PT86502B - Processo para a producao de um novo antibiotico do grupo da efrotomicina - Google Patents

Description

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Este invento diz respeito a um novo composto antibiótico do grupo de efrotomicinas, a composições que contêm o citado composto e a um processo de emprego do citado composto. Mais especificamente, este invento diz respeito a um composto, que estâ intimamente relacionado com a família das efrotomicinas de antibióticos, que inclui tais agentes como a efrotomicina, a mocimicina, o aurodox, a henei-comicina, a factumicina, a azdimicina e a círrotricina. Este tema tem sido examinado de novo por Parmeggiani e outros, Properties and Action of Kirromycin (Mocimicina) and Related Antibiotics, Top Antibiot. Chen, 159-221 , 1980.

Na investigação de novos antibióticos, tem sido tentada, sempre que possível, a modificação estrutural dos antibióticos conhecidos. Esta tentativa ê limitada, contudo, por modificações que retêm a actividade desejada.Muitos antibióticos, incluindo a efrotomicina, têm estruturas tão complexas, que mesmo as pequenas alterações se tornam dificeis para serem feitas por meios químicos. A descoberta de novos antibióticos, produzidos pelos processos de fermentação, continua, por isso, a ser de grande importância, mesmo nos casos em que o antibiótico, uma vez reconhecido, ê muito semelhante a um antibiótico conhecido no precedente.

Os antibióticos conhecidos, an-teriormente referidos, são activos contra uma série de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, e têm sido empregados, com diversos graus de sucesso, no tratamento de infecções bacterianas e na promoção do crescimento e/ou do aperfeiçoamento da eficiência alimentar nos animais domésticos.

Entre uma diversidade de doenças, que podem ser tratadas com estes agentes, enumeram-se a disenteria suína e a enterite.

A disenteria suína ê uma das mais vulgares doenças suínas, diagnosticadas nos Estados Unidos da América. Em complemento, a doença ê predominante em muitos outros países, e anualmente origina perdas consideráveis na reserva dos produtores de suínos, em todo o mundo. Descobriu-se, recentemente, que um espiroqueta grande é o organismo causador da doença. Este organismo, o Treponema hyodys-enteriae, foi agora isolado, e demonstrou-se ser capaz de produzir a doença ^Harris, D.L. e outros. "Swine Dysentery 1, Innoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (Espécie NOva) and Reproduction of the Disease, Vet. Med/SAC, 67, 61-64, 19727. Os dados das experiências, relatadas a seguir, nesta Memória Descritiva, dizem respeito a experiências conduzidas com este organismo.Deve observar-se que não se sabe se 0 T. hyodysenteriae é 0 único organismo causador da disenteria suína. Contudo, dos dados alcançados, pode concluir-se que ê uma origem primordial da infecção. A enterite ê uma outra doença, que pode originar perdas económicas graves aos produtores de gado. A enterite desenvolve-se em aves domésticas, nos suínos, no gado vacum e nas ovelhas, e é atribuída, principalmente, âs bactérias anaeróbicas, especialmente a Clostridium perfringens e virus. A enterotoxemia, em ruminantes, um exemplo da qual é a "doença da superaiimentação" nas ovelhas, ê uma doença originada pela infecção de C. perfringens. 0 realçamento da realização (ritmo aumentado do desenvolvimento e/ou a eficiência aumentada da utilização da alimentação), em ruminantes, tais como 0 gado vacum, e nos animais monogástricos tais como os suínos, ê um outro objectivo desejável economicamente da ciência veterinária. De particular interesse é a realização aperfeiçoada, atingida pelo aumento da eficiência da utilização da alimentação. 0 mecanismo, para a utilização da parcela nutritiva principal da alimentação dos ruminantes, ê bem conhecida.Os ϊ -5 ϋ

microrganismos, no rúmen do animal, degradam os carbohidratos, para produzir os monossacarídeos, e, em seguida, para conyer-ter estes monossacarídeos em compostos de piruvatos.Os piruva-tos são metabolizados por processos microbiolôgicos, para formar os acetatos, os butiratos ou os propionatos, conhecidos, colectivamente, como ácidos gordos voláteis. Para um estudo mais pormenorizado, veja Leng em "Physiology of Dipertion and Metabolism in the Ruminant, "Phi11ipson" et a 1., Eds, Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, páginas 408 a 410. A eficiência relativa da utilização dos ácidos gordos voláteis é estudada por McCullough em "Feedstuff ", 19 de Junho de 1971, página 19; Eskeland et a 1., em J. An. Sei., 3_39 282, 1971; e Church et al., em "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Volume 2, 1971, páginas 622 e 625. Não obstante os acetatos e os butiratos serem empregados, os propionatos são empregados com maior eficiência. Além de mais, quando muito pouco propionato se torna a-cessível, os animais podem desenvolver a cetose. Um composto benéfico, por isso, estimula os animais a produzirem uma proporção maior de propionatos, a partir dos carbohidratos, aumentando, consequentemente, a eficiência da utilização dos carbohidratos e reduzindo, também a incidência de cetose.

