KR20220053595A - 녹색 대형조류 대발생의 제어 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 녹색 대형조류 대발생의 제어에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 울바 조류 대발생은 지중해의 해수에 함유된 살아있는 활성 성분에 의해 제어될 수 있다. 본 발명자들은 특정 지점에서 수집된(예를 들어, 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집된) 지중해로부터의 해수가, 예를 들어, H2S 증기와 같은 독성 산성 증기를 방출하지 않고 울바 락투카의 사망을 촉진할 수 있음을 관찰했다. 종합하면, 본 발명자들은 상기 해수가 울바, 특히 울바 락투카의 사망을 촉진하는 원인이 되는 살아있는 미생물을 포함함을 보여주는 데이터를 제공한다. 보다 정확하게는, 본 발명자들은 울바 락투카의 사망을 촉진하고, 따라서 울바 락투카 대발생의 제어를 촉진하는 미생물이 바이러스임을 나타내는 실험 데이터를 제공한다.

Description

녹색 대형조류 대발생의 제어
본 발명은 녹색 대형조류 대발생(green macroalgae blooms)의 제어에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 울바 락투카(Ulva lactuca) 녹조류 대발생은 지중해에서 수집된 해수에 함유된 살아있는 미생물, 보다 구체적으로는 바이러스에 의해 제어될 수 있다.
미세조류 (또는 해조류)는 색소 침착에 기초하여 갈조류, 홍조류 및 녹조류의 세 가지 주요 그룹으로 분류된다. 이 미세조류는 모두 가변 함량의 미네랄 회분(mineral ash; 7% 내지 38%)과 함께 다량의 탄수화물(최대 60%), 중간/다량의 단백질(10% 내지 47%) 및 소량의 지질(1% 내지 3%)을 함유한다. 사용 가능한 토지와 담수 자원이 감소함에 따라 미세조류는 육생 작물에 필적하는 귀중한 바이오매스(biomass) 생산을 위한 매력적인 대안이 된다. 제어되고 지속 가능한 재배 시스템하에서 미세조류의 배양은 아마도 시장 개발 요구를 충족시키는 바이오매스를 공급하기 위한 미래의 선택 방법일 것이다.
고탄수화물 분획은 갈조류의 경우 라미나린, 알기네이트, 만니톨 또는 후코이단, 홍조류의 경우 전분, 만난 및 황산화 갈락탄, 녹조류의 경우 울반과 같은 다양한 쉽게 가용성인 다당류를 포함한다. 갈색 해조류의 주요 구조 중합체 중 하나인 알기네이트는 흐르는 물에 노출된 표본에 안정성과 유연성을 모두 제공하며, 일반적으로 증점제, 겔화제 또는 유화제로 사용되는 한천 및 카라기난과 같은 다른 하이드로콜로이드와 같이 해조류 바이오매스에서 발견되는 산업적으로 관련된 탄수화물 화합물 중 하나이다. 해조류에서 수득된 다른 다양한 비탄수화물 제품에는 단백질, 지질, 페놀, 테르페노이드 및 미네랄, 예를 들어, 요오드, 칼리 및 인을 포함하며, 이는 동물 및 인간 영양 모두에 유용한 성분이다.
인간 영양에서 미세조류의 관심은 높은 미네랄 농도(예: 칼슘, 마그네슘 및 칼륨)와 글루탐산에 기인하며, 이는 그들을 미각 향상제로서도 유용하게 한다. 조류는 또한 현재 식품 산업이 직면한 가장 큰 도전 중 하나를 다루는 데 도움이 될 수 있다. 실제로, 식염과 대조적으로 해조류는 소량의 나트륨을 함유하기 때문에, 과도한 염화나트륨 섭취와 관련된 건강 위험을 방지하기 위한 대안으로서 역할을 할 수 있다. 미세조류는 또한 점점 더 많은 의약품을 제조하기 위해 오늘날 주로 탐구되고 있는 활성 성분의 공급원이다. 황산화 다당류의 겔화 특성은 익히 공지되어 있으며, 이들의 치료적 적용은 개발 중이다. 미세조류 다당류, 안료, 단백질, 아미노산 및 페놀계 화합물은 건강 유지 및 만성 질환의 예방을 위한 잠재적인 기능성 식품 성분이며 제약 산업에서 점점 더 많은 잠재적인 용도가 있다.
