PT93258B

PT93258B - Processo para a preparacao de um antibiotico de eter policiclico acidico

Info

Publication number: PT93258B
Application number: PT93258A
Authority: PT
Inventors: Hiroshi Maeda; Junsuke Tone; Walter Patrick Cullen; James Robert Hauske; Gloria Jean Kostek
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1989-02-27
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1996-07-31
Also published as: US4920050A; IE72195B1; CA2010768C; DE69026742D1; CA2010768A1; GR3020425T3; EP0385594B1; DE69026742T2; ATE137502T1; PT93258A; DK0385594T3; EP0385594A3; EP0385594A2; IE900673L; ES2086370T3; JPH0717649B2; JPH02306977A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 93 258

REQUERENTE: PFIZER INCnorte-americana,industrial,com sede em 235 East 42nd Street,New York.N.Y. Estados Unidos da América do Norte.

EPÍGRAFE: ’’ PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM ANTIBIÓTICO DE ÉTER POLIClCLICO AClDICO ”

INVENTORES: Walter Patrick Cullen, James Robert Hauske, Glória Jean Kostek e Hiroshi e Junsuke Tone.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte em 27 de Fevereiro de 1989 sob o n^e. 315.953.

iNPi MOO 113 RF 16732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de um antibiótico de éter policíclico acídico, com a estrutura estabelecida pela cristalografia de raios X, é produzida para fermentação de um microorganismo novo, o Streptomyces sp. ATCC 53862. Este antibiótico novo é útil como um anticoccídico em aves de capoeira, na prevenção ou no tratamento, da disenteria suína, e como um promotor do crescimento no gado bovino e suíno.

PFIZER INC.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM ANTIBIÓTICO DE ÉTER POLIClCLICO ACÍDICO

-Ι-

Ο referido composto apresenta a fórmula:

em que Me e CH^ e farmaceuticamente

Pr e CH₃CH₂CH₂, aceitável.

ou um seu sal catiónico

invento em consideração diz respeito a um novo antibiótico de éter policíclico acidico com a fórmula:

(I) em que Me é CH^ e Pr é CH^CF^CF^ , tendo es tereoquimica absoluta, como se encontra exposto; aos seus sais catiónicos, farmacêuticamente aceitáveis; às composições de rações nutritivas, compreendendo o referido antibiótico, para as aves domésticas, para o gado vacum ou para o gado suíno; ao seu emprego como um agente anticoccídico nas aves domésticas no tratamento, ou na prevenção, da disenteria do gado suíno , ou como um promotor no desenvdvimento do gado vacum ou do gado suíno; a um processo de fermentação, para a sua preparação; e ao microrganismo Streptomyces sp., que produz o referido antibiótico, no referido processo de fermentação.

composto (I), que é um homólogo de monensina, é um elemento novo do grupo de éter policíclico acidico de antibióticos. Esta familia inclui, em complemento da monensina (O Index merck, 10â Edição, Merck & Co. , Inc., Rahway, N.J. 1983, monografia NQ 6.100), agentes bem conhecidos tais como a nigericina (tema citado, monogafia NQ 6.271) a lasalocida (tema citado, monografia NQ 5.204), e a salinomicina (tema citado, monografia NQ

8.193). O tema tem sido examinado de novo por Westley Antibióticos de Poliéter, Aplicação em Progresso da Microbiologia, Volume 22, páginas 177 a 223 (1977). Estes compostos são conhecidos, de um modo geral, como coccidiostatos, como promotores do desenvolvimento suplementar e/ou como agentes proveitosos contra a disenteria no gado suíno.

Uma cultura de Streptomyces sp., ATCC 53.862, quando fermentada, sob condições aeróbicas num meio aquoso, produz um novo antibiótico de éter policíclico acídico, um composto com a fórmula (I), como foi especificado no precedente.

O invento em consideração tem em vista o citado composto da fórmula (I), incluindo os seus sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis , e um processo para a sua preparação, que compreende a fermentação do citado Streptomyces sp. ATCC 53.862, num meio nutritivo aquoso, compreendendo uma fonte assimilável de carbono e de azoto, até se formar uma quantidade recuperável do citado composto da fórmula (I), de preferência sob condições aeróbicas submersas. Para o emprego, como um agente anticocidial, na prevenção, ou no tratamento, da disenteria do gado suíno, e/ou como um promotor do desenvoLvimento, o composto (I) não é isolado, necessariamente, da fermentação, nem é isolado na sua forma essencialmente pura, mas é empregado, alternativamente, na forma de produto bruto quer na forma de precipitado misturado com o micélio (recuperado por filtração do meio da fermentação), ou como sólidos obtidos por secagem por pulverização ou por secagem por congelação, do meio total da fermentação.

