DK149822B

DK149822B - Fremgangsmaade til fremstilling af phosphonsyrederivater

Info

Publication number: DK149822B
Application number: DK266681AA
Authority: DK
Inventors: Yoshio Kuroda; Masakuni Okuhara; Eiko Iguchi; Hatsuo Aoki; Hiroshi Imanaka
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date: 1976-07-27
Filing date: 1981-06-17
Publication date: 1986-10-06
Also published as: BE857211A; AU514895B2; CA1103179A; DK266681A; PH13967A; DK149822C; SE453400B; AU2734177A; SE8300288L; NO152451C; SE8300288D0; NO821484L; ZA774528B; ES479212A1; NO152451B; US4143135A

Description

149822

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil ukendte forbindelser 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propyl-phosphonsyre eller 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-trans-l-propenylphos-phonsyre eller begge dele, hvilke forbindelser har antimikrobiel virkning mod forskellige patogene mikroorganismer. Med de omhandlede forbindelser kan der fremstilles farmaceutiske præparater indeholdende disse forbindelser, hvilke præparater kan anvendes til terapeutisk behandling af infektionssygdomme hos mennesker og dyr.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at Strepto-myces lavendulae ATCC 31279 eller en mutant heraf med væsentligt 2 1Λ9822 samme egenskaber som denne dyrkes i et vandigt næringsmedium under aerobe betingelser, hvorpå 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propylphos-phonsyre og/eller 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-trans-1-propenylphos-phonsyre isoleres fra kulturen.

Dyrkningen (fermenteringen) udføres i et næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder af carbon og nitrogen, fortrinsvis under aerobe betingelser (f.eks. rystekultur eller submers kultur), hvis detaljer fremgår af det nedenstående.

Foretrukne kilder af carbon i næringsmediet er carbonhydrater såsom glucose, fructose, glycerol og stivelse. Andre anvendelige kilder er lactose, arabinose, xylose, dextrin og melasse.

Foretrukne nitrogenkilder er gærekstrakt, pepton, glutenmel, bomuldsfrømel, sojabønnemel, majsstøbevand, tørret gær eller hvedekim, samt uorganiske og organiske nitrogenforbindelser såsom ammoniumsalte (f.eks. ammoniumnitrat, ammoniumsulfat eller ammoniumphosphat), urinstof eller aminosyre.

Selv om carbon- og nitrogenkilderne fordelagtigt anvendes i kombination, behøver de ikke at anvendes i deres rene form, da mindre rene materialer, som indeholder spor af vækstfaktorer og betydelige mængder mineralnæringsstoffer, også er egnet til brug. Om ønsket kan der sættes mineralsalte til mediet, f.eks. calciumcarbonat, natrium- eller kaliumphosphat, natrium- eller kaliumchlorid, magnesiumsalt eller kobbersalt. Om nødvendigt kan der, især når kulturmediet skummer betydeligt, tilsættes et antiskummiddel, f.eks. flydende paraffin, fede olier, vegetabilske olier, mineralske olier og siliconer.

Ligesom i tilfælde af de foretrukne metoder, som anvendes ved produktion af andre antibiotika i store mængder, foretrækkes submerse aerobe dyrkningsbetingelser til fremstilling af de ovenfor anførte forbindelser i store mængder. Til produktion af små mængder anvendes en rystekultur eller en overfladekultur i en kolbe eller flaske.

Når dyrkningen foretages i store tanke, foretrækkes det at anvende den vegetative form af organismen til podning i produktionstankene for at undgå vækstforsinkelse. Det er derfor ønskeligt først at 3 149822 fremstille et vegetativt inokulum af organismen ved podning af en relativt lille mængde kulturmedium med sporer eller mycelium af organismen og dyrke dem og overføre det dyrkede vegetative inokulum aseptisk til store tanke.

Det medium, i hvilket det vegetative inokulum er fremstillet, kan i det væsentlige være det samme som eller være forskelligt fra det medium, som anvendes ved fremstillingen af forbindelserne.

Agitation og beluftning af kulturblandingen kan udføres på mange forskellige måder. Agitation kan tilvejebringes ved hjælp af en propeller eller ved lignende mekanisk agitationsudstyr, ved rotation eller rystning af fermenteringsbeholderen, ved hjælp af forskelligt pumpeudstyr eller ved gennemledning af steril luft gennem mediet. Beluftnin-gen kan udføres ved at lede steril luft gennem fermenteringsblandingen.