매년 경제적 관심이 증가하는 미세조류와는 대조적으로, 대형조류는 특히 바다 환경과 인간과 동물의 건강에 위험 요소로 남아 있다. 실제로, 대형조류 대발생은 해양 생태계를 손상시키고, 지역 관광에 부정적인 영향을 미친다. 이것은 특히 울바 락투카 대발생의 경우이다.
울바 락투카는 18세기에 발트해에서 린네(Linnaeus)에 의해 처음 기재된 녹조류 문(phylum Chlorophyta)에 속하는 대형조류이다. 울바 락투카 조류는 이중층 세포 구조로 이루어져 있으며, 그의 엽상체는 일반적으로 평평한 칼날 외관을 갖는다. 그것은 바위와 같은 고착 기관 또는 자유 부유로 모두 성장시킬 수 있다. 울바 락투카 조류는 두 가지 방법으로 번식하는 능력을 갖고, 하나는 성적이고 다른 하나는 대형조류에서는 거의 관찰되지 않는 엽상체의 단편화로 인한 것이다. 이러한 두 가지 방법은 수면을 덮음으로 빠르게 증식하는 능력을 제공하여 다른 조류 종의 생물 다양성을 감소시킨다. 울바 락투카는 물의 염분 또는 박테리아와의 공생 정도에 관한 다형성 종이다.
울바 락투카는 주로 해변을 침입하고, 그의 생분해는 울바 락투카 생분해 및 아마도 인간으로 인해 동물의 죽음을 유도하는 독성 산성 증기(주로 H2S)를 생성할 수 있다(2009년 프랑스 서부에 위치한 브르타뉴 해안에서 말이 사망한 것으로 보고되었다).
기술될 최초의 울바 락투카 대발생은 19세기 말에 벨파스트(아일랜드 북부)에서 였다. 울바 락투카 대발생은 1930년대부터 베니스의 라구나에서 잘 연구되었고, 1990년대 이후에는 설명되지 않은 감소가 관찰되었다. 1980년대 이후 갈리시아(스페인)부터 도쿄만(일본)까지 아메리카 대륙과 호주 해안을 포함한 전 세계적으로 울바 락투카 대발생이 관찰되었다. 그러나, 지금까지 세계에서 가장 큰 사건은 2007년부터 10년 연속 황해에서 관측된 녹조로 잔류하며, 그 표면의 10%를 덮고 있다. 유럽에서는 브르타뉴 북쪽 해안에 가장 큰 울바 락투카 대발생이 있다. 오늘날 울바 락투카 대발생은 특히 해수 중 미량의 질소와 인의 양이 증가하고 있기 때문에 주로 인간 활동의 결과임이 인정되었다. 또한, 벨파스트와 베니스 주변의 바다에서 관찰된 녹조는 인간 폐기물의 거부 증가와 상관관계가 있었다.
문서 KR20040037467에서와 같이 물의 온도를 변경하면 조류의 증식에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다. 다른 사람들은 또한 미생물, 특히 박테리아가 호수와 강에서 증식성 조류를 사멸시키는 데 사용될 수 있다고 보고했다(참조: 예를 들어, KR20180119021). 마지막으로, JPH1171203은 β-시아노-알라닌이 살조제로서 해양 환경에서 남조류의 방제를 촉진하는데 효과적인 것으로 입증될 수 있음을 개시하였다.
지금까지, 해수 또는 해안선, 예를 들어, 해변에서 녹조류를 수집하는 것은 울바 락투카 대발생에 대처하는 유일한 해결책이다.
따라서, 해수 또는 울바로 오염된 해안선의 토지에서 울바 속(genus Ulva)의 조류, 특히 울바 락투카 종(species Ulva lactuca)의 대발생을 제어 및/또는 근절하기 위한 수단을 제공할 필요가 있다.
또한, 특히, 예를 들어, H2S 증기와 같은 독성 산성 증기의 방출 없이 안전한 방식으로 울바 대발생을 제어할 필요가 있다.