Os citados sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis incluem os, mas não estão restringidos aos de sódio, potássio, cálcio, amónio, à N,N'-diben-5-

ziletilenodiamina, a N-metilglucamina (meglumina) e à dietanolamina. Os sais catiónicos preferidos são os de potássio e os de sódio.

invento em consideração tem, também, em vista as composições de rações nutritivas, sendo uma para o gado vacum ou para o gado suíno, que compreende o composto da fórmula (I), numa quantidade eficiente para promover o desenvolvimento e/ou para aperfeiçoar a utilização da ração do citado gado vacum ou do gado suíno, ou para impedir, ou tratar, a disenteria no gado suíno; e sendo a outra para as aves domésticas, que compreende o composto da fórmula (I) numa quantidade eficiente para controlar a infecção cocidial, nas citadas aves domésticas.

invento em consideração tem, ainda, em vista um processo para promover o desenvolvimento e/ou para aumentar a eficiência da utilização da ração no gado suíno ou no gado vacum, processo esse que compreende a administração, ao citado gado suíno ou ao citado gado vacum, de uma quantidade para a promoção da eficiência da promoção do desenvolvimento ou da utilização da ração do composto da fórmula (I), particularmente na modalidade de uma composição de rações nutritivas; ou um processo para impedir ou para tartar, a disenteria no gado suíno, que compreende a administração ao citado gado suíno de um compos to da fórmula (I), numa quantidade eficiente na prevenção ou no tratamento da citada disenteria, no gado suíno; e um processo, para o controlo das infecções cocidiais , nas aves domésticas, o qual compreende a administração às citadas aves domésticas, de uma quantidade eficiente do composto da fórmula (I), particularmente na modalidade de uma composição de rações nutritivas.

Finalmente , o invento em consi-6-

deração tem em vista uma cultura biologicamente pura de Streptomyces sp. ATCC 53.862 estando a citada cultura apta a produzir o composto da fórmula (I), numa quantidade recuperável mediante a fermentação num meio aquoso nutritivo que compreende as fontes assimiláveis de carbono e de azoto apresentando-se a citada cultura numa modalidade seca por congelação.

A cultura, capaz de produzir o antibiótico de éter policíclico da fórmula (I), é designada por Streptomyces sp., e tem estado depositada sob o Tratado de Budapeste, na The American Type Culture Collection , em Rockville, Maryland, como a cultura tipica sob o seu número ATCC 53.862. Esta cultura é, irrevogavelmente e sem restrições ou condições, cedida ao público, mediante a publicação de uma patente. A permanência do depósito desta cultura, na The Americal Type Cultura Collection em Rockeville, Maryland, e a acessibilidade imediata, para esse efeito, pelo público, são proporcionadas, durante todo o tempo da existência eficiente da patente, sempre que a patente esteja outorgada. 0 acesso à cultura é válido, durante a duração do pedido, sob 37 CFR 1,14 e 35 USC 122. Todas as restrições da validade ao público da cultura depositada são irrevogavelmente removidas, mediante a outorga da patente.

Esta nova cultura foi obtida de uma amostra do solo recohida em Arnprior, Ontário, Canadá, e foi identificada na colecção dai cultura de Pfizer Inc., como N765-21. A sua descrição e a sua classificação foram estabelecidas por Dr. L. H. Huang. Verificou-se que esta cultura tem os hifas estreitos dos Actinomycetalos , um micélio aéreo, que produz as cadeias de esporos e um micélio de substractos não fragmentados. Os resultados das análises de toda a célula indicaram, além disso, que ela

-Ί-

pertence ao género Streptomyces.

Uma cultura em plano inclinado do microorganismo foi plantada no caldo de ATCC 172 e foi desenvolvida durante quatro dias a 282C, num batedor. Ela foi, em seguida, centrifugada, durante 20 minutos, foi lava da, por três vezes, com água destilada e esterilizada, e foi plantada num meio empregado, habitualmente, para a identificação dos elementos dos Actinomycetalos.

As culturas foram incubadas a 282C, e os resultados foram lidos em tempos diversos, mas, habitualmente, aos quinze dias. As cores estão descritas na terminologia vulgar, mas as cores exactas estão determinadas por comparação com as rodelas finas de cor do The Color Harmony Manual quarta edição. Os processos das análises do aminoácido e de açúcar, de toda a célula, são os descritos em Becker et al., Appl. Microbiol, Volume 12, páginas 421 a 423 (1964) e Lechevalier, J. Lab. Clin. Med. Volume 71, páginas 934 a 944, (1968) respectivamente.

Os Streptomyces flocculus ATCC 25.453, foram empregados com a finalidade de comparação.

A cultura foi identificada como se segue:

Agar do Extracto de Malte do Extracto de Fermento:

(ISP / Ψ 2 médio, Difco) - Bom desenvolvimento, amarelo para castanho amarelado ( 2 nc, 3 ic) com alguns micélios aéreos brancos; moderadamente elevado, enrugado; o reverso amarelado (2 nc); pigmento solúvel castanho amarelado ( 3 lc).

Agar de Farinha de Aveia:

(ISP / / 3 médio, Difco) - Desenvolvimento moderado a bom, creme (2 ca), com alguns micélios aéreos brancos; ligeiramente elevado, o reverso creme para amzrelo pálido (2 ca, 2 ea) ; pigmento solúvel creme ( 2 ca).

Agar de Amido de Sais Inorgânicos:

(ISP ψ ψ 4 médio, Difco) - Desenvolvimento bom, branco para amarelo (2 ga, 2 ic); delgado a elevado, macio para ligeiramente enrugado, com micélios aéreos brancos; o reverso amarelo (2 ga, 2 ic); pigmento solúvel creme (2 ca).