Fermenteringen udføres sædvanligvis ved en temperatur mellem ca. 20 og 40°C, fortrinsvis ved 30°C, i et tidsrum mellem 50 og 100 timer.

Forbindelserne kan isoleres fra kulturmediet på sædvanlig måde, som almindeligvis anvendes til isolering af andre kendte antibiotika.

I almindelighed findes størsteparten af den/de fremstillede forbindelse (r) i kulturvæsken, hvorfor forbindelsen/forbindelserne kan udskilles fra det ved filtrering eller centrifugering af dyrkningsvæsken vundne filtrat på sædvanlig måde, f.eks. ved inddampning under reduceret tryk, lyofilisering, opløsningsmiddelekstraktion, pH-justering, behandling med en harpiks (f.eks. anion- eller ka-, tionbytterharpiks eller ikke-ionisk adsorptionsharpiks), behandling med en adsorbent (f.eks. aktivkul, siliciumdioxid, silicagel, cellulose eller aluminiumoxid), krystallisation eller omkrystallisation.

Nedenfor kaldes 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propylphosphonsyre FR-31705, og 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)trans-1-propenylphosphon-syre kaldes FR-900136.

149822 4 1) Mikroorganismen:

Den mikroorganisme, der kan anvendes til fremstilling af de hidtil ukendte antibiotika FR-31705 og/eller FR-900136, er en stamme af Streptomyces lavendulae, der for nylig er isoleret fra en jordprøve indsamlet ved Fukue city, Nagasaki prefecture, Japan.

En kultur af den levende organisme er blevet deponeret i The American Type Culture Collection under ATCC nr. 31279 og i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, under nr. 3808.

Til fremstillingen af FR-31705 og FR-900136 kan som nævnt også anvendes en mutant af Streptomyces lavendulae ATCC 31279 med væsentligt samme egenskaber som denne. Der kan anvendes både en kunstig mutant og en naturlig mutant. En sådan kunstig mutant kan fremstilles ud fra den beskrevne mikroorganisme på sædvanlig måde, f.eks. ved røntgenbestråling, ved ultraviolet bestråling eller med N-methyl-N'--nitro-N-nitrosoguanidin, 2-aminopurin og nitrogen-sennepsolier.

1) Mikrobiologiske egenskaber;

Streptomyces lavendulae ATCC 31279 har følgende morfologiske, dyrkningsmæssige og fysiologiske egenskaber: 1. Morfologiske egenskaber:

Kulturens morfologi undersøges mikroskopisk med det mycelium, som er dyrket på glycerol-asparagin-agar, gær-maltekstrakt-agar, havre-mel-agar og uorganiske salte-stivelse-agar.

1) Forgreningstype af sporedannende hyfer:

Monopodial forgrening.

2) Form af sporedannende hyfer:

Retinaculiaperti: åbent øje, krog og lejlighedsvis rectus og spiral.

3) Antal sporer: 10 - 50 sporer.

4) Overfladeudseende og sporestørrelse:

Glat, 0,5 - 1,2 x 1,4 - 2,0 mikron.

. 149822

D

5) Forekomst af zoo-spore:

Ikke observeret.

6) Forekomst af sporangium:

Ikke observeret.

7) Dannelse af sporer: I aerielt mycelium.

8) Fragmentering af substratmycelium:

Ikke observeret.

2. Dyrkningsmæssige egenskaber:

Stammen har de nedenfor anførte dyrkningsmæssige egenskaber, når den dyrkes på medier som anført nedenfor ved 30°C i 10 - 14 dage: 6 149822 +>

C

0

S

Oi Ή a +1 2 3 4 5

+> U

+) SO

bi S to

•H S I

Η Λ bi Ο) -Η Μ +1 +> +> +)+>+> +1 +1 +1 Η

-0100)0) ØØbiSØSØC

η .μ -μ -μ -μ+j (β ο-μ s -μ ø a s s c ss>acycy Ο -Η Ή Ή Ή -Η tO tO Η ,Ρ -ri Λ bi tu s μ so +1 I 0 <U -HØ to 0 -Η Η -μ S A3