본 발명의 한 측면은 지중해에서 수집된 해수와 상기 해양 환경을 접촉시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 울바 속의 조류는 울바 락투카 종의 조류이다. 일부 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집된다. 특정 구현예에서, 상기 해수는 울바 속의 조류의 사망을 촉진할 수 있는 살아있는 미생물을 포함한다. 일부 구현예에서, 살아있는 미생물은 바이러스이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기 해양 환경을 지중해에서 수집된 해수로부터 유래되는 하나 이상의 살아있는 미생물(들)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 울바 속의 조류는 울바 락투카 종의 조류이다. 특정 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집된다. 일부 구현예에서, 상기 살아있는 미생물은 바이러스이다.
본 발명의 또 다른 측면은 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한, 지중해에서 수집된 해수로부터 유래된 하나 이상의 살아있는 미생물(들)의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 울바 속의 조류는 울바 락투카 종의 조류이다. 일부 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집된다. 특정 구현예에서, 상기 살아있는 미생물은 바이러스이다.
정의
본 발명에서, 이하의 용어는 이하의 의미를 갖는다:
- 수치에 선행하는 "약"은 상기 수치 값의 플러스 또는 마이너스 10% 이하를 포함한다. 용어 "약"이 지칭하는 값은 그 자체가 구체적으로, 바람직하게는 개시되어 있음을 이해해야 한다.
- "대발생"은 인구의 빠르고 과도한 증가를 지칭한다. 확장하여, "조류 대 발생"은 소정의 해양 환경에서 조류의 빠르고 과도한 성장을 지칭한다. 실제로, 녹조류 대발생은 소정의 주변에서 녹조류의 과도한 농도의 존재로 인해 해수의 녹색 착색을 지칭하는 "녹조"의 원인이 될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "조류 대발생"은 오염된 물, 특히 해수 및 해안선 지역, 특히 해안과 해변은 조류의 분해시 방출되는 독성 증기로 인해 동물과 인간 모두에게 생명을 위협할 수 있기 때문에 오염물질로 간주된다.
- "해양 환경"은 외해(또는 심해), 해안, 하구, 해안선을 포함하는 해수로부터의 생태계를 지칭한다. 실제로, 해안선은 바위, 해변과 같은 바다와 직접 접촉하는 임의의 육지 또는 지표를 포함한다.
- "제어하는"이란 특정 유해한 현상을 방지하거나 늦추기(완화하기) 위해 착수된, 예방 또는 방지 단계를 포함하는 두 단계를 모두 지칭한다. 이러한 단계를 필요로 하는 환경은 상기 특정 유해한 현상을 이미 경험하고 있는 환경 뿐만 아니라 특정 유해한 현상을 경험하기 쉬운 환경 또는 특정 유해한 현상이 방지되어야 하는 환경을 포함한다. 특정 유해한 현상은 본 발명에 따라 지중해로부터 수집된 효율적인 양의 해수를 받은 후, 환경이 상기 특정 유해한 현상과 관련된 하나 이상의 파라미터; 환경의 더 우수한 품질에서 또는 부재하에 관찰 가능한 및/또는 측정 가능한 감소를 나타내는 경우, 성공적으로 "제어"된다. 환경에서 성공적인 제어 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 당업자에게 친숙한 일상적인 절차에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 특정 유해한 현상은 대형조류 대발생, 특히 울바 락투카 대발생이다.
- "방지하는"은 특정 유해한 현상의 적어도 하나의 파라미터가 발생하지 않도록 하고/하거나 발생 가능성을 낮추는 것을 지칭한다.
- "살아있는 미생물"은 적절한 조건 내에서 분열을 수행할 수 있는 미생물, 예를 들어, 원생동물, 박테리아, 또는 바이러스를 지칭한다. 하나의 구현예에서, 살아있는 미생물은 바이러스이다.
- "사망을 촉진하는"은 표적을 사멸시키는 능력을 지칭한다. 확장하여, "조류의 사망을 촉진하는"은 조류의 사멸 또는 분해를 지칭하는 것으로 의도된다. 실제로, 죽은 조류는 더 이상 녹조를 성장, 확산 및 촉진할 수 없다. 하나의 구현예에서, 조류의 사망은 조류 조직의 백화 또는 표백이 선행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "울바 조류" 및 "울바 속 조류"라는 표현은 동일한 주제를 지칭하는 것을 의미하며, 서로 대체할 수 있다.