Agar de Asparagina de Glicerol:

(ISP / / 5 médio, Difco ) - Desenvolvimento fraco a moderado creme (2 ca), delgado, macio, ou aparecendo como colónias isoladas; micélio aéreo esparso; branco; o reverso creme (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Sacarose de Czapek:

(Waksman, Os Actinomicetos, v.2 médio / / p. 328, 1961) - Desenvolvimento moderado, creme a amarelo pálido (2 ca, 2 ea); delgado a ligeiramente elevado, macio, com micélio aéreo branco; o reverso idêntico à superficie; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Asparagina de Glucose:

(no mesmo livro, médio / / 2) - Desenvolvimento moderado a bom, creme a amarelo (2 ca, 2 ga); elevado ligeiramente a moderado, macio a enrugado; micélio aéreo a esparso; branco, o reverso amarelo pálido (2 ea); pigmento solúvel creme (2 ca).

Agar de Tirosina de Gordon e de Smith:

(Gordon e Smith, Revista de Bacteriologia, 69: 147-150, 1955) - Desenvolvimento moderado, creme (2 ca), delgado a ligeiramente elevado, macio, nenhum micélio aéreo; o reverso amarelo pálido (2 ea) ; pigmento solúvel amarelo (2 ga).

Agar de Caseína:

(Gordon e Smith no mesmo livro) - Desenvolvimento moderado a bom, creme (2 ca), moderadamente elevado, macio a ligeiramente enrugado. Nenhum micélio aéreo; o reverso amarelo pálido (2 ea); com pigmento solúvel amarelo (2 ga) .

Agar de Bennett:

(Waksman, assunto citado, médio / / 30 , p. 331)- Desenvolvimento bom, amarelo a amarelo escuro (2 ic, 2 gc); elevado ligeiramente a moderado, macio a enrugado; micélio aéreo esparso, branco; o reverso amarelo (2 ga, 2 ic); pigmento solúvel amarelo (2 ic).

Agar de Emerson:

(no mesmo livro, médio £ ± 28, p. 331) - Desenvolvimento bom, creme, castanho amarelado a castanho (2 ca, 3 ic, 3 ie) : moderadamente elevado, enrugado, nenhum micélio aéreo o reverso amarelo (2 ga, 2 ic): pigmento solúvel castanho amarelado (3 ic).

Agar Nutritivo:

(no mesmo livro, médio ± ± 14 p. 330) - Desenvolvimento moderado, creme (2 ca), delgado, macio, nenhum micélio aéreo; o reverso creme a amarelo pálido (2 ca, 2 ea); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Gelatina:

(Gordon e Mihm, Revista de Bacteriologia, 73, 15-27, 1957) -Desenvolvimento bom, creme (2 ca), moderadamente elevado macio mas enrugado junto do bordo, nenhum micélio aéreo; o reverso creme (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Amido:

(no mesmo livro) - Desenvolvimento bom, creme a amarelo pálido (2 ca, 2 ea), moderadamente elevado, enrugado, nenhum micélio aéreo; o reverso amarelo pálido (2 ea) ; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Cenoura Batata :

(Lechevalier, Laboratório de Clinica Médica, 71, 934-944, 1968, mas emprega unicamente 30 gramas de batatas, 2,5 gramas de cenoura e 20 gramas de agar) - Desenvolvimento moderado, creme (2 ca) com algum micélio aéreo branco; delgado , macio para ligeiramente granular; o reverso incolor para creme (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar da Torneira de Água:(2%)

Desenvolvimento fraco a moderado, creme (2 ca), delgado a submerso, macio, micélio aéreo nenhum para esparso, branco; o reverso incolor para creme (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Propriedades Morfologicas:

As observações morfológicas foram feitas no ISP Médio 9 (médio de utilização de carbohidratos ) com sacarose, depois de 14 dias de incubação; massa de esporos em séries de cor brancas; em cadeias de esporos na Secção de Rectiflexiveis ou na Secção de Espirais , curvos , em forma de gancho, com buracos ou em bobinas abertas de até três voltas , ou arranjadas como uma massa irregular na extremidade; 10 a 30 esporos, por cadeia de esporos; esporóforos ramificados monopodialmente; esporos elípticos ou cilíndricos, 1,2-2,0 (-2,2) x 0,8-1,0 (-1,1) microns; macio, como foi revelado pela microscopia electrónica perscrutadora.

Propriedades Bioquímicas:

A melanina não foi produzida; o sulfureto de hidrogénio foi produzido; a gelatina foi liquifeita; o amido foi hidrolisado; o nitrato foi reduzido a nitrito em nitrato de dextrose, mas não em nitrato orgânico; desenvolvimento fraco e nenhuma decomposição no caldc de celulose de Jensen; nenhum desenvolvimento e nahuma decomposição no caldo de celulose de Levine e de Schoienlein coagulação e clareação no leite; a assimilação na caseína foi positiva; a assimilação na tirosina foi negativa. Utilização de carbohidratos; a glucose, a arabinose, a frutose o manitol, a ramnose, a sacarose, a xilose, o inositol e a refinose, foram todos utilizados.