+3 »(O Ό ora S S MS

g g oø "S- «Λ S *-0 O »ø .¾ - >i

> to g H=ø g Μ +>H -H g - ft) +> M

M <h E M ØOSOM s>0 > IM ‘ 3,¾ S 0 > - h ms -s m s -s ms μ μ -s nt) s ms +) 0.0 1-10 Ot - 0 1-10 OtØ øø Λ 0 HØ ,0 0 ø OlØ

0 HH SH H +1 H s ·Η i—1 -H Η Ό CnO SH blH IH H -H

+1 ØS blS ØØS blø ØS 00 HØ blS Η «Η 0 ØS

0 >0 00 > > O øo >0 Ό Ai H ,13 00 HS Ό >0

bl S Η MH s S Η Μ H SH O-S HS Μ H r-10 Ot MH

0 øo >i O øøo >ι 0 øo H>( S >i >i O S > H 00 > is Μ Η Μ Ή IH A3 H M tH ,14 Ή S O'H H A3 bi 0 »H H A3 +1

bi I

•H S

- +10 +) +> bi > Oi

Sø*· - H - - H

go-μ-μ +> s +>+*+> 3 X ø on) +) oø +i a oø +i oø +i bi H > s O' M bl SOiSOiø

H - bi-H bi*H - blH . blH S

0+J v 1+1 1+1+1 1+)1+)0 o o -μ +i bi +> tn øj +i tu +> bi >

>i"H S biø biø-H OiØDiøH

g >+>0 H+) H +1 > ·Η +) H +1 S

+3 bl M HØ Γ-10 +3 H 0 H 0 a +1 ·Η Ό > Ό > Ό > Ό > Η -+) - Ot Ot -+) Ol Ot - ø +)b>+> s - s - +> en +> s - s - -μ +)+> Η Ό 0 Øj 0 +) 0 +) Ό H 0 0+)0+)¾ 0 0 S s -μ H MS MSS+I+J MS MS H +1+)

0 >10 > >1 O >0 >ibi C >1 O >1 O > SS

rij +> > ,S H ,14 H ,¾ +10 Η Η A3 Η A! A3 HH

2 s ø ·

S M ø S

3

ø ø bi S H S

bi bi ø ø +)ø* øøiø 0» ø 0> 4 I I S A3 0 Hø +1 S Η Μ ' I Øl

ø H bl Η -μ bl C

5 bl ø S A3 1 s +1 ø μ ø ø Sø H S ø bl S S O -n

Sø a μ μ +10+1 I

i aø o ø μ m bi an μ

ø M ø S S bi ø Ai 0 ØS IB

Møi i ø ø bi ø i a-μ o>

0 I H Øb>l 0 +1 H |H I

s 0 O Møs MH 0 ØS S

ØMS Η I H b> 0 g Μ A! 0 +3 O 0 0 0 M s g 0 0 A3 A3 +> o o o >+io h i s o η h a go s >1 HH s u μ > s+Jffiø sø Η H +)0>t ft) ft) 0 HMSa πω o u wmeh a o æ ui <o -- —

0^^-.^ OH

SHcnm ra<tnvot--cooiHH

7 149822 3. Fysiologiske egenskaber: 1) Temperaturområde for vækst (på Bennett's agar): 12 - 40°C, optimum: 26°C.

2) Gelatinesmeltning (på glucose-pepton-gelatine-stikkultur):

Negativ.

3) Stivelseshydrolyse (på stivelse-uorganiske salte-agar):

Positiv.

4) Koagulering og peptonisering af skummetmælk:

Koagulering: negativ.

Peptonisering: langsomt peptoniseret.

5) Produktion af melanoidt pigment: a) Positiv på pepton-gær-jern-agar.

b) Negativ på tyrosin-agar.

6) Mønster for carbonkildeudnyttelse (på Pridham-Gottlieb-agar);

Carbonkilde_ Vækst L-Arabinose

Cellulose D-Fructose - D-Glucose + D-Galactose +

Inositol D-Mannose - D-Mannitol L-Rhamnose

Raffinose -

Saccharose

Salicin + D-Xylose

Symboler: + = god udnyttelse - = tvivlsom udnyttelse - = ingen udnyttelse.