상세한 설명
본 발명자들은 황해 또는 브르타뉴(Brittany)에서 관찰된 것과 같이, 주요 울바 락투카 대발생이 지중해에서는 일어나지 않음을 관찰하였다. 그러나, 울바 락투카의 존재, 현저한 조수의 부족(물 정체), 및 풍부한 질소 및 인 공급원의 존재를 고려하면, 지중해에서 울바 락투카 대발생이 예상되어야 한다. 본 발명자들은 놀랍게도, 브르타뉴에서 울바 락투카 대발생을 제어하는 것은 지중해의 하나 이상의 선택된 지점으로부터의 해수를 사용함으로써 실현 가능할 수 있음을 보여준다. 보다 정확하게는, 본 발명자들은 해수가 울바 락투카의 사망을 촉진하고 따라서 울바 락투카 대발생의 제어를 촉진하는 미생물을 포함하고, 이 미생물이 바이러스임을 보여주는 실험 데이터를 본원에 제공한다.
본 발명의 한 측면은 지중해에서 수집된 해수와 상기 해양 환경을 접촉시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한, 지중해로부터 수집된 해수의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 지중해로부터 수집된 해수와 상기 해양 환경을 접촉시키는 단계를 포함하는, 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한, 지중해로부터 수집된 해수의 용도에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 울바 속 조류는 울바 아칸토포라(Ulva acanthophora), 울바 아난디이(Ulva anandii ), 울바 아라사키이(Ulva arasakii), 울바 아르모리카나(Ulva armoricana), 울바 아트로비리디스(Ulva atroviridis), 울바 베이텐시스(Ulva beytensis), 울바 비프론스(Ulva bifrons), 울바 브레비스티피타(Ulva brevistipita), 울바 부르마니카(Ulva burmanica), 울바 칼리포르니카(Ulva californica), 울바 체토모르포이데스(Ulva chaetomorphoides), 울바 클라트레이트(Ulva clathrate), 울바 콤프레사(Ulva compressa), 울바 콩글로바타(Ulva conglobata), 울바 코르누타(Ulva cornuta), 울바 코벨롱겐시스(Ulva covelongensis), 울바 크라사(Ulva crassa), 울바 크라시멤브라나(Ulva crassimembrana), 울바 쿠르바타(Ulva curvata), 울바 덴티쿨레이트(Ulva denticulate), 울바 디아파나(Ulva diaphana), 울바 엘레강스(Ulva elegans), 울바 엔테로모르파(Ulva enteromorpha), 울바 에렉타(Ulva erecta), 울바 엑스판사(Ulva expansa), 울바 파시아타(Ulva fasciata), 울바 플렉수오사(Ulva flexuosa), 울바 게미노이데아(Ulva geminoidea), 울바 기간테아(Ulva gigantea), 울바 그란디스(Ulva grandis), 울바 훅케리아나(Ulva hookeriana), 울바 홉키르키이(Ulva hopkirkii), 울바 하벤시스(Ulva howensis), 울바 인디카(Ulva indica), 울바 인테스티날리스(Ulva intestinalis), 울바 인테스티날로이데스(Ulva intestinaloides), 울바 자바니카(Ulva javanica), 울바 킬리니이(Ulva kylinii), 울바 락투카(Ulva lactuca), 울바 래테비렌스(Ulva laetevirens), 울바 라인기이(Ulva laingii), 울바 리니어리스(Ulva linearis), 울바 린자(Ulva linza), 울바 립피이(Ulva lippii), 울바 리토랄리스(Ulva litoralis), 울바 리토레아(Ulva littorea), 울바 로베이트(Ulva lobate), 울바 마르기나타(Ulva marginata), 울바 마이크로코카(Ulva micrococca), 울바 무타빌리스(Ulva mutabilis), 울바 네아폴리타나(Ulva neapolitana), 울바 네마토이데아(Ulva nematoidea), 울바 오노이(Ulva ohnoi), 울바 올리바신스(Ulva olivascens), 울바 파시피카(Ulva pacifica), 울바 파펜푸시이(Ulva papenfussii), 울바 파르바(Ulva parva), 울바 파스치마(Ulva paschima), 울바 파텐겐시스(Ulva patengensis), 울바 페르쿠르사(Ulva percursa), 울바 페르투사(Ulva pertusa), 울바 필로사(Ulva phyllosa), 울바 폴리클라다(Ulva polyclada), 울바 포펜귀넨시스(Ulva