Relação com a temperatura 21SC

28°C

37°C

45°C

Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento Nenhum excelente excelente bom desenvol vimento

Análise de toda a célula: Os hidrolisatos de toda a célula continham o ácido LL-diaminopimélico, a glucose e a manose.

A cultura de N765-21 foi caracterizada pela cor branca de esporos em massa, pela reacção negativa da melanina, e pelos esporos macios, que são curvos, em forma de gancho, com buracos ou numa bobina aberta de até três voltas. O micélio do substracto foi creme, amarelo pálido a amarelo. Excepto para alguns tons de creme, de amarelo ou de castanho amarelado, não se produziram quaisquer pigmentos distintos solúveis. A cultura utilizou a glucose, a arabinose, a frutose , o inositol, o manitol , a rafinose, a ramnose, a sacarose e a xilose. Os hidrolisatos de toda a célula indicaram a presença do ácido LL-diaminopimélico e a ausência de açucares de diagnósticos.

Comparada com as espécies descritas previamente de Streptomyces a cultura de N765-21 está relacionada com S. pseudogriseclus com S. sclerotialus e com S. flocculus. Ela difere da S. pseudogriseclus na sua utilização de sacarose ede rafinose. Ela

é diferente de S. sclerotialus, na sua incapacidade de produzir a esclerocia e nas suas cadeias de esporos abertas, de preferência a compactas.

Quando a cultura N765-21 e a cul tura S. flocculus ATCC 25453 foram comparadas, lado a lado, ambas pareciam, uma com a outra, morfologicamente, culturalmente e bioquimicamente. Não obstante, a cultura N 765-21 difere da S. flocculus, na hidrólise positiva de amido, na incapacidade de reduzir o nitrato orgânico, no desenvolvimento fraco e não no desenvolvimento bom no caldo de celulose de Jensem, na incapacidade de peptonizar o leite, na incapacidade de se desenvolver a 45QC e na utilização positiva, e não duvidosa de ramnose.

Na maior parte dos meios utilizados, a cultura N765-21 não produziu quaisquer micélios ou produziu apenas fracos micélios aéreos , enquanto o S. flocculus produziu abundantes micélios aéreos. O micélio dos substractos de cultura N765-21 era amarelo no agar de Emerson, e amarelo pálido no agar de caseina e no agar de tirosina; mas o micélio dos substractos de S. flocculus era castanho escuro no agar de Emerson, castanho amarelado no agar de caseina, e castanho no agar de tirosina. Os pigmentos solúveis, produzidos por S. flocculus eram mais escuros em alguns meios , por exemplo castanho escuro no agar de Emerson e no agar de tirosina, e castanho amarelado no agar de caseina.

Na base dos dados apresentados no precedente, a cultura N765-21 é considerada como um elemento do género Streptomyces e é designada como Streptomyces sp. Ela tem sido depositada na American Type Culture

Collection, sob o número de aquisição de ATCC 53.862.

O composto antibiótico (I) do invento em consideração é produzido facilmente pelo Streptomyces sp. em consideração, desenvolvendo-se a cerca de 242C até cerca de 36SC, sob condições submersas, com a agitação e a aeração nos meios constituídos por fontes de carbohidratos, tais como os açucares , os amidos, e o glicerol; as substâncias orgânicas de azoto, tais como a farinha de soja, os ácidos de casamino e o extracto de levedura e substâncias para o desenvolvimento , tais como os cereais solúveis, a farinha de peixe, a farinha de semente de algodão; os sais minerais, que contêm elementos em vestígio de ferro, de cobalto, de cobre, de zinco, etc., e carbonatos de cálcio ou fosfatos de cálcio, como agentes de tampão. Depois de se ter completado o desenvolvimento o antibiótico é recuperado, facilmente, extraindo-se todo o caldo, com um solvente crgânico, tal como o n-butanol, a cetona metilisobutil ou o clorofórmio , a pH da ordem de 4,0 até 8,0; filtrando o micélio, que contém o antibiótico precipitado, sendo o filtrado posto de parte; ou, simplesmente, secando por pulverização, ou secando por congelação todo o caldo. Alternativamente, o micélio, ou todo o caldo seco é extraído com um dos solventes orgânicos citados. O composto antibiótico purificado, se tal for desejado, é isolado do extracto orgânico, por processos de concentração, pela formação do sal ou do ácido livre, pela cromatografia, pela precipitação e/ou pela cristalização, como a seguir se exemplifica.

Pela maneira habitual de se proceder à fermentação, um inoculo é preparado, primeiramente , raspando as células vegetativas , desenvolvendo-as em emios adequados, em frascos inclinados ou de Roux, que tenham sido inoculados com Streptomyces sp ATCC 53.862.

As células vegetativas resultantes são, por sua vez, empregadas para inocular balões vibratórios ou reservatórios de inóculo, contendo, também, meios de desenvolvimento adequados. Alternativamente, os reservatórios de inóculo são inoculados pelos balões vibratórios. A seguir a um periodo de desenvolvimento adequado (geralmente de 120 a 144 horas, em balões vibratórios e de 168 a 196 horas em reservatórios de inóculo) um fermentador também contendo meios adequados de desenvolvimento é inoculado sob condições asséticas, com o caldo vegetativo, pelos balões vibratórios ou pelos reservatórios de inóculo. Após o acabamento do desenvolvimento (de um modo geral , cerca de 120 a 196 horas), o composto antibiótico é recuperado, na sua forma de produto bruto, ou na sua forma de puro, como for desejado, por um, ou outro, dos processos geralmente descritos no precedente, ou por processos específicos que se exemplificam a seguir.

