CN105255839A

CN105255839A - 一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用

Info

Publication number: CN105255839A
Application number: CN201510459580.5A
Authority: CN
Inventors: 吴寒华; 李登峰; 严小军; 周成旭; 刘联国
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-07-30
Also published as: CN105255839B

Abstract

本发明公开了一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用，特点是该病毒为肋条藻单链DNA裂解病毒ScssDNAV，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.10599，用于抑制中肋骨条藻生长并杀死中肋骨条藻，其对中肋骨条藻NMBguh004-1、NMBguh004-2具有强裂解作用，优点是可安全、高效、快速、特异性的降解海水中中肋骨条藻，其藻叶绿素a浓度减少率达76.14%。

Description

一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及一种藻裂解病毒，尤其是涉及一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用。

背景技术

赤潮是被公认的海洋环境灾害，对海洋渔业生产和海洋生态平衡表现出很强的破坏性。赤潮藻体通过水流进入鱼类的鳃部，造成鱼类窒息死亡；有些赤潮藻还分泌毒素，鱼类吞食后，会造成鱼类死亡。另外，藻体死亡后，在分解过程中还会消耗水中的大量溶解氧，致使大量海洋生物因缺氧而死，导致水质恶化，影响水资源的合理利用。目前国内外除藻方法主要为物理法、化学法和生物法3大类。物理方法成本高，不能从根本上解决营养成分对藻类的刺激作用；化学除藻剂虽然具有一定效果，可快速杀死藻类，但会产生二次污染，同时化学药品的生物富集和放大对整个生态系统的负面影响较大，长期使用低浓度的化学药物会使藻类产生抗药性，易造成环境污染甚至破坏生态平衡。微生物控藻技术是一种生态修复技术，其通过强化或减弱系统内藻功能的力度对系统进行调节，具有经济性、有效性、安全性的特点。微生物除藻技术包括病毒除藻、原生动物除藻和细菌除藻3方面。其中，病毒控藻技术的主要优势在于它能够强化系统固有生态功能，其利用浮游生物——病毒回路的作用，实现营养物向高营养级的传递，恢复生态系统平衡，同时利用病毒感染的特异性，可将技术的生态风险控制到很低水平，因此该技术有良好的发展前景。

中肋骨条藻是一种在全球近岸海域分布极广的广温广盐性浮游硅藻，在黄、东、南海均有该种赤潮记录，中肋骨条藻已经成为我国赤潮的优势种。2005年9月23-27日，江苏海州湾海域赤潮，最大面积为1000km²，主要赤潮生物为中肋骨条藻，直接经济损失500万元。

将藻类病毒很好地应用到赤潮控制中是非常迫切的,也是非常有发展前景的。自2004年Nagasaki等首次发现刚毛根管藻病毒以来，迄今已有16株硅藻病毒陆续被发现，但是并未发现能够特异性裂解中肋骨条藻的藻病毒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用，该裂解病毒可安全、高效、快速、特异性的降解海水中中肋骨条藻，使其藻叶绿素a浓度减少率达76.14％。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种中肋骨条藻裂解病毒：该病毒为ScssDNAV株，分类命名为中肋条藻单链DNA裂解病毒(Skeletonemacostatumsingle-strandDNAvirus)，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10599。

该病毒的生物学特征如下：该病毒为球状，直径98±2nm，无鞭毛无外膜包被，单链DNA分子；该病毒液分别在20℃中放置两周、65℃中放置30min，其活性稳定；在pH3、pH10环境下，其活性稳定；在紫外线下处理10分钟，活性稳定；在-80℃中反复冻融1、3、5、7次，其活性均稳定。

上述中肋骨条藻裂解病毒的分离纯化方法：将含有中肋骨条藻裂解病毒的水域表层水样依次经中速滤纸、0.45μm、0.22μm滤膜后，经超滤系统浓缩成浓缩水样，其浓缩倍数为100倍；将浓缩水样与指数生长期的中肋骨条藻按体积比1：4的比例混合后，在恒温光照培养箱中培养7天，培养温度为20℃，光照强度2500LX，光暗比12h:12h，得到中肋骨条藻裂解液；然后经0.22μm的微孔滤膜过滤取滤液，在滤液中加入PEG6000使其终浓度达到10w/v％，4℃冰箱内黑暗下放置过夜，第二天将病毒滤液经4℃，36,000g离心1.5h，去上清，用含有添加量为30mg/L硅酸盐的f/2培养基悬浮沉淀即为纯化的肋骨条藻裂解病毒液。