popenguinensis), 울바 포리폴리아(Ulva porrifolia), 울바 프로세라(Ulva procera), 울바 프로푼다(Ulva profunda), 울바 프롤리페라(Ulva prolifera), 울바 슈도쿠르바타(Ulva pseudocurvata), 울바 슈돌린자(Ulva pseudolinza), 울바 풀치라(Ulva pulchra), 울바 퀼로넨시스(Ulva quilonensis), 울바 라디아타(Ulva radiata), 울바 랄프시이(Ulva ralfsii), 울바 라눈쿨라타(Ulva ranunculata), 울바 레티쿨라타(Ulva reticulata), 울바 라코데스(Ulva rhacodes), 울바 리기다(Ulva rigida), 울바 로툰다타(Ulva rotundata), 울바 사이풀라히이(Ulva saifullahii), 울바 스칸디나비카(Ulva scandinavica), 울바 세라타(Ulva serrata), 울바 심플렉스(Ulva simplex), 울바 소렌세니이(Ulva sorensenii), 울바 스피눌로사(Ulva spinulosa), 울바 스테노필라(Ulva stenophylla), 울바 서브리토랄리스(Ulva sublittoralis), 울바 서불라타(Ulva subulata), 울바 태니아타(Ulva taeniata), 울바 탄네리(Ulva tanneri), 울바 테네라(Ulva tenera), 울바 토르타(Ulva torta), 울바 투베로사(Ulva tuberosa), 울바 운시알리스(Ulva uncialis), 울바 운시네이트(Ulva uncinate), 울바 운시네이트(Ulva uncinate), 울바 우스네오이데스(Ulva usneoides), 울바 우트리쿨라리스(Ulva utricularis), 울바 우트리쿨로사(Ulva utriculosa), 울바 우보이데스(Ulva uvoides) 및 울바 벤트리코사(Ulva ventricosa) 종의 조류를 포함하는 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, 울바 속의 조류는 울바 아르모리카나 및 울바 락투카 종의 조류를 포함하는 그룹에서 선택된다. 하나의 구현예에서, 울바 속의 조류는 울바 락투카 종의 조류이다.
본 발명의 범위 내에서, 울바 락투카 종의 조류는 또한 엔테로모르파 조류를 지칭할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, "이를 필요로 하는 해양 환경"은 울바 대발생을 경험하고 있거나 경험하기 쉬운 해수 생태계를 지칭한다.
일부 구현예에서, 해양 환경은 해수, 특히 심해, 해안, 하구 등으로 제한될 수 있다.
실제로, 해양 환경이 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지할 필요가 있는지를 평가하는 것은 평균 해수 염분, 평균 해수 표면 온도, 및 상기 환경에서의 울바의 평균 농도를 포함하여 하나 이상의 다음 파라미터를 측정함으로써 수행될 수 있다.
예시적으로, 평균 해수 염분, 즉 해수 1kg당 염의 농도(g)의 측정은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 해수 염분을 측정하기에 적합한 방법의 비제한적인 예는 전기 전도도(EC)의 측정, 총 용해 고체(TDS)의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지할 필요가 있는 해양 환경은 해수 1kg당 약 30g 내지 약 40g의 염으로 이루어진 평균 염분을 가질 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "해수 1kg당 약 30g 내지 약 40g의 염"이라는 표현은 해수 1kg당 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 및 40g의 염을 포함한다.
예시적으로, 평균 해수 표면 온도의 측정은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 평균 해수 표면 온도를 측정하기에 적합한 방법의 비제한적인 예는 위성 마이크로파 방사계, 적외선(IR) 방사계, 현장 부표를 포함한다. 일부 구현예에서, 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지할 필요가 있는 해양 환경은 약 12℃ 내지 약 25℃, 바람직하게는 약 14℃ 내지 약 20℃로 구성된 평균 표면 온도를 가질 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "약 12℃ 내지 약 25℃"라는 표현은 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃ 및 25℃를 포함한다.