O composto da fórmula (I) é experimentado, pela sua actividade antibacteriana in vitro pelos processos normalizados, nos quais as concentrações inibitefias mínimas (MIC), em mcg/ml, contra um, ou mais, microorganismos, são medidas. Um tal procedimento é o recomendado pelo International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericcson e Sherris,

Acta, Pathologica et Microbiologica Scandinav, Suplemento 217, Secção B, páginas 64 a 68 1971), e emprega um agar de infusão do coração do cérebro (BHI) e um dispositivo de réplica de inóculos. Tubos de crescimento de um dia para o outro são diluídos em 100 vezes, para emprego como o inóculo padrão (20 .000 a 100.000 células, em cerca de 0,002 ml são colocados na superfície do agar; 20 ml de BHI por taça de agar. Doze diluições, feitas por duas vezes, do composto em experiênciasão empregadas, com uma concentração inicial do medicamento em experiência de 200 mcg/ml. Coió-17-

nias individuais são menosprezadas , quando se procede à leitura das lâminas, depois de 18 horas, a 37QC. A susceptibilidade (MIC) do organismo em experiência é aceite como a concentração minima do composto, capaz de produzir uma inibição total do desenvolvimento, tal como a estimada pelo olho nu. Tal como os outros antibióticos de éter policíclicos o composto em consideração da fórmula (I), revela tipicamente, uma actividade positiva antibacteriana, bem como uma actividade contra Treponema hyodysenteriae (o agente causador da disenteria do gado suíno) como revela a Tabela (I).

Tabela I

Actividade Antibacteriana In Vitro do Composto da Fórmula I

Organismo

Clostridium perfringens

Actinomyces pyogenes

Treponema hyodysenteriae

Estirpe No

A00 9

14D002

94A00 7

MIC, mcg/ml menos do que 0,39 menos do que 0,39 menos do que 0,39

Os dados da eficácia do composto da fórmula (I) e dos seus sais , contra as infecções coccidiais, em aves de capoeira, são obtidos pelo processo, que se segue. Grupos de pintainhos de galispo, de leghorn brancos, livres de patogénio, com 3 a 5 dias de vida, são alimentados com um regime alimentar de farinha de malte, contendo o composto (I), ou o seu sal de sódio e/cu de potássio, disperso nele. Depois de ter sido alimentado com esta ração, durante 24 horas, cada pintainho é inoculado per os sendo experimentados com ocistos da espécie especifica de Eimaia. Outros grupos de pintainhos, com 3 a 5 dias de ràde, são alimentados com um regime alimentar de farinha de malte semelhante, sem o composto (I), ou os seus sais.

Eles são também infectados, depois de 24 horas, e servem ccmo controlos infectados. Ainda um outro grupo de pintainhos de 3 a 5 dias de idade, são alimentados com o mesmo regime

-19alimentar de farinha de malte, sem o antibiótico, e não são infectados com coccídeos. Estes servem de controlos normais.

Os resultados do tratamento são avaliados, depois de cinco dias , no caso de EL acervulina e de seis dias em todas as outras categorias.

Os critérios, empregados para se medir a actividade anticoccidial, consistem na pontuação das lesões de 0 a 4 para E. tenella , segundo J.E. Lynch A New Method of the Primary Evolluation of Anticoccidial Activity , Am. J. Vet. Res. , 22 , 324-326, 1961; e de 0 a 3 para as outras espécies baseada na modificação do sistema de pontuação inventado por J. Johnson e W.H. reid, Anticoccidial Drugs, Lesion Scoring Techniques in Batery and Floor Pen Experiments in Chicks, Exp. Parasit. 28, 30-36 1970. A actividade é medida dividindo-se a pontuação das lesões, de cada grupo tratado, pela pontuação das lesões do controlo infectado. Nesta experiência, o composto (I) e os seus sais catiónicos exibem uma excelente actividade contra as infecções de Eimeria tenella, E. acervulina,

E. brunetti e E. necatrix nas aves domésticas, quando incorporadas no regime alimentar de farinha de malte de aves de capoeira, nos graus de cerca de 20 a 100 partes por milhão. Por exemplo, contra a E. tenella sensível , o composto da fórmula (I) revelava o controlo a 100% das lesões, às doses tão infimas como 50 partes por milhão.

O composto em consideração da fórmula (I) é, também, proveitoso, de um modoapral, em combinação com determinados outros agentes anticoccidiais , conhecidos tais como a nicarbazina, a 4,4'-dinitrocarbanilida ou a naftalenamina, como foi estabelecido por Hamill et al na Patente NS 4.582.822 dos Estados Unidos da América, citada no precedente.