149822 8

De ovenfor angivne mikrobiologiske egenskaber viser, at stammen ATCC 31279 hører til slægten Streptomyces. Som et resultat af undersøgelser af den stamme, som har egenskaber som anført ovenfor, i litteraturen "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. udgave (1975), "The Actinomycetes", Vol. II (1961) skrevet af S.A. Waksman og "The International Streptomyces Project Reports" skrevet af E.B. Shirling og D. Gottlieb (jfr. International Journal of Systematic Bacteriology Vol. 18, side 69 - 189 og 279 - 392 (1968), Vol. 19, side 391 - 512 (1969) og Vol. 22, side 265 - 394 (1972)), er det bekræftet, at de mikrobiologiske egenskaber af stammen ATCC 31279 er identiske med egenskaberne af Streptomyces lavendulae.

Denne observation er også bekræftet ved sammenligning af de mikrobiologiske egenskaber af stammen ATCC 31279 og af en type—kultur, Streptomyces lavendulae IAM 0009.

Som resultat af den ovenfor anførte undersøgelse er stammen blevet betegnet Streptomyces lavendulae.

2) Fermentering:

Fermentering til fremstilling af antibiotiket FR-31705 og antibioti-ket FR-900136 kan udføres på sædvanlig måde som anført ovenfor, og isolering af disse antibiotika kan almindeligvis også udføres på sædvanlig måde som anført ovenfor.

Som ovenfor nævnt indeholder dyrkningsvæsken både antibiotiket FR--31705 og antibiotiket FR-900136, og disse to antibiotika kan derfor adskilles på sædvanlig måde, f.eks. ad chromatografisk vej. Nedenfor er illustreret et eksempel på en adskillelsesmetode.·

Filtrat af dyrkningsvæske (trin a') syrnet absorbent absorbat I eluering eluat (trin b1) anionbytterharpiks 9 149822 eluat (trin c") cellulosekolonne- chromatrograf i |-( PR-31705 FR-900136

Trin a*:

Filtratet syrnes på sædvanlig måde (f.eks. indstilles på pH-værdi 2,0), og opløsningen ledes gennem en kolonne af en egnet adsorbent, f.eks. aktivkul. Elueringen udføres med et vandigt opløsningsmiddel (f.eks. methanol eller acetone).

Trin b':

Eluatet ledes gennem en kolonne af en anionbytterharpiks (f.eks. "DEAE-Sephadex" ® eller "Duolite” ® A-6). Elueringen udføres med f.eks. en vandig natriumchloridopløsning (f.eks. 0,3M) og en vandig ammoniakopløsning (f.eks. 0,2N).

Trin c':

Eluatet underkastes kolonnechromatografi under anvendelse af cellulose med et egnet fremkaldningsmiddel (f.eks. vandigt propanol). FR-31705 kan udskilles f.eks. ved fremkaldning med 97%'s vandigt propanol, og FR-900136 kan udskilles ved fremkaldning med 95%'s vandigt propanol.

Antibiotika FR-31705 og FR-900136, der er dannet i dyrkningsvæsken eller udskilt fra dyrkningsvæsken, kan isoleres i den frie form, dvs. FR-31705 per se. Disse antibiotika kan også isoleres i form af deres alkalimetal- eller jordalkalimetalsalte ved behandling af en opløsning indeholdende de nævnte antibiotika med en alkalimetal- eller jordalkalimetalforbindelse (f.eks. natrium- eller kaliumhydroxid eller calciumcarbonat) under fremgangsmåden, f.eks. ved ekstraktions-, isolerings- eller rensningsproces.

De antibiotika, der er vundet i de frie former, kan også omdannes til deres salte med baser, f.eks. med en uorganisk base (f.eks. na- jlo 149822 triumhydroxid, kaliumhydroxid, calciumhydroxid eller ammoniak) eller en organisk base (f.eks, ethanolamin, trimethylamin eller dicyclo-hexylamin) på sædvanlig måde.

Saltene af disse antibiotika kan let omdannes til den frie form ved behandling med en syre, f.eks. en mineralsyre (f.eks. saltsyre) på sædvanlig måde.

3) Antibiotika FR-31705 og FR-900136 s 3)—1. Antibiotiket FR-31705.