예시적으로, 울바 속 조류의 평균 농도의 측정은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 실제로, 해수 중 조류의 바이오매스는 충분히 확립된 방법 중 어느 하나, 예를 들어, 문헌(참조: Hambrook Berkman, J.A. and Canova, M.G. (2007, Algal biomass indicators (ver. 1.0): U.S. Geological Survey Techniques of Water-Resources Investigations, book 9, chap. A7, section 7.4)에 개시된 방법에 의해 평가될 수 있다. 조류의 바이오매스를 측정하기에 적합한 방법의 비제한적인 예는 회분 비함유 건조 질량으로서 탄소 바이오매스의 측정, 미립자 유기 탄소(POC)의 측정, 또는 해수 샘플 중의 엽록소 a의 정량화를 포함한다.
일부 구현예에서, 울바 녹조류 대발생은 특히 해안선, 특히 바위 또는 해변에서 좌초되기 전에 해수에서 제어될 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 울바 녹조류 대발생은 바다와 직접 접촉하는 임의의 육지 또는 지표 지표면, 예를 들어, 바위, 해변을 포함하는 해안선에서 제어될 수 있다.
실제로, 본 발명에 따른 해수는 해안선 상에 있는 울바 속의 조류와 접촉될 수 있다. 일부 구현예에서, 울바 조류는 그의 자연적인 생분해 전에 사멸된다. 실제로, 상당량의 독성 산성 증기, 특히 H2S 증기가 방출될 때 자연적인 생분해가 시작된다. 예시적으로, 일단 죽으면, 녹조류는 최종 파괴 전에 안전하게 제거 및/또는 저장될 수 있다.
특정 구현예에서, 해수는 울바 속의 조류의 사망을 촉진한다. 일부 구현예에서, 울바 속의 조류의 사망은 산 증기의 방출 없이, 특히 H2S 증기의 방출 없이 달성된다.
일부 구현예에서, 상기 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집된다.
하나의 구현예에서, 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집된다.
하나의 구현예에서, 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 해수는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 해수는 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 해수는 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E에서 수집된다. 하나의 구현예에서, 해수는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집된다.
실제로, 해수는 표면에서 최대 30m 깊이까지 수집될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "최대 30m"라는 표현은 1cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 30cm, 40cm, 50cm, 60cm, 70cm, 80cm, 90cm, 1m, 1.5m, 2m, 2.5m, 3m, 3.5m, 4m, 4.5m, 5m, 5.5m, 6m, 6.5m, 7m, 7.5m, 8m, 9m, 10m, 11m, 12m, 13m, 14m, 15m, 16m, 17m, 18m, 19m, 20m, 21m, 22m, 23m, 24m, 25m, 26m, 27m, 28m, 29m 및 30m를 포함한다.
특정 구현예에서, 해수는 약 10cm 내지 약 10m, 바람직하게는 약 50cm 내지 약 2m로 이루어진 깊이에서 수집된다.
일부 구현예에서, 해수는 봄철, 특히 3월 20일부터 6월 21일까지, 보다 구체적으로 5월 20일부터 6월 20일까지 수집된다.
일부 구현예에서, 수집된 해수 샘플은 약 4℃ 내지 약 30℃, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 20℃, 보다 바람직하게는 약 20℃의 온도에서 보존된다. 본 발명의 범위 내에서, "약 4℃ 내지 약 30℃"라는 표현은 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 및 30℃를 포함한다.
실제로, 울바 속 조류의 사망을 촉진하기 위해 사용하기 전에, 수집된 해수 샘플은 최대 50일, 바람직하게는 최대 30일, 더 바람직하게는 최대 10일 동안 보존될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 "최대 50일"이라는 표현은 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 및 1일을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 해수는 울바 속 조류의 사망을 촉진할 수 있는 살아있는 미생물을 포함한다.
일부 구현예에서, 울바 속 조류의 사망은 조류의 녹색 조직을 백색 조직으로 탈색함으로써 평가될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 조류의 녹색 조직의 백색 조직으로의 탈색은 또한 조류의 녹색 조직의 "표백"으로 지칭될 수 있다. 실제로, 죽은 (괴사성) 백색 조직의 관찰은 시각적으로 평가될 수 있거나 광학 현미경 검사에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 백색 조직은 본 발명에 따른 해수와 울바 조류와 접촉시킨 후 약 1일 내지 약 15일 동안, 바람직하게는 낮에 및/또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 관찰될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "약 1일 내지 약 15일"이라는 표현은 1일, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15일을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 20℃ 내지 약 30℃"라는 표현은 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 및 30℃를 포함한다.
