden vereinigt. Man erhielt 8,4 g Produkt (C¹). Die Gewebekulturprüfung ergab 200 KBE/mg. 6 g dieses Produktes wurden in einem Gemisch von 15 ecm Methylenchlorid und 15 ecm Aceton gelöst und durch eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat geführt, die durch Aufschlämmung von 300 g dieses Silikats in Hexankohlenwasserstoffen und Einfüllen in eine Glaskolonne mit einem Innendurchmesser von 7,5 cm und einer Höhe von etwa 45,7 cm hergestellt worden war. Die Kolonne wurde mit den folgenden Lösungsmitteln eluiert: .

3333* M**	M	1455	S(Ol)	975	M
3175	S (Öl)	1370	S (Öl)	950	W
2890	M (Öl)	1320	S	940	W
2815	W	1285	S	920	W
1718	S	1247	S	870	W
1658	S	1205	S	803	M
1592	S	1160	M	778	M
1575	S	1100	S	719	W (Öl)
1515	S	1080	M	699	M
1504	1038	M	685	M

* Frequenztoleranzen: ± 20 cm"¹ im Bereich von 3800 bis 2000 cm-¹; ± cm-¹ im Bereich von 2000 bis 1700 cm-¹; ± 5 cm"¹ im Bereich von 1700 bis 700 cm"¹. Der Abstand zwischen den benachbarten Banden soll wie in der Tabelle angegeben sein, bei einer Toleranz von einem Fünftel der Frequenztoleranz.

** Die Bandenintensitäten sind als »S«, »M« bzw. »W« angegeben und werden in bezug auf den Hintergrund neben den Banden geschätzt. Eine »S«-Bande hat die gleiche Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum; »M«-Banden haben zwischen einem Drittel und zwei Drittel der Intensität der stärksten Bande und »W«-Banden haben unter etwa einem Drittel der Intensität der stärksten Bande. Die Schätzungen beruhen auf einer Skala für prozentuale Durchlässigkeit.

Fraktion Nr.	Lösungsmittel	Gewicht	Gewebe kultur
		mg	KBE/mg
1	Hexankohlenwasser
	stoffe (H)	—	—
2	H—Aceton 90:10
3	H—Aceton 80:20
4	H—Aceton 80:20	—	—
5	H—Aceton 75:25	330	91
6	H—Aceton 75:25	680	83
7	H—Aceton 70:30	240	91
8	H—Aceton 70:30	60	143
9	H—Aceton 65:35	20	—

55

Beispiel 2

a) Fermentation

In zwei 250-1-Tanks wurde das unter 1, a) beschriebene Verfahren wiederholt. Dabei wurden folgende Bioaktivitäten festgestellt:

Das eluierte Produkt (D¹) hatte ein Äquivalentgewicht von 279 (entsprechend einem Molekular-

	f	1	1	Gärzeit	B. subtilis
Tank			Bioeinheiten
JNr.	2 {	64 Stunden	je Kubikzentimeter
1	88 Stunden	<100
	112 Stunden	< 100
64 Stunden	400
88 Stunden	<100
112 Stunden	100
490

509 518/425

b) Extraktion

Das gesamte Kulturmedium aus den Tanks Nr. 1 und 2 wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,7 bis 2,8 gebracht, auf 60° C erhitzt, auf 25° C gekühlt und dann (500 1) unter Verwendung von 4% Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterrückstand wurde gewaschen. Das Waschwasser wurde mit dem Filtrat vereinigt. Das Filtrat (510 1) wurde auf den pH-Wert 8,5 gebracht und einmal mit einem Drittel seines Volumens Äthylacetat extrahiert. Die ent- ίο

standene Emulsion wurde durch Zentrifugieren getrennt. Man erhielt 54 1 Äthylacetatextrakt. Der Äthylacetatextrakt wurde mit 2,2 1 Wasser, das mit Salzsäure auf den pH-Wert 1,9 angesäuert war, extrahiert. Die 2,21 wäßrigen Extraktes wurden mit 50%igeni wäßrigem Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 5,5 eingestellt und gefriergetrocknet. Man erhielt 15 g Produkt (A²).