Este invento diz respeito ao novo antibiótico acídico, designado por UK-69.753, produzido pela propagação aeróbica submersa, em meios nutritivos aquoso do microrganismo Amycolatopsis oriental is ATCC 53550, isolado de um protótipo de solo, da Inglaterra. Este antibiótico e os seus sais catiónicos são activos contra uma diversidade de bactérias GRam-positivas e Gram-negativas. Eles são eficientes no controlo da disenteria e da enterite, bem como são eficientes na promoção do desenvolvimento e no aumento da eficiência da utilização de alimentos nas aves domésticas, nos suínos e nos ruminantes. 0 microrganismo designado, nesta Memória Descritiva, como Amycolatopsís oriental is ATCC 53.550, sendo útil para a preparação do antibiótico UK-69.753, foi isolado de um prótotipo da solo, recolhido em Yorkshire, Reino Unido. As culturas biologicamente puras deste microrganismo formam uma parte deste invento, como o fazem as suas formas de mutantes e de recombinantes, que são capazes de produzir o antibiótico do invento.

Uma cultura de ATCC 53550, designada nesta Memória Descritiva por N731-15, foi cultivada de uma lâmina no caldo de ATCC No. 172, e foi desenvolvida, durante quatro dias, a 28°C, num batedor. Ela foi, em seguida, centrj_ fgada, durante 20 minutos, foi lavada, por três vezes, com água destilada esterilizada, e foi inoculada num meio habituaj. mente empregado para a identificação de elementos da Actino-mycetales. A cultura foi incubada a 28°C, e os resultados foram lidos em momentos diversos, mas foram feitos, mais habitualmente, aos catorze dias. As cores foram descritas na terminologia vulgar, mas as cores precisas foram determinadas por comparações com as lascas de cores do Manual de Harmonia de Cores, quarta edição. Os processos das análises de amino ácido e do açúcar de célula inteira são os descritos em Becker, B. et al., Appl. Microbiol, 12, 421 a 423, 1964, e in Lechevalier, M.P., J. Clin. Med, 71, 934 a 944, 1968.

Cerca de 30 gramas de micélio húmido, submetido a autoclave, foram empregados para as análises de micolatos, empregando-se o processo descrito por Lechevalier, M.P. et al., em J. Bacteriol, 105, 313 a 318, 1971.Para as análises de fosfolípi-dos, foi empregado o processo descrito por Minnikin, D.E. et al., J. Microbiol, Method 2, 233 a 241, 1984.

Os meios de identificação, empregados para a caracterização da cultura, e referências para a sua composição ou para o seu fornecedor são os que se seguem: -7-

1. Ag a r do Extracto de Malte do Extracto de Levedura de Cerveja - (Meio de ISP No. 2, Difco). 2. Agar de Farinha de Aveia - (Meio de ISP No. 3,Difco). 3. Agar de Fécula de Sais Inorgânicos - (Meio de ISP No.4, Difco). 4. Agar de Asparagina de Glicerol - (Meio de ISP No. 5, Difco). 5. Agar de Sacarose de Czapek - S. A. Waksman,"The Actinomycetes" Vol. 2 Meio No. 1, ágina 328,1961. 6. Agar de Asparagine de Glicose - Ibid, Meio No.2, pág. 328. 7. Agar de Emerson - Ibid. Meio No. 28, pãg. 331. 8. Agar Nutritivo - Ibid. Meio No. 14, pág. 330. 9. Agar de Bennett - Ibid. Meio No. 30, pãg. 331. 10. Agar de Tirosina de Gordon e de Smíth - R. E. Gordon e Μ. M. Smith, J. Bact.. 69, 147 a 150, 1955. 11. Agar de Malato de Cálcio; S. A. Waksman, "Bact. Rev." 21, 1 a 29, 1957. 12. Agar de Caseína - Ibid. 13. Agar de Gelatina - R. E. Gordon e J. M. Mihm, "J. Bact." 73, 15 a 27, 1957. 14. Agar de Fécula - Ibid. 8-

15. Agar de Cenoura de Batata - Μ. P. Lechevalier, "J. Lab and Clinicai Med" 71, 934 a 944, 1968, mas empregue unicamente 30 gramas de batatas, 2,5 gramas de cenouras e 20 gramas de agar. 16. Agar de água de Torneira a 2%.

As observações do desenvolvimento e da aparência do organismo eram as que se seguem:

Agar do Extracto de Malte do Extracto de Levedura de Cerveja - Bom crescimento, creme amarelo pálido (2ca, 2ea); em relevo, enrugado, sem o micêlio aéreo; o reverso amarelo pálido (2ea, 2ga); castanho amarelado pigmento solúvel (31c).

Agar de Farinha de Aveia - Crescimento pobre a moderado, creme (2ca), delgado, macio, sem o micélio aéreo; o reverso creme; (2ca); creme pigmento solúvel (2ca)-

Agar de Fécula de Sais Inorgânicos - Crescimento pobre, incolor a creme (2ca). delgado, macio, sem o micélio aéreo; o reverso é o mesmo que a superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Asparagina de Glicerol - Crescimento pobre a moderado, creme (2ca), levemente em relevo, macio a granular, sem o micélio aéreo; o reverso creme a amarelo pálido (2ca, 2ea); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Sacarose de Czapek - Crescimento pobre a moderado, creme (2ca), delgado, macio, sem o micêlio aéreo; o reverso incolor a creme (2ca); nenhum pigmento solúvel .