실제로, 상기 살아있는 미생물은 원생동물, 박테리아 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 미생물은 농축, 단리 및/또는 특성화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 미생물은 본 발명에 따른 해수로부터 정제될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "정제된"은 본 발명에 따른 해수의 다른 살아있는 유기체로부터 활성 성분으로서 본 발명에 따른 미생물의 단리를 허용하는 단계를 지칭한다. 다른 살아있는 유기체는 조류, 식물성 플랑크톤 등을 포함할 수 있다.
미생물의 농축, 단리 및 특성화는 최신 기술의 임의의 적합한 기술에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 미생물은, 예를 들어, 막 필터, 자이츠 필터, 소결 유리 필터 및/또는 양초 필터를 사용하여 수집된 해수 샘플로부터 여과될 수 있다. 실제로, 필터는 약 0.01㎛ 내지 약 10㎛ 범위의 기공 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 "약 0.01㎛ 내지 약 10㎛"라는 표현은 0.01㎛, 0.02㎛, 0.03㎛, 0.04㎛, 0.05㎛, 0.06㎛, 0.07㎛, 0.08㎛, 0.09㎛, 0.1㎛, 0.2㎛, 0.3㎛, 0.4㎛, 0.5㎛, 0.6㎛, 0.7㎛, 0.8㎛, 0.9㎛, 1㎛, 2㎛, 3㎛, 4㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛ 및 10㎛를 포함한다.
일부 구현예에서, 아메바는 약 1㎛ 내지 약 10㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 필터를 사용하여 여과될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아는 약 0.05㎛ 내지 약 10㎛, 바람직하게는 약 0.1㎛ 내지 약 8㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 필터를 사용하여 여과될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 약 0.01㎛ 내지 약 1.5㎛, 바람직하게는 약 0.1㎛ 내지 약 1㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 필터를 사용하여 여과될 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물은 임의로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전 후에 차등 원심분리에 의해 원심분리될 수 있다. 문헌(참조: Lawrence and Steward(Purification of viruses by centrifugation. 2010; Manual of aquatic viral ecology; Chapter 17, 166-181)에 의해 개시된 프로토콜을 참조할 수 있다.
미생물의 특성화는 최신 기술로부터 공지된 임의의 적합한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예시적으로, 미생물의 전체 게놈의 차세대 서열분석(NGS)은 미생물로부터 핵산을 추출한 후에 수행될 수 있다. 실제로, 바이러스 핵산은, 예를 들어, QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트(QIAGEN®) 또는 Pure Link® 바이러스 RNA/DNA 미니 키트(Invitrogen®)를 사용하여 추출될 수 있다. 게놈 박테리아 핵산은, 예를 들어, Illustra 박테리아 게놈 Prep 미니 스핀 키트(GE Health Life Sciences®) 또는 NEBNext® 마이크로바이옴 DNA 농축 키트(New England Biolabs®)를 사용하여 추출될 수 있다.
하나의 구현예에서, 살아있는 미생물은 원생동물, 특히 아메바이다.
본원에 사용된 용어 "원생동물"은 방산충, 태양충, 아칸타리아와 같은 방산충(actinopods); 모노탈라메, 폴리프탈라메와 같은 유공충(foraminifera); 아메바, 예를 들어, 짐나모에비안, 테카모에비안을 포함하는 해양 원생동물을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, "해양 원생동물"이라는 표현은 해양 아메바를 포함한다.
해양 아메바의 비제한적인 예는 클리도넬라 속(genus Clydonella); 링굴아메바 속(genus Lingulamoeba), 예를 들어, 엘. 레에이(L. leei); 마요렐라 속(genus Mayorella), 예를 들어, 엠. 겜미페라(M. gemmifera); 네오파르아메바 속(genus Neoparamoeba), 예를 들어, 엔. 브란치필라(N. branchiphila); 반넬라 속(genus Vannella), 예를 들어, 브이. 아베르도니카(V. aberdonica), 브이. 미로이데스(V. miroides); 베르미스텔라 속(genus Vermistella), 예를 들어, 브이. 안타르스티카(V. Antarctica); 벡실리페라 속(genus Vexillifera), 예를 들어, 브이. 미누티시마(V. minutissima), 브이. 타스마니아나(V. tasmaniana)의 아메바를 포함한다.