Die Produktverteilung ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Fraktion	Volumen 1	B. Subtilis Bioeinheiten je Kubikzentimeter	Gesamte Bioeinheiten Millionen
Gesammeltes Kulturmedium Filtrat	500 510 54 49 15g	545 400 1800 800 2400 mg	272,5 204 97,2 39,2 36
Äthylacetatextrakt Mit Wasser extrahiertes Äthyl acetat
Gefriergetrocknetes Produkt (A2) ...

c) Reinigung ^a5 geengt, die anschließend über eine Säule aus 300 g

synthetischem, in Hexankohlenwasserstoffen aufge-

Das Produkt (A^a) (15 g) wurde zweimal mit je schlämmtem Magnesiumsilikat gereinigt wurden. Die 300 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte (600 ecm) Säule wurde mit je 400 ecm der folgenden Lösungswurden gesammelt und im Vakuum auf 50 ecm ein- mittel eluiert:

Fraktion Wr	Lösungsmittel	Gewicht	KBE/mg	B. subtilis Bioeinheiten
INI.		mg		je Milligramm
1	Hexankohlenwasserstoffe (SSB)	_		__
2	H + Aceton (90:10)	—	—	—
3	H + Aceton (80:20)	—	—	—
4	H + Aceton (75:25)	—	—	—
5	H+Aceton (75:25)	—	—	—
6	H + Aceton (70:30)	280	250	5,500
7	H + Aceton (70:30)	740	71	4,400
8	H + Aceton (70:30)	520	143	5,400
9	SSB + Aceton (70:30)	260	200	4,400
10	H+Aceton (70:30)	300	100	4,400

Die Fraktionen 6 bis 10 wurden gesammelt und in einem Craig-Gegenstromverteiler (vierhundert Rohre) unter Verwendung eines Systems aus Cyclohexan, Äthylacetat und Wasser (1:1:1,5) verteilt. Die Fraktionen 331 bis 370 wurden vereinigt und im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, die lyophilisiert wurde. Man erhielt 1,7 g Produkt (B²), das 3600 bis 4000 B. subtilis Bioeinheiten je Milligramm, einen Schmelzpunkt von 82 bis 83° C und ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum mit den folgenden Werten hatte:

Äthanol

239,5 ταμ; a = 52,65;

264(β1ι)ηιμ; a = 14,76;

313 πιμ; a = 5,21;

0,01 äthanolische H₂SO₄

238 πιμ; a = 49,42;
262 ΐημ; a = 14,61;
314 πιμ; a = 4,40;
252 πιμ; a = 3,45;

0,01 äthanolische KOH

238,4 ηιμ; a = 56,68;
264 ηιμ; a = 16,11;
322 ηιμ; a = 6,05.

Es ergab das gleiche Infrarotabsorptionsspektrum wie das Produkt (D¹) des Beispiels 1, c) (vgl. Fig. 1).

Elementaranalyse für C₂₈H₄₀N₄O₈:
Berechnet ... C 59,98, H 7,20, N 10,00, O 22,83; gefunden ... C 60,33, H 7,07, N 9,34,0 22,99.

Beispiel 3
a) Fermentation

Die im Beispiel 1, a) beschriebene Fermentation wurde in einem 5000-1-Gärtank wiederholt.