Agar de Asparagina de Glucose - Crescimento moderado, creme (2ca), levemente a moderadarente em relevo, rna cio a granular, sem o micêlio aéreo; o reverso creme a amarelo pálido (2ca, 2ea); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Emerson - Crescimento bom a excelente; creme, amarelo pálido a amarelo (2ca, 2ea, 2ga); em relevo, enrugado, sem o micêlio aéreo; o reverso amarelo escuro (2ic, 2nc); pigamento solúvel castanho amarelado (31c).

Agar Nutritivo - Crescimento moderado, amarelo pálido (2ca), levemente em relevo, macio, sem o micêlio aéreo; o reverso amarelo (2ia, 21a); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Bennett - Crescimento bom, creme (2ca), em relevo, macio a enrugado, sem o micêlio aéreo; o reverso amarelado (2ga, 2ia); pigmento solúvel amarelo pálido (2ea).

Agar de Tirosina de Gordon e de Smith - Crescimento moderado, amarelo escuro a castanho (21e, 4ng). levemente a moderadamente em relevo, macio mas enrugado próximo do fim da faixa, sem o micêlio âereo; o reverso castanho(3ne); pigmento solúvel castanho escuro (4pl).

Crescimento em relevo, ma-amarelo pálido moderado, creme cio a granular.

Agar de Malato de Cálcio -(2ca), delgado a moderadamente sem o micêlio aéreo; o reverso (2ea); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Caseína - Crescimento bom, amarelo pálido a castanho (2ea, 41g). moderadamente em relevo, enrugado, sem o micêlio aéreo; o reverso castanho (31 e); pigmento solúvel castanho escuro (4ni).

Agar de Gelatina - Crescimento bom, amarelado (2ga), moderadamente em relevo, macio mas enrugado próximo da orla, sem o micélio aéreo; o reverso amarelado (2ga); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Fécula - Crescimento bom, amarelado (2ga), moderadamente em relevo, macio mas enrugado próximo do fim da faixa, sem o micélio aéreo; o reverso amarelado (2ec, 2ic); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Cenoura Batata - Crescimento pobre a moderado, creme (2ca), delgado, macio, sem o micélio aéreo; o reverso creme (2ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Agua de Torneira - Crescimento pobre, incolor a creme (1.5 ca), delgado, macio, sem o micêlio aéreo; o reverso o mesmo que a superfície; nenhum pigmento soluvél.

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Propriedades Morfológicas. A cultura N731-15 foi incapaz de produzir um micélio aéreo ou esporos de qualquer dos meios empregados, mesmo apôs uma incubação de até quatro semanas.

No agar de fécula de sais inorgânicos, ela produziu cadeias curtas de estruturas semelhantes a esporos, ao longo de alguns segmentos de lufas de substrato, mas ela pode representar a condensação do citoplasma. No agar da água de torneira, ela desenvolveu a tumefacção terminal, nas extremidades das hifas do substrato, que se assemelhavam a esporos. As hifas vege-tativas. no agar de farinha de aveia, eram estreitas, ramificadas e mediam 0,4 a 0,9 um. em diâmetro.

Propriedades Bioquímicas.

Os resultados das propriedades bioquímicas e a produção dos ácidos, a partir dos hidratos de carbono, estão apresentados na Tabela 1 e na Tateia 2. -12-

Tabela 1.

Propriedades Bioquímicas da Cultura N731-15,

Decomposição de: Desenvolvimento em: Adenina + Caldo de lisozima - Malato de cálcio + NaC1 a 5% + Caseína + Transparência e coagulação de: Celulose - Leite desnatado + Hipoxantina + Utilização de: Tirosina + Acetato + Xantina + Benzoato - Hidrólise de: Citrato + Esculina - Dextrina - Hipurato - Lactato + Fécula + Malato + Produção de: Mucato - Sulfureto de hidrogénio + Oxalato - Melanina - Fenol - Produção de: Propionato + Gelatinase + Piruvato + Redutase de nitrato Fosfatase Urease + + + Succi nato +

Tabela 2.

Produção de Ácidos dos(e Utilização dos)Hidratos de Carbono da

Cultura N731-159.

Glucose + (+ ) G1 icerol + ( + ) Arabinose + ( + ) Lactose -(-) Frutose + ( + ) Maltose -( + ) Inositol -(-) Manose + ( + ) Manitol + ( + ) Melezitose -(-) Rafinose + ( + )b Mel ibiose Ramnose + ( + ) <-Meti1-D-glicosido -(-) Sacarose -( + ) Ribose + ( + ) Xilose + ( + ) Salicina -( + ) Adonitol + (+) Sorbitol + ( + ) Celobiose + ( + ) Sorbose -(-) Dulcitol -( + ) Fécula + ( + ) Eritritol + ( + ) Trehalose + ( + ) Galactose + ( + ) a Gordon, R. E. et a_l_., Int. J. Syst. Bacteriol, 24, 54-63, 1974. b A cultura não utilizou a rafinose, quando foi empregado o processo de Shirling e Gottlieb (Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340, 1966).