Para a prevenção, ou para o controlo, da coccidióse, nas aves domésticas, o composto deste invento é administrado, por via oral, às aves domésticas, num veiculo adequado. Convenientemente, a medicação é levada a efeito, simplesmente, na água de báer , ou na ração das aves domésticas , de tal modo que uma dosagem terapêutica do agente seja ingerida com a água diária, ou com a ração das aves domésticas. O agente pode ser medido, directamente, na água de beber, de preferência na forma de um ccncentrado liquido, ou pode ser adicionado, directamente, à ração como tal, ou na forma de uma pré-mistura ou de um concentrado. Uma prémistura, ou um concentrado, do agente terapêutico, num veiculo, é utilizada, vulgarmente, para a inclusão do agente, na ração. O agente terapêutico pode apresentar-se na sua forma essencialmente pura (por exemplo o ácido livre, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável), na sua forma de produto bruto analisado, tal como o micélio húmido, ou seco, ou como todo o caldo seco. Veículos adequa dos são líquidos ou sólidos, como forem desejados, tal como a água ou diversas farinhas; por exemplo, a farinha de óleo de soja, a farinha de óleo de linhaça, a farinha de carolo de milho; e as misturas minerais, tal como as são vulgarmente empregadas, nas rações das aves domésticas.

Um veiculo, particularmente eficiente, é a ração das aves domésticas, ela própria; isto é, uma parcela pequena da ração das aves domésticas. O veiculo facilita a distribuição uniforme dos materiais activos, na ração concluída, com a qual a prémistura se mistura. Isto é importante, porque asim somente proporções pequenas dos agentes enérgicos em consideração se tornam necessários. É importante que o composto seja misturado, meticulosamente, na prémistura e, sub sequentemente, na ração.

Sob este ponto de vista, o agente pode ser disperso, ou dissolvido, num veiculo oleoso

adequado, tal como o óleo de soja, o óleo de milho, o óleo de semente de algodão, e outros idênticos, ou num solvente orgânico volátil, e, em seguida, misturado com o veiculo. Deve ter-se em conta que as proporções do material activo, no concentrado, são susceptíveis de uma ampla variação, uma vez que a quantidade do agente, na ração concluída, pode ser ajustada, misturando-se a proporção adequada da pre-1 -mistura com a ração, para se obter um grau desejado do agente terapêutico.

Os concentrados de energia elevada são misturados, pelo produtor das rações, com um veiculo de proteinas, tal como a farinha de óleo de soja e outras farinhas, como foi descrito no precedente, para se produzirem os suplementos dos concentrados, que sejam adequados para a alimentação directa das aves domésticas.

Em tais circunstâncias, permite-se que as aves domésticas consumam a ração habitual. Alternativamente, os tais suplementos de concentrados são adicionados , directamente, às rações das aves domésticas, para se produzir uma ração perfeita, equilibrada nutritivamente, e contendo um grau eficiente terapêuticamente de um, ou de mais, dos compostos deste invento. As misturas são misturadas, meticulosamente pelos processos normais tais como num misturador de dupla pá para se assegurar a homogeneidade.

Para o emprego nas aves domésticas, os graus de emprego do composto descrito nesta Memória Descritiva, variam sob diversas circunstâncias. Uma medicação contínua, de grau reduzido, durante o periodo de desenvolvimento, isto é, durante as primeiras 5 a 12 semanas, para as aves de capoeira, é uma medida profilática eficiente. No tratamento de infecções estabilizadas poderão tornar-se necessários graus mais enérgicos , para se vencer a infecção. O grau de emprego normal do composto (I), na

ração é, de um modo geral, da ordem de cerca de 20 a 100 partes por milhão e, de preferência, da ordem de cerca de 30 a 60 partes por milhão. Quando administrado na água de beber, o grau é tal como o que proporcionará a mesma dose diária de medicação consignada pela proporção em peso, do consumo diário médio da ração, para o consumo diário médio da água.

A actividade do composto da fór mula (I) e dos seus sais, na promoção do desenvolvimento e/ou no aumento da eficiência da utilização da alimentação, no gado suíno, ou no gado vacum, pode ser medida, directamente, alimentando grupos de experiências de animais, com diversos graus do composto (I), ou de um seu sal, na ração. Alternativamente, a Memória Descritiva da Patente Britânica N8 1.197.826, pormenoriza um processo de rúmen in vitro para a avaliação dos antibióticos nas rações.

Para o emprego, na prevenção, ou para o tratamento, da disenteria dc gado suíno, ou na promoção do desenvolvimento e/ou no aumento da eficiência da utilização da ração, no gado vacum, ou no gado suíno, o composto da fórmula (I), ou um seu sal, é administrado, de preferência, como um aditivo da ração. As rações são preparadas de acordo com os processos totalmente análogos aos dos pormenorizados no precedente, para a preparação da ração das aves domésticas , com o mesmo propósito da produção das rações em que o agente terapêutico se encontra disperso uniformemerte. O grau de emprego normal do composto (I) na ração do gado vacum, ou na ração do gado suíno, situa-se, de um modo geral, entre cerca de 20 e 100 partes por milhão. Nos ruminantes, o composto da fórmula (I) pode, também, ser administrado, por via oral, na modalidade de uma pílula grande, que é retida na bolsa rumenoreticular, desprendendo o agente terapêutico, a um ritmo constante substan

cialmente, durante um periodo prolongado de tempo, por exem pio 4 a 8 semanas, proporcionando uma dose equivalente à da dose diária, citada no precedente, da ração, isto é: a dose diária média, em miligramas é 20 a 100 partes por milhão do consumo médio da ração diária, em quilogramas.