Antibiotiket FR-31705 har, fremstillet på den ovenfor beskrevne måde, i form af sit monokaliumsalt nedenstående fysiske og kemiske egenskaber: a) Elementaranalyse: C 21,62 H 4,07 N 6,36 K 17,99.

b) Smeltepunkt: 202 - 204°C (sønderdeling).

c) IR-Absorptionsspektrum (nujol): v__„ = 2950, 2925, 2850, 2550, 2380, 1650, 1460, 1410, 1395, 1375,-1320, 1300, 1260, 1220, 1190, 1150, 1120, 940, 890,.810, 785 og 700 cm"1.

d) NMR-Spektrum (i D2O): δ(ppm) = 1,25 - 2,3 (4H, m), 3,65 (2H, t, J=6Hz), 8,00 (sK

8,35 (s)J 1H

Ved analyse af de ovenfor angivne fysiske og kemiske egenskaber og som resultat af yderligere undersøgelser til identifikation af den kemiske struktur er denne kemiske struktur for antibiotiket FR-31705 identificeret og fastsat som følger: OH 0

I II

HCO-NCH2CH2CH2P-OH

OH

[3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propylphosphonsyre].

u . 149822 3)-2. Antibiotiket FR-900136.

Antibiotiket FR-900136 har, når det er fremstillet ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, i form af sit monokaliumsalt nedenstående fysiske og kemiske egenskaber: a) Elementaranalyse: C 21,32 H 3,26 N 6,00 I^O 1,49.

b) Smeltepunkt 178 - 180°C (sønderdeling).

c) IR-Absorptionsspektrum (nujol): vmax = 2960, 2930, 2870, 2600, 2350, 1660, 1530, 1460, 1440, 1400, 1380, 1365, 1290, 1250, 1180, 1125/-1070, 1010, 980, 960, 950, 890, 830, 780 og 700 cm”1.

d) NMR-Spektrum (i D20): δ(ppm) = 4,30 (2H, m), 6,01 (IH, m), 6,38 (IH, m), 8,02 (sh

8,38 (s)* 1H

Ud fra analysen af de ovenfor angivne fysiske og kemiske egenskaber og som resultat af yderligere undersøgelser til identifikation af den kemiske struktur er den kemiske struktur af antibiotiket FR-900136 identificeret og fastsat som følger:

OH O

I «

HCO-N-CH_CH=CHP-OH

2 I

OH

[3-(N-formyl-N-hydroxyamino)trans-1-propenylphosphonsyre]. Antimikrobiel virkning:

De omhandlede forbindelser har vist sig at have kraftig antibakte-riel virkning mod patogene mikroorganismer, f.eks. grampositive og gramnegative bakterier, herunder slægterne Bacillus, Sarcina, Escherichia, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Shigella og Enterobacter.

De omhandlede forbindelser kan derfor anvendes til behandling af infektionssygdomme, der er forårsaget af sådanne patogene bakterier i mennesker eller dyr. Nedenfor er anført de biologiske egenskaber af forbindelserne: 12 149822 1- Monoammoniumsaltet af 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propylphosphon-syre:

Mindste inhiberende koncentration (MIC): MIC-Forsøget udføres ved den sædvanlige serie-agar-fortyndingsmetode g (inokulum: 10 celler/ml) under anvendelse af en næringsagar, som inkuberes ved 37°C i 20 timer. MlC-værdien er den mindste koncentration af monoammoniumsaltet af 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-propylphosphonsyre (mcg/ml), der inhiberer vækst af mikroorganismer.

Resultaterne er følgende:

Forsøgsmikroorganisme MIC (mcg/ml)