Relação com a temperatura A cultura não revelou desenvolvimento a 10°, a 37° ou a 45°C, mas revelou um bom desenvolvimento a 20°C, e um bom a um excelente desenvolvimento a 28°C,

Análise das paredes da célula.

Os hidrolisatos da célula inteira continham o ácido meso-dia-minopimélico, a galactose e a arabinose.

Análise do micolato. A parede da célula não continha micolatos.

Análise de fosfollpidos.

Os extractos da membrana da célula continham fosfatidiletano-lamina, fosfatidilglicerol e difosfatidilglicerol.

Em resumo, a cultura N731-15 é caracterizada pelo miéclio de substrato creme a amarelo pálido, pela carência de micêlio aéreo e pela carência de esporos. As experiências bioquímicas seguintes foram positivas: decomposição de adenina, de malato de cálcio, de caseína, de hipoxantina, de tirosina e de xantina; hidrólise de fécula; produção de sulfureto de hidrogénio; produção de gelatinase. de redutase de nitrato, de fosfatase e de urease; desenvolvimento em NaCl a 5%. transparência e coagulação do leite; utilização de acetato, de citrato, de lactato, de malato, de propionato. de piruvato e de succinato. As caracteristicas negativas eram: decomposição de celulose; hidrólise de esculi-na e de hipurato; produção de melanina; desenvolvimento em

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-15- caldo de lisozima; utilização de benzoato, de mucato, de oxa^ lato e de fenol. 0 ácido era produzido de glicose, de arabi-nose, de frutose, de manitol, de rafinose, de ramnose. de xilose, de adonitol, de celobiose, de eritritol, de galac-tose, de glicerol, de manose, de ribose, de sorbitol, de fécula e de trehalose; mas não de inositol, de sacarose, de dulcitol, de lactose, de maltose. de melezitose. de melibio-se, de aC-meti 1-D-glicosido, desalicina e de sorbose. A parede da célula, que continha o ácido meso-diaminopimêlico, a galactose e a arabinose, é do tipo IV, como é definido por Lechevalier e Lechevalier. A cultura não continha micolatos, mas continha fosfatidiletanolamina, em complemento de fosfa-tidilglicerol e de difosfatidilglicerol - um padrão de fosfo-lípido do tipo PII. Estas caracteristicas adaptam-se à descrição do género ' Amycolatopsis ' , recentemente proposto- por Lecheval ier et a_l_, em Int. J. Syst.Bacteriol., 3j>, 29-37, 1986,

Entre as espécies descritas nessa Revista A. orientalis - assemelha-se. intimamente, à cultura N731-15. na maior parte das experiências bioquímicas. Foram notadas diversas diferenças. A cultura N731-15 difere de A,orientalis, na decomposição da adenina, na carência de esculinase, na carência de produção de ácido de inositol. da lactose e do oUmetil-D-glicosido. Na base dos dados mencionados no precedente, a cultura N731-15 é considerada como uma nova estirpe de Amycolatopsis orientalis (Pittenger & Brigham) Lechevalier. Prauser, Labeda & Ruan. Tem sido depositada na American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville. Maryland 20852, USA, sob as cláusulas do Tratado de Budapest. de 9 de Outubro de 1986, sob o Número de acesso ATCC 53550, A cultura de Amycolatopsis orientalis ATCC 53550 e o isolamento do Antibiótico UK-69,753 podem ser conduzidos sob condições semelhantes ãs das empre-

gadas, geralmente, para a produção de antibióticos por fermen tação. A cultura realiza-se, de preferencia, em meio nutritivo aquoso, sob condições aeróbicas submersas, com agitação, a uma temperatura de 24° a 36°C. 0 meio nutritivo proveitoso, para a cultura, inclui uma fonte de carbono assimilável, tal como os açucares, as féculas e o glicerol; uma fonte de azoto orgânico, tal como a caseina,o digesto enzimâtico da caseína, a farinha de soja, a farinha de semente do algodão, a farinha de amendoim, o glúten do trigo, a farinha de soja, a farinha da carne e a farinha do peixe. Uma fonte das substâncias de cultivo, tal como os solúveis de grãos, a farinha de peixe, a farinha de semente de algodão, e o extracto da levedura de cerveja, bem como os sais minerais, tais como o cloreto de sódio e o carbonato de cálcio, e elementos de traço, tais como o ferro, o magnésio, o cobre, o zinco, o cobalto e o manganêsio, podem, também, ser utilizados, com resultados vantajosos. Se se descobrir espuma excessiva, durante a fermentação, agentes de antiespuma, tais como os polipropileno glicois ou os polipropileno silicones, podem ser adicionados ao meio da fermentação. A gaseificação do meio, em reservatórios para o cultivo submerso, é mantida, de preferencia, a um ritmo de cerca de 0,5 a 2 volumes de ar livre esterifiçado, por volume do caldo de fermentação, por minuto, forçado no caldo, por meio de um espargidor. A agitação pode ser mantida por meio de agitadores, em geral do conhecimento dos técnicos da técnica da fermentação. 0 ritmo da agitação depende do tipo do agitador empregado.Um balão de vibração ê, habitualmente, posto a trabalhar a 150 a 200 ciclos por minuto, ao passo que um fermentador é, habitualmente, posto a trabalhar a 100 a 1.700 revoluções, por minuto. As condições assépticas devem, como ê evidente, ser mantidas, durante a transmissão do organismo e durante todo o seu cultivo. -17-