上述中肋骨条藻裂解病毒的应用，用于抑制中肋骨条藻生长并杀死中肋骨条藻。

其对中肋骨条藻NMBguh004-1、NMBguh004-2株具有强裂解作用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用，将中肋骨条藻裂解病毒用于控制在特定环境下由于中肋骨条藻爆发性增值或高度聚集而引起的赤潮，此裂解病毒具有高复制率、高感染率的特点，可高效裂解中肋骨条藻；该病毒具有高特异性，可专一裂解中肋骨条藻，这是保证生态安全的重要前提；成本低，病毒的高复制率，培养大量中肋骨条藻裂解病毒较为容易；操作简单，且不会造成环境污染；是一种新型的治理中肋骨条藻赤潮的技术，具有良好的发展前景。

综上所述，本发明提供一株中肋骨条藻裂解菌的分离方法和应用，该裂解菌可高效、快速降解海水中中肋骨条藻，该菌10天能使藻叶绿素a浓度减少76.14％。

一种中肋骨条藻裂解病毒：该病毒为ScssDNAV株，分类命名为中肋条藻单链DNA裂解病毒(Skeletonemacostatumsingle-strandDNAvirus)，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10599，，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

附图说明

图1为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV负染图；

图2为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV经不同pH、温度、紫外线处理后对中肋骨条藻叶绿素a的影响；

图3为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV反复冻融后对中肋骨条藻叶绿素a的影响；图中1、3、5、7分别表示冻融1、3、5、7次；

图4为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV对中肋骨条藻NMBguh004-2叶绿素a浓度的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验方法

取5mL藻液，6000g离心15min后去上清，加入5mL体积分数为90％的乙醇水溶液或者体积分数为90％的丙酮水溶液，在4℃冰箱内避光放置。24h后7000g离心10min，上清液用分光光度计检测在663nm和645nm时的吸光度，用体积分数为90％的乙醇水溶液或者体积分数为90％的丙酮水溶液调零。藻叶绿素a浓度利用以下公式计算得到：a＝(12.7D₆₆₃-2.59D₆₄₅)*V/A

a代表藻叶绿素a浓度，V为加入的体积分数为90％的乙醇水溶液或者体积分数为90％的丙酮水溶液体积，A为藻细胞重量(g)。藻细胞裂解，藻叶绿素a浓度下降。

二、具体实施例

实施例1

中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV的分离、纯化

表层水样采自浙江省宁波市宁海双盘涂水产养殖场，于冰浴下保存，水样依次经中速滤纸、0.45μm、0.22μm滤膜后，经超滤系统浓缩成浓缩水样，其浓缩倍数为100倍。

配制浓缩水样与指数生长期的中肋骨条藻NMBguh004-2按体积比1：4的比例混合后，在恒温光照培养箱中培养7天，培养温度为20℃，光照强度2500LX，光暗比(L/D)12h:12h，得到中肋骨条藻裂解液。将不含病毒的浓缩液与处于指数生长期的中肋骨条藻共培养作为对照组。分别用肉眼、光学显微镜、藻叶绿素a浓度变化和电镜观察藻生长情况。

选取与对照组相比具有裂解现象的实验组，经0.22μm的微孔滤膜过滤，除去中肋骨条藻裂解碎片。滤液中加入PEG6000使其终浓度达到10％(质量体积百分比)，4℃冰箱内黑暗下放置过夜。第二天将病毒滤液经4℃，36,000g离心1.5h，去上清，用含有添加量为30mg/L硅酸盐的f/2培养基(中肋骨条藻培养基)悬浮沉淀即为纯化的病毒液。

纯化的中肋骨条藻裂解病毒该病毒命名为中肋条藻单链DNA裂解病毒(Skeletonema.costatumsingle-strandDNAvirus，ScssDNAV)，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10599。

其中f/2培养基的成分为：硝酸钠75mg/L，磷酸二氢钠5mg/L，六水合三氯化铁3.15mg/L，EDTA-Na₂4.36mg/L，五水硫酸铜10mg/L，七水硫酸锌22mg/L，六水氯化钴10mg/L，四水氯化锰18mg/L，二水钼酸钠6.3mg/L，维生素B₁₂1mg/L，维生素H1mg/L，维生素B₁200mg/L，加人工海水至1L。