Staphylococcus aureus FDA209P JC-1 > 800

Bacillus subtilis ATCC 6633 6,25

Sarcina lutea PCI 1001 <0,1

Escherichia coli NIHJ JC-2 200

Escherichia coli 1341-18(R) 12,5

Klebsiella pneumoniae NCTC 418 100

Proteus vulgaris IAM 1025 3,13

Proteus mirabilis 1432-75 6,25

Proteus morganii 1433-2 > 800

Proteus rettgeri 1434-3 1,56

Proteus inconstans 1436-21 3,13

Pseudomonas aeruginosa IAM 1095 0,78

Salmonella enteritidis 1891 0,39

Salmonella typhi 0-901 0,39

Salmonella paratyphi A-1015 12,5

Salmonella typhimurium 1406 25

Shigella flexneri IaEW8 12,5

Shigella sonnei I EW33 _ 100

Serratia marcescens 1421-4 100

Citrobacter freundii 1381-3 3,13

Enterobacter aerogenes 1402-10 6,25

Enterobacter cloacae 1401-4 6,25 13 149822

Beskyttende virkning mod eksperimentelle muse-infektioner: a) Forsøgsforbindelse: monoammoniumsaltet af 3-(N-formyl-N-hydroxy-amino)propylphosphonsyre.

b) Forsøgsdyr: hanmus af stammen ICR, 4 uger gamle og med en vægt på 24 - 1 g. Hver forsøgsgruppe består af 8 dyr.

c) Forsøgsmetode: en fastsat mængde patogene bakterier, suspenderet i 0/5 ml 5%'s vandig Mucin-opløsning, injiceres intraperitonealt i forsøgsdyrene.

Til hvert forsøgsdyr administreres derefter 0/25 ml af den ovennævnte forsøgsforbindelse i vand subcutant tre gange 0, 1 og 3 timer eller oralt én gang 1 time efter infektionen med de patogene bakterier .

Alle forsøgsdyrene observeres til konstatering af overlevelse eller død i én uge, og ED5q-værdierne beregnes. Resultaterne er anført i nedenstående tabel:

Tabel.

Patogen Indgivne leve- ED50 (m9/mus) bakterie dygtige celler ________ pr. mus Subcutan admi- Oral admini- nistration stration

Pseudomonas 1,2 x 10^ 0,228 0,280 aeruginosa 1101-76

Escherichia 6,9 x 10^ 0,167 2,559 coli 1341-67

Proteus 8,0 x 10^ 0,236 4,331 mirabilis 1432-75 14 1Λ9822

Akut toxicitet: a) Forsøgsforbindelse: xnononatriumsaltet af 3-(N-formyl-N-hydroxy-amino)propylphosphonsyre.

b) Forsøgsdyr: han- og hunmus af stammen ICR, 6 uger gamle.

c) Observationstid: 1 uge.

d) Beregningsmetode: Litchfield-Wilcoxon-metoden.

Tabel.

Dyr Køn LD50

Oral administration Subcutan administration

Mus hanner > 11.000 8.050 hunner > 11.000 8.270

Rotte hanner >11.000 8.000 2. Monokaliumsaltet af 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-trans-l-propenyl-phosphonsyre:

Mindste inhiberende koncentration (MIC): MIC-Forsøg udføres ved en sædvanlig serie-agar-fortyndingsmetode C - ’ (inokulum: 10 celler/ml) under anvendelse af en næringsagar, som inkuberes ved 37°C i 18 timer. MIC-Værdien udtrykkes som den minimale koncentration af monokaliumsaltet af 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)--trans-l-propenylphosphonsyre (mcg/ml), der inhiberer vækst af mikroorganismer. Resultaterne er som følger: 15 149822

Forsøgsmikroorganisme MIC (mcg/ml)

Staphylococcus aureas FDA209PJC-1 >100

Bacillus subtilis ATCC 6633 . 6,25

Sarcina lutea PCI 1001 0,2

Escherichia coli 1341-18(R+) 25

Klebsiella pneumoniae NCTC 418 100

Proteus vulgaris IAM 1025 1,56

Proteus mirabilis 1432-75 0,39

Proteus morganii 1433-2 ?100

Proteus rettgeri 1434-3 6,25

Proteus inconstans 1436-21 25

Pseudomonas aeruginosa IAM 1095 1,56

Salmonella enteritidis 1891 6,35

Salmonella typhi 0-901 0,78

Salmonella paratyphi A-1015 25

Salmonella typhimurium 1406 12,5

Shigella flexneri IaEW8 50

Shigella sonnei I EW33 25

Serratia marcescens 1421-4 >100

Citrobacter freundii 1381-3 12,5

Enterobacter aerogenes 1402-10 50

Enterobacter cloacae 1401-4 12,5

Farmaceutiske præparater indeholdende hydroxyaminocarbonhydrid-phosphonsyrederivater.