0 inóculo, para a preparação do antibiótico, de acordo com este invento, pode ser obtido empregando-se o cultivo de uma lâmina da cultura ou de frascos de Roux, inoculados com a cultura. Um meio sólido, adequado para o cultivo inicial do organismo, em lâminas e em frascos de Roux, é o meio ATCC no. 172. 0 cultivo pode ser em pregado para inocular quer os balões de vibraçpo, quer os reservatórios de inóculo, ou os reservatórios de inóculo podem ser alimentados pelos balões de vibração. 0 cultivo, em balões de vibração, atingem, de um modo geral, o seu máximo em 4 a 5 dias, ao passo que o inóculo, em reservatórios de inóculo submersos, atinge, habitualmente, o seu período mais favorável em 3 a 6 dias. A cromatografia de camada fina, empregando o gel de silica, é uma ferramenta proveitosa, para detectar o antibiótico produzido no meio da fermentação, e para analisar a composição dos materiais em bruto e purificados extraídos dos caldos da fermentação. Os cromatogra-mas são desenvolvidos com o clorofórmio e álcool, na proporção de 90-10, e o composto antibiótico é visualizado com a luz ultravioleta, a 254 nm. 0 antibiótico UK-69.753, produzido pela fermentação de Amycolatopsis orientalis ATCC 53550, pode ser recuperado, extraindo-se todo o caldo da fermentação não filtrado, com um solvente orgânico, tal como o clorofórmio, o acetato de etilo, metilisobutil, a cetona ou o butanol, a um pH predominante naturalmente. Alternativamente, o micêlio pode ser separado, depois de o seu desenvolvimento se ter completado e de o filtrado ter sido extraído com um solvente orgânico. 0 extracto do solvente pode, em seguida, ser concentrado a um xarope fino, e os antibióticos puros, obtidos pela cromatografia, ou, alternativamente, um solvente, tal como o hexano, podem ser adicionados ao extracto do solvente, para precipitar um sólido enriquecido com o antibiótico. Este sólido pode, em seguida, ser submetido a um tratamento pela cromatografia e/ou pela distribuição con- -18-

tracorrente, para isolar o antibiótico puro. 0 processo preferido de separação e de recuperação do composto antibiótico do invento ê o que se segue:- 0 filtrado de uma fermentação de Amycolatopsis oriental is ATCC 53550 ê extraído com o acetato de etilo. 0 extracto do solvente dá origem a um xarope escuro, por evaporação no vácuo. A adição de hexano precipita um sólido escuro, que contém o antibiótico, como revela a cromatografia de camada fina. Um enriquecimento suplementar do antibiótico é efectuado pela distribuição contracor-rente e/ou pela cromatografia de coluna. 0 produto pode ser purificado posteriormente (e separado um do outro), pela cro-matografia de coluna ou pela cromatograf ia liquida de execução elevada, se for desejado. 0 composto antibiótico do invento é acídico e forma sais catiónicos, por reacção com os agentes básicos. Todos estes sais estão no campo de acção do invento. Estes sais podem ser preparados pelos processos convencionais, para os antibióticos desta classe.

Num processo, uma solução do antibiótico, num solvente orgânico, imiscível em água e volátil, é lavada com uma solução aquosa, contendo, pelo menos, um equivalente estequiomêtrico, e, de preferencia, um excesso avultado, de um agente básico adequado. Depois de seca, a solução do solvente orgânico é evaporada no vácuo, dando origem ao sal catiónico desejado. Os agentes básicos típicos, que podem ser empregados, com este fim, incluem os hidróxidos de metais alcalinos, tais como o hidróxido de sódio e o hidróxido de potássio, os hidróxidos de metais alcalino terrosos, tais como o hidróxido de cálcio e o hidróxido de bário, e o hidróxido de amónio. 19-

Os dados espectrais e analíticos, para UK-69.753, indicam que o composto tem a estrutura seguinte:

(D 0 antibiótico UK-69.753 exibe uma acção inibitória, contra o desenvolvimento de uma diversidade de microrganismos.Na Tabela 1, que se segue, estão resumidos os resultados das experiências "in vitro". Paraesta experiência, cada organismo é inoculado numa série de tubos de experiências, contendo o meio nutritivo e variando as concentrações do Antibiótico UK-69.753, para determinar a concentração mínima do composto, em mcg./ml., que inibe o desenvolvimento do organismo, por um período superior a 24 horas (MIC).

TABELA 1. ACTIVIDADE ANTIBACTERIANA.