实施例2

用光学显微镜、电子显微镜观察肋骨条藻裂解病毒的形态

取纯化的病毒感染中肋骨条藻NMBguh004-2，4d后藻液颜色变淡，光学显微镜下观察藻细胞，发现大部分藻细胞裂解。

取实施例1所分离纯化的中肋骨条藻裂解病毒滴于铜网格上，以2％乙酸铀酰溶液(W/V)进行负染，再置于电子显微镜(日立H-7650)下观察中肋骨条藻裂解病毒的形态。

结果如图1所示，中肋骨条藻裂解病毒颗粒系为球状，直径98±2nm，无鞭毛无外膜包被。

实施例3

不同pH、温度、紫外线以及冻融对中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV稳定性的影响

(1)不同pH对中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV稳定性的影响

取实施例1分离纯化得到的新鲜病毒液2份，测病毒液原始pH值并记录，随后用0.1MNaOH和0.1MHCl将病毒液相应调制pH＝3和pH＝10并分别处理30min作为实验组，用0.1MNaOH和0.1MHCl将水相应调制成pH＝3和pH＝10的水溶液作为对照组；在第0、4、10d分别取5mL藻液提取叶绿素a，检测实验组和对照组的叶绿素a浓度变化。

结果表明，如图2所示，中肋骨条藻裂解病毒液在pH3和pH10处理30min，藻叶绿素a浓度与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。对照组藻叶绿素a浓度从0.105mgL^-1上升至0.284mgL^-1。但是，经pH3和pH10处理30min后的实验组，藻叶绿素a浓度在由最初的0.105mgL^-1在第四天分别上升至0.204mgL^-1和0.208mgL^-1，到第10天与对照组相比其叶绿素a浓度分别下降了46.48％和49.65％。说明强酸强碱不能使ScssDNAV溶藻活性明显降低，ScssDNAV耐酸耐碱。

(2)不同温度对中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV稳定性的影响

取实施例1分离纯化得到的新鲜病毒液2份，其中1份在20℃冰箱内放置2周后，于65℃水浴锅内处理30min；另一份未作处理作为对照组，在第0、4、10d分别取5mL藻液提取叶绿素a，检测实验组和对照组的叶绿素a浓度变化。

结果表明，如图2所示，中肋骨条藻裂解病毒液在20℃冰箱内放置2周，65℃水浴锅内处理30min，藻叶绿素a浓度与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。实验组和对照组藻叶绿素a浓度在前4天均有所上升，但是实验组上升速度明显比对照组慢。第10天，对照组藻叶绿素a浓度仍处于上升状态，但是在20℃冰箱内放置2周，65℃水浴锅内处理30min后的对照组，藻叶绿素a浓度分别下降至0.137mgL^-1和0.132mgL^-1，与对照组(0.284mgL^-1)相比分别下降了51.93％和53.68％。说明病毒可在20℃下储存，且在65℃环境下其活性依旧很强。

(3)取实施例1分离纯化得到的新鲜病毒液2份，其中1份置于无菌培养皿中紫外线UV下照射10min；另一份未作处理作为对照组，在第0、4、10d分别取5mL藻液提取叶绿素a，检测实验组和对照组的叶绿素a浓度变化。

结果表明，如图2所示，中肋骨条藻裂解病毒液在UV下作用10min，藻叶绿素a浓度与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。虽然前4天实验组和对照组藻叶绿素a浓度均上升，但是在第10天，与对照组藻叶绿素a浓度相比，实验组藻叶绿素a浓度下降了55.09％。说明UV照射不可使ScssDNAV溶藻活性明显降低，ScssDNAV耐受紫外线照射。

(4)取实施例1分离纯化得到的新鲜病毒液4份，分别-80℃冻融1、3、5、7次作为实验组，取实验组病毒液15mL与60mL处于指数生长期的中肋骨条藻NMBguh004-2在恒温光照培养箱中共培养(培养条件同实施例1)，将不含病毒的浓缩液作为对照组与处于指数生长期的中肋骨条藻共培养作为对照组，在第0、4、10d分别取5mL藻液提取叶绿素a，检测实验组和对照组的叶绿素a浓度变化。

结果表明，如图3所示，中肋骨条藻病毒液在-80℃下反复冻融1、3、5、7次，其活性并没有显著降低(P<0.05)。与对照组相比，第10天实验组藻叶绿素a浓度分别下降了56.46％，55.1％，55.1％，50.34％，说明冻融不能使ScssDNAV溶藻活性明显降低，且冻融冻融次数影响不大，中肋骨条藻病毒液可反复冻融。

实施例4

宿主特异性测试

为测试本发明中肋骨条藻裂解病毒的宿主特异性，选用如表1所示的藻种进行宿主特异性实验。取表1中处于指数生长期的五种骨条藻:中肋骨条藻NMBguh004-2、NMBguh004-1、NMBguh004-3、NMBguh004-5、热带骨条藻NMBguh004-6各60mL与15mL病毒液共培养(培养条件同实施例1)。用15mL加30mg/L硅酸盐的f/2培养基作为对照组。在第0、4、10d分别取5mL实验组和对照组藻液提取叶绿素a，检测的叶绿素a浓度变化。