b) Extraktion

Das gesamte Kulturmedium (4400 1) Wirksamkeit gegenüber B. subtilis 120 Einheiten je Kubikzentimeter wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,8 gebracht, auf 6O⁰C erhitzt, auf 30°C

gekühlt und unter Verwendung von 4% Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterrückstand wurde gewaschen. Das Filtrat mit dem Waschwasser (4800 1) wurde auf 5°C gekühlt, mit 50%iger wäßriger Natriumhydroxydlösung auf den pH-Wert 8,5 ge- S bracht und anschließend dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Der erste Äthylacetatextrakt (450 1) wurde abgetrennt. Der zweite und der dritte Äthylacetatextrakt wurden vereinigt (3160 1). Der erste Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, mit 50%iger wäßriger ίο Natriumhydroxydlösung auf den pH-Wert 8,5 gebracht und anschließend mit entionisiertem Wasser, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf den pH-Wert 1,7 angesäuert war, extrahiert. Der wäßrige Extrakt (111) wurde auf den pH-Wert 8,5 gebracht und zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die beiden Äthylacetatextrakte wurden vereinigt (8 1) und ergaben das Produkt (A³).

Die vereinigten Äthylacetatextrakte (zweiter und dritter Extrakt) wurden auf das halbe Volumen {15801) eingeengt und mit wäßriger Säure vom pH-Wert 1,7 in der oben beschriebenen Weise extrahiert. Der erhaltene erste wäßrige Extrakt wurde mit 50°/₀iger wäßriger Natriumhydroxydlösung neutralisiert und zum Produkt (B³) gefriergetrocknet. Der zweite wäßrige Extrakt wurde mit Äthylacetat vom pH-Wert 8,5 extrahiert und der erhaltene Äthylacetatextrakt durch azeotrope Destillation getrocknet und zur Trockne eingedampft, Produkt (C³). Die Produkte (B³) und (C³) wurden zusammen in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatlösung (2,6 1) wurde auf eine Säule aus 1810 g synthetischem Magnesiumsilikat vom Durchmesser 7,5 cm gegeben. Die Höhe der Säule betrug 81,3 cm, das Flüssigkeitsfassungsvermögen 3300 ecm. Die Beschickung wurde mit 1 Volumteil Hexankohlenwasserstoffen auf die Säule gespült, die zuvor mit Hexankohlenwasserstoffen gewaschen worden war. Die Säule wurde in folgender Weise eluiert:

1 Volumteil Hexankohlenwasserstoffe
(H)-Aceton (90:10);

1 Volumteil H—Aceton (80 :20);
1 Volumteil H—Aceton (75:25);
4 Volumteile H—Aceton (70:30).

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Die anfängliche Strömungsgeschwindigkeit des aus der Säule ausfließenden Materials betrug 300 ccm/Min. Während der letzten Elutionsstufen fiel die Geschwindigkeit allmählich auf 150 ccm/Min. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Man erhielt 19 g Feststoffe, Produkt (D³). Wirkung gegenüber B. subtilis 2500 Bioeinheiten je Milligramm.
_ Das oben beschriebene Produkt (D³) wurde in 11 Äther gelöst. Die Ätherlösung wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das erhaltene leicht gelbliche Material wurde im Vakuum 2 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet und ergab 12,2 g Produkt (E³). Die weitere Reinigung erfolgte über synthetisches Magnesiumsilikat. 300 g synthetisches Magnesiumsilikat wurden in Hexankohlenwasserstoffen aufgeschlämmt und in eine Glassäule mit einem Innendurchmesser von 7,5 cm gegeben. Die Säule hatte ein Flüssigkeitsfassungsvermögen von 200 ecm. Das Produkt (E³) wurde in 200 ecm Methylenchlorid aufgeschlämmt und in den oberen Teil der Kolonne eingeführt. Die Kolonne wurde mit je 200 ecm der folgenden Lösungsmittel eluiert:

Fraktion Nr.	Lösungsmittel	Gesamt feststoffe
		mg
1	Hexankohlenwasserstoffe (H)	200
2	H + Aceton (90 :10)	100
3	H + Aceton (80:20)	100
4	H + Aceton (75 :25)	100
5	H + Aceton (70:30)	200
6	H -+- Aceton (70: 30)	310
7	H + Aceton (70:30)	5200
8	H + Aceton (70: 30)	2140
9	H + Aceton (70:30)	780
10	H + Aceton (70:30)	330
11	H + Aceton (70: 30)
12	H + Aceton (50: 50)
13	H + Aceton (50: 50)
14	Aceton
15	Aceton