Organismo Estirpe MIC, mg./ml.Antibiótico UK-69.753 Staphylococcus aureus 01A106 > 100 01A539 > 100 01A540 > 100 Actinomyces pyogenes 14D011 6,25 Pasteurella multocida 5 9AO 0 6 6,25 Clostridium perfringens 10A009 < 0,2 Bacteroides fragilis 78C024 >100 Fusobacterium necrophorum 84C004 12,5 Treponema hyodysenteriae 94A007 < 0,2 Moraxella bovis 93A001 6,25

Contra as bactérias gram-negativas, tais como Escherischia coli, os valores de MIC eram superiores a 50.

Dos dados "in vitro" precedentes, verifica-se que UK-69.753 ê especialmente proveitoso no controlo das infecções de T. hydodysenteriae, nos suínos.

Com a finalidade de se controlar a disenteria dos suínos, o antibiótico UK-69.753 pode ser administrado isoladamente aos suínos, ou, de preferencia, numa -21

composição farmacêutica, em que o antibiótico ê misturado com um veiculo ou com um diluente, farmaceuticamente aceitáveis. A citada composição farmacêutica ê preparada de acordo com os processos normalizados, para um antibiótico veterinário. 0 composto da fórmula (I) pode ser administrado, por exemplo, por via oral, na forma de elixires, de xaropes, de soluções e de suspensões, por exemplo, numa dose de 1 a 50 mg, por kg do peso do corpo do animal, por dia. As soluções e as suspensões podem ser aquosas, não aquosas ou parcialmente aquosas. Para a administração paren-teral, slo preferidas as soluções aquosas esterilizadas. A administração parenteral inclui o emprego intramuscular, in-traperitonal, subcutâneo e intravenoso. Para o emprego intravenoso, a concentração total dos solutos deve ser controlada para tornar isotónica a preparação. A relação proporcional do antibiótico para o veiculo farmaceuticamente aceitável depende da dosagem contemplada e da via da administração; não obstante, a citada relação proporcional situa-se, normalmente, no escalão de 1:10 até 2:1, especialmente de 1:5 até 1:1.

Também, quando se utilizar o antibiótico do invento, para se controlar a disenteria dos suínos, é o mais conveniente administrar-se o composto, misturando-o na ração do animal. Neste caso, o antibiótico deve ser adicionado, à ração do animal, num grau que lhe proporcione a dosagem diária adequada do antibiótico, por exemplo num grau de 1 a 100 partes por milhão. 0 médico veterinário decidirá, em última análise, a dosagem do antibiótico, que deve ser administrada, para combater a disenteria do suíno, e esta -22-

dosagem variará de acordo com a via da administração e com a gravidade dos sintomas do animal. 0 valor das rações do animal tem, de um modo geral, sido determinado, directamente, alimentando o animal. A Memória Descritiva da Patente Inglesa No. 1.197.826 pormenoriza a técnica do rúmen "in vitro", de acordo com a qual as alterações, que se desenvolvem nas rações produzidas pelos microrganismos, são medidas, mais rapidamente e com uma grande precisão, na avaliação das rações do animal. Esta técnica envolve o emprego de um aparelho, no qual os processos digestivos dos animais são conduzidos e estudados "in vitro". As rações do animal, o inóculo do rúmen e os promotores diversos do desenvolvimento são introduzidos na, e retirados da, unidade do laboratório, sob condições controladas cuidadosamente, e as alterações, que se desenvolvem, são estudadas criteriosamente e progressivamente, durante a destruição da ração pelos microrganismos. Um aumento no conteúdo do ácido propiónico do fluido do rúmen indica que uma reacção desejável na acção total do ruminante tem sido produzida pelo promotor do desenvolvimento, na composição da ração. A alteração no conteúdo do ácido propiónico é expressa como uma percentagem do conteúdo do ácido propiónico, verificada no fluido do rúmen do controlo. Estudos, muito demorados, na alimentação "in vivo", têm sido feitos, para se demonstrar uma correlação digna de confiança, entre o aumento do ácido propiónico, no fluido do rúmen, e a acção aperfeiçoada do animal. 0 fluido do rúmen ê recolhido de uma vaca fistulada, que é alimentada por uma ração comercial de engorda, com o feno. 0 fluido do rúmen é filtrado, imediatamente, através de um tecido de queijo, e adicionam-se 10 ml dele a um balão cónico de 50 ml, contendo 400 mg de um substrato padronizado (68% de fécula de milho, com 17¾ de celulose e com 15¾ de farinha de soja extraída), 10 ml de um tampão de pH 6,8 e o composto da experiência. Os balões são gaseificados com o nitrogénio livre de oxigénio, durante cerca de dois minutos, e são incubados, num banho de água em agitação, a 39°C, durante cerca de 16 horas. Todas as experiências são conduzidas em triplicado.

Depois da incubação, 5 ml do protótipo são misturados com 1 ml de ácido metafosfórico a 25%. Depois de 10 minutos, adiciona-se 0,25 ml de ácido fórmico, e a mistura é centrifugada a 1.500 rotações por minuto, durante 10 minutos. Os protótipos são, em seguida, analisados pela cromatografia gás-liquido, pelo processo de D. w. Kellog, J. Dairy Science, 5_2, 1690.1969. As alturas de pico, para os ácidos acético, propiónico e butirico, são determinadas para os protótipos, a partir dos balões de incubação tratados e não tratados.