De fremstillede forbindelser og farmaceutisk tolerable salte deraf kan formuleres med henblik på administration på en hvilken som helst bekvem måde analogt med kendte antibiotika, i blanding med et ikke--toxisk, farmaceutisk tolerabelt bærestof.

Et farmaceutisk tolerabelt salt af de fremstillede forbindelser kan være et salt med en uorganisk eller organisk base, f.eks. natrium- 149822 16 saltet, kaliumsaltet, calciumsaltet, ammoniumsaltet, ethanolaminsal-tet, triethylaminsaltet og dicyclohexylaminsaltet, og et salt med in røanisfi eiløi ørøinisK ayrej Lefa. ftyflrocniorldQt, sulfatet, citratet, raaleatet, fumaratet, tartratet og p-toluensulfonatet, samt salte med en aminosyre såsom argininsaltet, asparaginsyresåltet eller glutaminsyresaltet.

Den antimikrobielle komposition kan anvendes i form af et farmaceutisk præparat, f.eks. i fast, halvfast eller flydende form, som indeholder en aktiv forbindelse fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen i blanding med et farmaceutisk organisk eller uorganisk bærestof eller excipiens, der er egnet til ekstern, enteral eller parenteral applikation.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

Et vandigt medium indeholdende 2% kartoffelstivelse, 1% glutenmel, 1% tørret gær og 1% majsstøbevand indstilles på pH-værdi 7,0 med 6N vandig natriumhydroxidopløsning. I hver af seks 500 ml's Erlenmeyer-kolber hældes 100 ml af mediet, og der steriliseres ved 120°C i 20 minutter. I hvert medium podes med et øjefuld af en skråkultur af Streptomyces lavendulae ATCC 31279, og organismen dyrkes i et roterende rysteapparat ved 30°C i 3 dage.

På den anden side hældes 20 liter af et vandigt medium indeholdende 3% methyloleat, 1% bomuldsfrømel, 1% hvedekim, 0,5% tørret gær, 0,5% majsstøbevand, 1% kaliumdihydrogenphosphat og 1% sekundært natriumphosphat i en 30 liters ryste-fermenteringsbeholder og steriliseres ved 120°C i 30 minutter. Til mediet hældes hele rumfanget af den dyrkede væske, der er vundet på den ovenfor beskrevne måde, hvorefter organismen dyrkes ved 30°C i 3 dage. I dyrkningsperioden styres fermenteringen ved omrøring af væsken med et propellerudstyr med en hastighed af 250 omdrejninger pr. minut, ved at lede steril luft gennem dyrkningsvæsken i en mængde på 20 liter/dyrknings-væske/minut og ved at holde det indre atmosfæretryk i fermente-ringsbeholderen på 0,5 kg/cm .

17 149822

Efter endt dyrkning filtreres dyrkningsvæsken ved hjælp af 2 kg diatoméjord. Filtratet (15 liter) ..indstilles på pH-værdi 2,0 med IN saltsyre og ledes gennem en kolonne med 5 liter aktivkul. Efter vask af kolonnen med vand udføres elueringen med 4 liter 70%'s vandigt acetone.