Um exemplo, de uma tal pílula grande de despreendimento controlado, é do Cardinal Paten te N2 4.601.893, dos Estados Unidos da América do Norte.

invento em consideração é tornado claro pelos exemplos,que se seguem. Não obstante, deve ter-se em consideração que o invento não se encontra limitado pelos pormenores específicos destes exemplos.

EXEMPLO 1

Fermentação da Streptomyces sp. ATCC 53.862. Isolamento do Composto (I) como o Sal de Sódio

A Streptomyces sp. foi inicialmente desenvolvida, pela inoculação de meios sólidos em planos inclinados ou frascos de Roux , com a cultura de ATCC 53.862, empregando-se o meio ATCC NQ 172, preparado e tendo a composição como se segue.

Gramas , por litro

Glucose 10

Amido solúvel 20

Extracto de levedura 5

Hidrolisato enzimático de caseína 5

Carbonato de cálcio 1

Água destilada pará 1.000; pH até 7,0 com KOH; adicione agar 20

No entretanto, os balões vibra tórios foram preparados, empregando-se um, ou outro, dos meios que se seguem:

C '	Gramas	por litro	JDYTT Gramas	, por
			litro
Cerelose		10	Cerelose	10
Farinha de	soja	10	Amido de milho	5
Milho		5	Licor de infusão de milho	5
Sólidos	de fermentação
Amido de milho	10	Hidrolisato enzimático de caseina	5
Cloreto de	sódio	5	Cloreto de cobalto	0 ,00
Cloreto de	cobalto	0 ,002	Carbonato de cálcio	3
Carbonato	de cálcio	1

Cem mililitros do meio foram distribuídos por balões vibratórios de 300 mililitros e foram esterilizados a 1209C e a 15 p.s.i. durante 30 minutos. Depois de se ter arrefecido, o meio foi inoculado com uma suspensão de células vegetativas, raspada da cultura em plano inclinado de Streptomyces sp. precedente. Os balões foram agitados a 28°C, num vibrador, que tinha uma deslocação de 1,5 a 2,5 polegadas, e 150 a 200 ciclos por minuto (CPM), durante cinco a sete dias.

No entretanto, recipientes de fermentação de 5 litros foram preparados, contendo 3 litros de um dos meios de C' ou de JDYTT, ou dos meios que se seguem:

UK1-2

Gramas, por litro

Cerelose 45

Farinha de soja 10

Licor de infusão de milho 10

Cloreto de cobalto 0,002

Sulfato de magnésio 0,10

Carbonato de cálcio 3

Sulfato de manganês 0,10

Sulfato férrico 0,10

Um agente antiespumante (glicol de polipropileno) P2000 , contendo óxido de etileno a 10% em peso, 1 ml) foi adicionado, e os recipientes foram vedados e foram esterilizados a 1202C e a 15 p.s.i., durante 45 minutos. Os recipientes arrefecidos foram, em seguida, inoculados com um balão vibratório a cerca de 3%), e foram fermentados, durante 120 a 168 horas, a 30°C, agitando-se a 1.700 revoluções por minuto, com um ritmo de ar de um volume de ar por volume do liquido por minuto.

Quando a fermentação se tinha completado (baseado numa análise do disco do antibiótico, em face de B. subtilis ATCC 6633), os fermentadores foram parados e foram filtrados, ao pH natural, com o auxilio

de uma terra diatomácea. 0 bolo do filtro foi misturado com metanol, foi concentrado no vácuo, foi diluido com 2 a 3 volumes de água e, em seguida, foi extraido, por duas vezes com V3 a V2 volume de cetona de metilisobutilo, ou de n-butanol. O estracto do solvente foi separado da parcela aquosa, por aspiração ou por centrifugação, foi filtrado e foi concentrado no vácuo, dando origem ao antibiótico da fórmula (I), na sua modalidade de produto bruto, como um óleo viscoso.

A bioactividade do caldo e os fluxos de recuperação subsequentes foram acompanhados, empregando-se uma estirpe de Bacillus subtilis ATCC 6633 ou de Staphylococcus aureus ATCC 6538. Os componentes no caldo e os fluxos de recuperação podem ser visualizados , empregando-se lâminas de GF de gel de silica de Analtech, servindo-se do acetato de etilo, como eluente.

As lâminas desenvolvidas foram pulverizadas com o reagente de vanilina (3 gramas de vanili na em 75 ml de etanol e 25 ml de ácido fosfórico a 85%) e foram aquecidas a 802C. O produto do antibiótico da fórmula (I) apresenta-se com uma mancha castanha-alaranjada. A lâmina desenvolvida da cromatografia de camada fina pode, também ser revestida, com agar, implantando com S. aureus ou com B. subtilis ao qual se tenha adicionado o monohidrato de cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio, e é incubada a 37°C, durante 16 horas, para tornar visível o antibió tico (manchas brancas sobre um fundo cor-de-rosa) .