Quando experimentados por este processo "in vitro",o Antibiótico UK-69.753, no grau de 1,3 microgramas por mililitro, deu origem a um aumento de cerca de 33%, na produção do ácido propiónico, sobre o produzido na solução de controlo sem se adicionar o Antibiótico UK-69.753. Por comparação, o composto de salinomicina, adquirível no mercado, (um antibiótico de poliéter), a 10 mcg/ml, deu origem a um aumento de cerca de 61%, do ácido propiónico sobre o controlo.

Estes dados revelam que o Antibiótico UK-69.753 aperfeiçoa a utilização da alimentação pelos ruminantes, tais como o gado vacum e as ovelhas. 0 composto tem, também, um efeito semelhante nos animais monogãstricos, tais como os porcos e os coelhos. 0 Antibiótico UK-69.753 pode ser incorporado nas composições da alimentação, como o são o ácido livre, o sal de sódio, o sal de potássio ou as suas misturas. As formas brutas do Antibiótico UK-69.753, ou o caldo seco da fermentação , contendo o antibiótico,podem, também, ser incorporadas, nas composições da alimentação, às concentrações de potência desejadas. cem o invento. Os exemplos, que se seguem, esclare- EXEMPLO 1 1. Preparação do Inóculo. posição seguinte, Um meio aquoso esterilizado, tendo a com-foi preparado. Ingrediente Gramas por litro Glucose 1 Fécula 24

Peptona"Oxoid"(Marca de Fábrica) 5 Levedura "Oxoid"(Marca de Fábrica) 5 Extracto de carne"Lab Lemco"(Marca de Fábrica) 3 Carbonato de Cálcio,adicionado apôs o ajustamento do meio a pH 7 Agua 4 Cinquenta ml do meio foi distribui- do por balões de agitação de 300 ml e esterilizados a 120°C e a 15 p.s.i., durante 30 minutos. Depois de arrefecido, o meio foi inoculado com uma suspensão de células vegetativas, de uma cultura de lâminas de Amycolatopsis oriental is ATCC 53550. -25-

Os balões foram agitados a 28°C, num agitador rotativo, tendo uma deslocação de 1,5 a 2,5 polegadas e 150 a 200 ciclos, por minuto, durante dois dias. 2. Preparação do Inôculo da Segunda Fase.

Um balão de agitação, contendo a cultura de desenvolvimento, foi empregado para se inocular um balão de fermentação de 2,8 litros (um "Fernbach"), contendo um litro do meio esterilizado da composição, como foi definido no precedente. 0 "Fernbach" foi agitado a 28°C, num agitador rotativo, tendo uma deslocação de 1,5 a 2,5 polegadas e 150 a 200 ciclos por minuto, durante dois dias. 3. Produção de UK-69.753.

Dois "Fernbachs", contendo a cultura desenvolvida, foram empregados para se inocular um recipiente de fermentação de 130 litros, contendo 70 litros do meio aquoso esterilizados, da composição seguinte: -26-

Ingrediente Gramas por litro Monohidrato de glicose "Cerelose" (Marca de Fábrica) 10 Fécula de milho 10 Farinha de soja "Trusoy"(Marca de Fábrica) 10 l Solúveis de Destiladores 5 Cloreto de sódio 5 Carbonato de cálcio 1 Cloreto de cobalto 0,002 Agua PH 7,2 A fermentação foi levada a efeito a 28°C, com agitação a 450 rotações por minuto e gaseificação a um volume de ar, por volume de caldo por minuto, até que a actividade de vulto fosse observada (baseada na análise de cro matografia liquida de elevada realização), habitualmente depois de 4 a 9 dias. 0 antibiótico foi detectado, empregando--se as condições da cromatografia liquida de elevada realização, como se segue:

Coluna :Waters Cjg/u"Bondapak" (Marca de Fábrica) 15 cm x 4,0 mm

Eluente : 0 ,1M KHgPO^ÍpH 3,5):acetonitri lo, 65:35

Fluxo : 1,5 ml/min

Ultravioleta : 350 nm

Temperatura : 40°C 0 tempo da retenção de UK-69.753, sob estas condições, ê tipicamente de 11 minutos. 0 componente do antibiótico, no caldo e nos fluxos de recuperação, pode, também, ser detectado, empregando-se placas de gel de silica, reveladas com clorofórmio e metanol, na proporção de 90 para 10, e visualizada pela luz ultravioleta, a 254 nm.