结果表明，中肋骨条藻裂解病毒与中肋骨条藻NMBguh004-3、NMBguh004-5、热带骨条藻NMBguh004-6共培养，实验组与对照组藻叶绿素a浓度变化无显著差异(p<0.05)；中肋骨条藻裂解病毒与中肋骨条藻NMBguh004-2、NMBguh004-1共培养，在0-4d实验组和对照组藻叶绿素a浓度持续上升，但是实验组藻叶绿素a浓度一直都比对照组藻叶绿素a浓度低；在5-10d实验组藻叶绿素a浓度持续下降，对照组藻叶绿素a浓度一直上升。综上，中肋骨条藻裂解病毒可特异性感染中肋骨条藻NMBguh004-2、NMBguh004-1。

表1中肋骨条藻裂解病毒宿主特异性实验

藻种	来源	感染结果
			中肋骨条藻NMB guh004-2	福建厦门	+
中肋骨条藻NMB guh004-1	浙江宁波	+
			中肋骨条藻NMB guh004-3	浙江朱家尖	-
中肋骨条藻NMB guh004-5	浙江南麂岛	-
			热带骨条藻NMB guh004-6	加勒比海南部	-

注：“+”:阳性；“-“:阴性。

实施例5

中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV基因组核酸类型鉴定

取纯化的病毒颗粒(实施例1提供)，用基因组提取试剂盒提取核酸，定量后分别采用DNA酶、RNA酶、单链核酸酶切病毒基因组核酸。根据酶切图谱，中肋骨条藻病毒核酸对DNaseI和S1nuclease敏感，酶切后电泳无条带，但是对RNaseA不敏感。综上分析，该病毒是单链DNA分子(ssDNA)。

实施例6

病毒ScssDNAV对中肋骨条藻藻华的控制应用

取实施例1所分离纯化的中肋骨条藻裂解病毒液按照1:4的比例添加中肋骨条藻NMBguh004-2藻华液，在恒温光照培养箱中共培养(培养条件同实施例1)，对照藻华添加含30mg/L硅酸盐的f/2培养基。以一步生长曲线(one-stepgrowthcurve)测定中肋骨条藻裂解病毒复制趋势。在第0、4、10d分别取5mL藻病毒感染液提取叶绿素a，检测实验组和对照组的叶绿素a浓度变化。

结果如图4所示，与对照组相比，裂解液的藻叶绿素a浓度在第10天具有显著性影响(P<0.05)。对照组藻叶绿素a浓度从0.096mg/L稳定上升至0.285mg/L。而实验组，前四天缓慢上升至0.186mg/L，随后到第10天下降至0.068mg/L，与对照组相比下降了76.14％，对中肋骨条藻具有很好的裂解作用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种中肋骨条藻裂解病毒，其特征在于：该病毒命名为中肋条藻单链DNA裂解病毒，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10599。

2.根据权利要求1所述的一种中肋骨条藻裂解病毒，其特征在于该病毒的生物学特征如下：该病毒为球状，直径98±2nm，无鞭毛无外膜包被，基因组为单链DNA分子；该病毒液分别在20℃中放置两周、65℃中放置30min，其活性稳定；在pH3、pH10环境下，其活性稳定；在紫外线下处理10min，活性稳定；在-80℃中反复冻融1、3、5、7次，其活性均稳定。

3.一种权利要求1所述的中肋骨条藻裂解病毒的分离纯化方法，其特征在于：将含有中肋骨条藻裂解病毒的水域表层水样依次经中速滤纸、0.45μm、0.22μm滤膜后，经超滤系统浓缩成浓缩水样，其浓缩倍数为100倍；将浓缩水样与指数生长期的中肋骨条藻按体积比1：4的比例混合后，在恒温光照培养箱中培养7天，培养温度为20℃，光照强度2500LX，光暗比12h:12h，得到中肋骨条藻裂解液；然后经0.22μm的微孔滤膜过滤取滤液，在滤液中加入PEG6000使其终浓度达到10w/v%，4℃冰箱内黑暗下放置过夜，第二天将病毒滤液经4℃，36,000g离心1.5h，去上清，用含有添加量为30mg/L硅酸盐的f/2培养基悬浮沉淀即为纯化的肋骨条藻裂解病毒液。

4.一种权利要求1所述的中肋骨条藻裂解病毒的应用，其特征在于：用于抑制中肋骨条藻生长并杀死中肋骨条藻。

5.根据权利要求4所述的一种中肋骨条藻裂解病毒的应用，其特征在于：其对中肋骨条藻NMBguh004-1、NMBguh004-2具有强裂解作用。