Numa segunda fermentação, sessenta fermentadores de jarros, contendo cerca de 180 litros do caldo fermentado foram recuperados , por extracção com V2 volume de cetona de metilisobutilo, e foram separados por extracção e por concentração do solvente, dando origem

a 31,6 gramas. O sólido foi cromatografado sobre gel de silica, eluido, gradientemente, com o clorofórmio, seguido por 0,5% por 1% e, finalmente por 2% de CH^OH, em CHCl^.

A actividade foi acompanhada pela cromatografia de camada fina, empregando-se as lâminas de gel de silica, desenvolvidas com o acetato de etilo, e visualizando as fatias activas com o reagente de vanilina, a 80QC. O ionóforo apresentou-se como umas cadeias castanho alaranjadas. A concentração das fatias activas deu origem a 6,9 gramas de um óleo, que foi cristalizado em éter dietílico quente, dando origem a 2,62 gramas do composto cristalino (I). Uma nova produção dos licores mães deu origem a um suplemento de 0,55 grama do mesmo produto.

EXEMPLO 2

Fermentação , aumentada proporcionalmente aumento proporcional, em recipientes grandes de fermentação, foi levado a efeito, preparando-se balões de vibração, contendo 0,7 litro do meio de C' ou do meio de JDYTT. O inóculo do balão de vibração foi fermentado durante 5 a 7 dias, a 28°C, e foi empregado para inocular um recipiente de fermentação, de 6.000 litros, contendo 4.000 litros do meio de JDYTT. Cerca de um litro de inóculo foi empregado no reservatório. O produto da fermentação, depois de ela ter decorrido durante 7 a 10 dias, foi colhido.

Todo o caldo foi extraido, com 1.600 litros de cetona de metilisobutilo, a pH natural, e os extractos foram separados num separador de DeLaval. O extracto orgânico foi concentrado no vácuo, primeiramente no autoclave de vácuo, e, em seguida, num alambique centrífugo e num vaporizador rotativo, dando origem a 8 litros de um óleo. O óleo foi cromatografado sobre o gel de silica regularizado na coluna, misturado com o hexano. A coluna foi revelada com o acetato de etilo. As fatias, que continham o produto, identificadas pela cromatogarfia de camada fina, empregando-se o processo descrito por no precedente , foram reunidas e foram cortadas em tiras, e o residuo foi recolhido em acetato de etilo , foi tratado com o carbono activado , e foi filtrado. O filtrado foi agitado com H^PO^ diluído e, em seguida, com um tampão de fosfato de sódio dibásico, para formar o sal de sódio, foi seco sobre Na2SO^ e foi concentrado, e 24,4 gramas do composto da fórmula (I) foi cristalizado, como o sal de sódio, pela adição de heptano; a mobilidade relativa, na cromatografia de camada fina, era

-30tlc Rf 0,4 (10:1 CHC1₃: CH₃OH), 0,35 (acetato de etilo).

A ressonância magnética nuclear de C-13 (o desvio quimico, em partes por milhão, em CDC1₃, com o número de hidrogénios entre parênteses), era:

(0) , (D . (1). (1). (2) , (D , (3) , 10,5

181,2* (0), 110,0 8 5,8* (l)r 8 5,3 ' ⁸⁵ ·²

76,4* (D / 24,4 (D , ⁷⁰,⁶

57,9 (3) , 56,9 (3), 45,0* 37,4 (1) , 36,5* (D , 35,6 33,5* (2), 33,2* (2), 31, 8*

27,2 (2), 17,0 (2), 16,8* 14,5* (3), 11,0* (3), e

106,9 (0) , 98,3* (0) , 83,0* (D, 82,6 (1), 68,3* (D , 64,9* (2) , 40,6 (2), 39, 2* (2), 34,8* (D, 34,4 (1),

30,0 (2), 27,4* (3), 16,0* (3) , 14,7 (3) , * (3) .

A monensina revela idênticos desvios químicos, e, em complemento, picos a 107,0 (0), 85,2 (0 ), 84,9 (1), 82,5 (1),

74,5 (1), 70,4 (1), 57,8 (3), 37,5 (1), 35,7 (2), 34,3 (1),

29,8 (2) , 27,3 (2) e 8,1 (3).

A estrutura do composto da fórmula (I) foi comprovada pela análise cristalográfica por raies X .

Claims

R Ε I V INDICAÇÕES:

15. - ção de um composto, com a fórmula Processo para a prepara OB Mt JL Mt Mt Mt MtO II — | .oe Mt k* COjH ^M* Mt H Fr B B ΧΗ,ΟΗ CF-lt.SIS (I) em que Me é CH^ e Pr é CH₃CH₂CH₂, ou um seu sal catiónico

farmaceuticamente aceitável, caracterizado por compreender a fermentação de Streptomyces sp. ATCC 53862, sob condições aeróbicas submersas, num meio aquoso nutritivo, compreendendo uma fonte assimilável de carbono e de azoto, até se formar uma quantidade recuperável do referido composto.

25. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser separado do meio da fermentação.

35. - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o composto ser recuperado na forma do seu sal de sódio.

-324^, - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido composto, na sua forma precipitada, ser recuperado como uma mistura compreendendo micélio, por filtração do meio de fermentação .

55. - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido composto ser recuperado, na forma de produto bruto, por secagem por pulverização ou por secagem por congelação, do meio de fermentação completo.