No fim desse tempo, o caldo inteiro foi extraído com o acetato de etilo, e o solvente foi separado e concentrado, dando origem a um resíduo oleoso. A adição de hexano (500 ml) precipitou um sólido, que foi separado por filtração (100 mg). A cromatografia liquida de elevada realização, empregando-se um sistema de "Prep 500" (Marca de Fábrica) de Waters, com uma parcela inversa de C^g "Prep-Pak" e uma parcela móvel de fosfato de dihidrogênio de potássio a 0,1 M e acetonitri lo, na proporção de 65 para 35, deu origem a fracções, ricas em UK-69.753. 0 solvente orgânico foi re- -28-

tirado por em acetato poração do amarelo (5 evaporação no vácuo, e o antibiótico foi extraído de etilo. A separação do estrato orgânico e a eva_ solvente deram origem a UK-69.753, como um sólido mg). i EXEMPLO 2

Um fermentador de 2.000 litros, contendo 1.200 litros do meio esterilizado da composição seguinte, foi inoculado com 70 litros de um inóculo de "Amycolatopsis orientalis", ATCC 53550, preparado como foi descrito no Exemplo 1.

Ingrediente

Gramas por litro

Monohidrato de glicose"Cerelose" (Marca de Fábrica) 10 Fécula de milho 10

Farinha de soja "Trusoy"(Marca de Fábrica) 10

Solúveis de destiladores 5

Cloreto de sódio 5

Carbonato de cálcio 1

Cloreto de cobalto 0,002

Agua pH 7,2 29-

Ο fermentador foi mantido a 28°C,com gaseaficação e com agitação a 180 rotações por minuto. Depois de 168 horas, o caldo inteiro foi filtrado, e o filtrado foi extraído com 850 litros de acetato de etilo. Os extractos de solvato foram separados e concentrados no vácuo para 1 litro de um resíduo oleoso, estimado a conter cerca de 20 gramas de UK-69.753, pelo processo da cromatografia liquida de elevada realização, descrito no precedente. Pela adição de 4 litros de hexano, um sólido precipitou-se e foi recolhido por filtração (128 gramas).

Cinquenta e seis gramas do citado sólido de 128 gramas foi submetido a uma distribuição contra-corrente de seis tubos, empregando-se etanol e água, na proporção de 3 para 1 (volume total de 2 litros), como camadas inferiores, e tolueno (2 litros) como camada superiores.0 antibiótico concentrou-se nas primeiras três camadas inferiores. Estas foram reunidas e o etanol foi retirado sob uma pressão reduzida. A restante parcela aquosa foi extraida, por três vezes, com 1,5 litros de cloreto de metileno. Estes extractos foram reunidos, foram secos sobre o sulfato de sódio e foram evaporados, dando origem a 12,2 gramas de um semi-sóli do. Este material foi recolhido em 300 ml de acetato de etilo e foi derramado, lentamente, em 700 ml de hexano agitado rapidamente. Depois de 30 minutos de agitação, o precipitado resultante foi filtrado e seco novácuo, dando origem a 9,05 gramas de um sólido amarelo bronzeado. 2,0 gramas deste sólido foram submetidos à cromatografia de gel de silica, eluindo-se com clorofórmio e metanol, na proporção de 12 para 1. DEpois da análise das parcelas, pela cromatografia de camada fina, as parcelas puras foram reunidas,dando origem a 0,8 grama de UK-69.753, como um sólido amarelo amorfo.

Quando todos os 128 gramas do sólido bruto foram processados desta maneira, o rendimento total foi 3,.9 gramas de UK-69.753, com o ponto de fusão de 153 a 1550q. -30-

Anàlise, em percentagem, de C5qH86N2°18:

Verificada: Exigida C 62,88; H 8,19; N 2,26; C 63,39; H 7,83; N 2,55.

Na solução de metanol, UK-69.753 tem uma absorção proeminente de ultravioleta, máxima a 233 e 253 nm. A adição de algumas gotas de uma solução de hidróxido de sódio a 0,1 N desloca estes máximos para 226 e 348 nm, e a adição de algumas gotas de HC1 a 0,1 N eleva a absorção para os máximos a 212, 233 e 361 nm. 0 espectro de infravermelho (KBr) em cm _1 ê: 3416, 2967, 2926, 1648, 1585, 1453, 1414, 1380, 1259,1083,1025.

Claims (2)

1. R Ε I V I N D I C A Ç 0 E S 1 -. - Processo para a produção de um antibiótico da fórmula

   em que R ê

   caracterizado por compreender a cultura do microrganismo Amycolatopsis oriental is ATCC 53.550, ou de uma sua forma mutante ou recombinante, tendo a capacidade de produzir o -32- I · f *

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   referido antibiótico, num meio de cultura aquoso, contendo uma fonte assimilável de carbono, de azoto e de sais inorgânicos, sob condições de fermentação aeróbica submersa, até que se obtenha uma quantidade recuperável do referido antibiótico.
2. 23. - Processo para a preparação de uma composição de ração para aves domáticas, suínos ou ruminantes, caracterizado por se incluir na referida ração um antibiótico obtido de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal, numa quantidade eficiente para promover o desenvolvimento e/ou para aperfeiçoar a eficiência na utilização da ração das referidas aves domésticas, dos referidos suínos, ou dos referidos ruminantes. Lisboa, 7 de Janeiro de 1988

   j. PEREIRA DA CRUZ Agení; Cíiclii da Proprisdeíte Indasírisl RUA Vlw/pwVi Cvííuuii, 10- A, li* 1200 usam