Die besten Fraktionen 6, 7, 8 und 9 ergaben eine Wirksamkeit gegenüber B. subtilis von 3400 bis 4600 Bioeinheiten. Die Fraktion 8 hatte 3,4 B. subtilis Bioeinheiten/y. Die Fraktion 7 zeigte ein Ultraviolettabsorptionsspektrum in Äthanol von

239 ηιμ; a
313 πιμ; a
355 πιμ; a

= 48,2;
= 4,6;
= 3,02

und die folgende Elementaranalyse für C₂₈H₄₀N₄O₈: Berechnet ... C 59,98, H 7,20, N 10,00, O 22,83; gefunden ... C 60,80, H 7,22, N 9,16, O 22,82

(durch Differenz).

d) Pactamycincitrat

Eine gesättigte Lösung von Zitronensäure in Äther wurde langsam zu 30 ecm einer Ätherlösung gegeben, die 400 mg des Produktes aus der Fraktion 9 von Beispiel 3, c) enthielten, bis sich kein weiterer Niederschlag mehr bildete. Der Niederschlag, ein weißes amorphes Material, wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet; die Ausbeute betrug 450 mg. Etwa 300 mg dieses Materials wurden in 1 ecm Aceton gelöst und durch langsames Zusetzen von Äther erneut ausgefällt. Die Ausbeute betrug 150 mg mit einer Wirksamkeit von 111 KBE/mg in Gewebekultur und einer Wirkung von 1050 y/mg (freie Base) gegen B. subtilis.

Elementaranalyse für C₂₈H₄₀N₄O₈ · C₆H₈O₇:
Berechnet .... C 54,25, H 6,43, N 7,44, O 31.88; gefunden .... C 54,01, H 6,52, N 7,14, O 32,33

(durch Differenz).

e) Pactamycinoxalat

Eine gesättigte Lösung von Oxalsäure in Äther würde zu 25 ecm Äther gegeben, die 300 mg des Produktes aus der Fraktion 8 von Beispiel 3, c) enthielten, bis sich kein weiterer Niederschlag mehr bildete. Dann ließ man das Ganze 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das getrocknete Material (480 mg) wurde nochmals aus einer Methanol-Äther-Lösung ausgefällt. Man

erhielt 220 mg eines weißen amorphen Pulvers, das eine Wirksamkeit von 177 KBE/mg in Gewebekultur und eine Wirkung von 1250 γI vag (freie Base) gegenüber B. subtilis hatte.

Elementaranalyse für C₂₈H₄₀N₄O₈ · C₂O₄H₂:
Berechnet .... C 55,37, H 6,51, N 8,61, O 29,51; gefunden .... C 54,85, H 6,50, N 8,73, O 29,92.

f) Pactamycinhydrochlorid

Chlorwasserstoff wurde durch 25 ecm einer Ätherlösung geleitet, die 300 mg des Produktes aus der Fraktion 8 des Beispiels 3, c) enthielten, bis kein weißer Niederschlag mehr gebildet wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Man erhielt 325 mg Pactamycinhydrochlorid mit einer Wirksamkeit von 43,5 KBE/mg

in Gewebekultur und einer Wirkung von 1175y/mg (freie Base) gegenüber B. subtilis.

Elementaranalyse für C₂₈H₄₀N₄O₈ · HCl: Berechnet

C 56,32, H 6,92, N 9,39, O 21,44, Cl 5,94; gefunden

C 56,18, H 6,93, N 8,75, O 21,97, Cl 6,17 (durch Differenz).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Die Verwendung von Streptomyces pactum var. pactum NRRL 2939 zur Herstellung von Pactamycin auf üblichem biologischem Wege und Gewinnung des Antibiotikums aus der Kulturlösung durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   509 518/425 3.65 © Bundesdruckerei Berlin