Eluatet inddampes til et rumfang på 1 liter, indstilles på pH--værdi 2 med 6N saltsyreopløsning og ledes derefter gennem en kolonne med 500 ml anionbytterharpiks "Duolite" ® A-6 (OH-type) (Diamond Shamrock Chemical Co.). Efter vask af kolonnen med vand udføres elueringen med 1,5 liter 0,1N vandig natriumhydroxidopløsning. Eluatet ledes gennem en kolonne med kationbytterharpiks "Duolite" ® C-20 (H+-type) (Diamond Shamrock Chemical Co.). Efter vask af kolonnen med vand udføres elueringen med 500 ml 60%'s vandigt acetone. Eluatet inddampes under reduceret tryk, hvorved der fås en olieagtig remanens, som underkastes kolonnechromatografi på 300 ml cellulose med 801 vandigt acetonitril som fremkaldnings-middel. Fraktionerne indeholdende den ønskede forbindelse isoleres og inddampes under reduceret tryk, hvorved der fås en olieagtig remanens, som indstilles på pH-værdi 7,0 med IN vandig kaliumhydro-xidopløsning og underkastes kolonnechromatografi på 300 ml cellulose med 60%'s vandigt propanol som fremkaldningsmiddel. Fraktioner indeholdende den ønskede forbindelse isoleres og inddampes under reduceret tryk, hvorved der fås en olieagtig remanens, som opløses i 2 ml '.ethanol. Til opløsningen sættes 20 ml acetone og 200 ml diethylether til dannelse af et bundfald, som isoleres ved filtrering og tørres, hvorved der fås 150 mg råt pulver. Pulveret opløses i 150 ml vand, og opløsningen indstilles på pH-værdi 7 og ledes gennem en kolonne med 100 ml aktivkul. Efter passagen inddampes opløsningen under reduceret tryk, hvorved der fås en olieagtig remanens, som underkastes kolonnechromatografi på 200 ml cellulose med 65%'s vandigt propanol som fremkaldningsmiddel. Fraktionerne indeholdende den ønskede forbindelse isoleres og inddampes under reduceret tryk, hvorved der fås en olieagtig remanens, som opløses i 1 ml methanol. Opløsningen opvarmes til 50°C, og til opløsningen sættes 10 ml acetone. Blandingen lades henstå natten over ved 4°C, hvorved der fås krystaller, som isoleres ved filtrering og tørres til dannelse af 5 mg monokaliumsalt af FR-31705 i form af nåle.

18 1Λ 9 8 2 2

Eksempel 2.

I hver af ti 500 ml's Erlenmeyer-kolber hældes 100 ml af et vandigt medium indeholdende 1% kartoffelstivelse, 1% glycerol, 1% bomuldsfrømel og IS tørret gær, og kolberne steriliseres ved 120°C i 20 minutter. I hver kolbe podes mediet ved tilsætning af et øjefuld af en skråkultur af Streptomyces lavendulae ATCC 31279, og organismen dyrkes i et roterende rysteapparat ved 30°C i 3 dage.

På den anden side hældes 80 liter af et vandigt medium indeholdende 3% methyloleat, 1% bomuldsfrømel, IS hvedekim, 0,5S majsstøbevand, 0,5% tørret gær, 1% kaliumdihydrogenphosphat og 1% sekundært natriumphosphat i en 100 liters ryste-fermenteringsbeholder og steriliseres ved 120°C i 30 minutter. Hele det på den ovenfor beskrevne måde vundne rumfang af dyrket væske podes i mediet, og organismen dyrkes ved 30°C i 72 timer. I dyrkningstiden styres fermentationen ved at omrøre dyrkningsvæsken med et propellerapparat med en hastighed på 130 omdrejninger/minut, ved at lede steril luft gennem dyrkningsvæsken med en hastighed på 80 liter/ dyrkningsvæske/minut og ved at holde det indre atmosfæriske tryk 2 i fermenteringsbeholderen på 1 kg/cm .

Efter endt dyrkning filtreres dyrkningsvæsken ved hjælp af 5 kg diatoméjord. Filtratet (70 liter) indstilles på pH-værdi 2 med 6N saltsyreopløsning og behandles derefter med 20 liter aktivkul. Elueringen udføres med 20%'s vandigt acetone. Acetonet fjernes fra eluatet under reduceret tryk. Den resulterende vandige opløsning indstilles på pH-værdi 2 med en kationbytterharpiks, "Duo-lite'' ® C-20 (H+-type) og ledes derefter gennem en kolonne med anionbytterharpiks, "Duolite"® a-6 (OH -type). Elueringen udføres med 0,2N ammoniakvand. Eluatet indstilles på pH-værdi 6 og lyofiliseres, hvorved der fås 100 g råt pulver, som opløses i 3 liter vand. Opløsningen indstilles på pH-værdi 2 ved tilsætning af 6N saltsyreopløsning og behandles med 6 liter aktivkul. Elue-ring udføres med 0,03N ammoniakvand. Eluatet indeholdende den ønskede forbindelse inddampes under reduceret tryk til et rumfang på 1 liter. Koncentratet indstilles på pH-værdi 2 og inddampes yderligere under reduceret tryk og underkastes derefter kolonne-chromatografi på 1 liter cellulose. Kolonnen vaskes med 1 liter ace-'