하나의 구현예에서, 살아있는 미생물은 박테리아, 특히 해양 박테리아이다. 해양 박테리아의 비제한적인 예는 바실러스 속(genus Bacillus), 예를 들어, 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 투린지엔시스(B. thuringiensis); 플라보박테리움 속(genus Flavobacterium), 예를 들어, 포르모사 아가리필라(Formosa agariphila); 할로모나스 속(genus Halomonas), 예를 들어, 에이치. 프로푼두스(H. profundus), 에이치. 하이드로테르말리스(H. hydrothermalis); 슈도모나스 속(genus Pseudomonas), 예를 들어, 피. 게젠네이(P. guezennei); 사카로파구스 속(genus Saccharophagus), 예를 들어, 에스. 데그라단스(S. degradans); 비브리오 속(genus Vibrio), 예를 들어, 브이. 아주레우스(V. azureus), 브이. 프로테올리티쿠스(V. proteolyticus)의 박테리아를 포함한다.
하나의 구현예에서, 살아있는 미생물은 바이러스이다. 특정 구현예에서, 바이러스는 미미바이러스과(family of Mimiviridae)에 속한다. 일부 구현예에서, 미미바이러스과에 속하는 바이러스는 카페테리아바이러스 속(genus Cafeteriavirus), 클로스노이바이러스 속(genus Klosneuvirus), 미미바이러스 속(genus Mimivirus), 투판바이러스 속(genus Tupanvirus) 등이다. 일부 구현예에서, 미생물은 바이러스이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따라 지중해로부터 수집된 해수로부터의 바이러스는 약 0.2㎛의 기공 크기의 필터를 통해 여과된다. 즉, 바이러스는 약 0.2㎛의 기공 크기의 필터를 통해 통과하며, 이는 상기 필터에 의해 보유되지 않는 것으로 이해된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따라 지중해로부터 수집된 해수에서 바이러스의 존재는 방향족 화합물, 특히 SYBR 골드 염료(N',N'-디메틸-N-[4-[(E)-(3-메틸-1,3-벤조티아졸-2-일리덴)메틸]-1-페닐퀴놀린-1-이움-2-일]-N-프로필프로판-1,3-디아민)으로 유리하게 염색된다. SYBR 골드 염료는 DNA에 우선적으로 결합한다. 이 염료는 바이러스학에서 널리 사용되어 해수 및 기타 수생 샘플에 존재하는 바이러스 유사 입자(VLP)를 염색하고 시각화한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따라 지중해로부터 수집된 해수 중의 바이러스의 양은 약 105 내지 약 109PFU/ml, 특히 약 106 내지 약 108PFU/ml의 범위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약 105 내지 약 109PFU/ml"라는 표현은 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108 및 109PFU/ml를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, PFU는 "플라크 형성 단위(Plaque Forming Unit)"를 나타내며, 세포 단층에서 플라크를 형성할 수 있는 바이러스 입자의 수를 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은 지중해에서 수집된 해수로부터 유래되는 하나 이상의 살아있는 미생물(들)을 상기 해양 환경과 접촉시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 또한 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한, 지중해에서 수집된 해수로부터 유래되는 하나 이상의 살아있는 미생물(들)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한, 지중해에서 수집된 해수로부터 유래되는 하나 이상의 살아있는 미생물(들)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한 방법에서 지중해에서 수집된 해수로부터 유래되는 하나 이상의 살아있는 미생물(들)의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 추가로 해양 환경에서 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한 방법에서 지중해에서 수집된 해수로부터 유래되는 하나 이상의 살아있는 미생물(들)의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 울바 속 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한 바이러스의 유효 용량은 처리되는 해양 환경의 약 1×101 내지 약 1×1012PFU/m2의 범위이다. 특정 구현예에서, 유효 용량은 치료되는 해양 환경의 약 1×102 내지 1×108, 바람직하게는 약 1×102 내지 약 1×108PFU/m2의 범위이다.
본 발명의 범위 내에서, "처리되는 해양 환경의 약 1x101 내지 약 1x1012PFU/m2"라는 용어는 처리되는 해양 환경의 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 및 1x1012PFU/m2를 포함한다.
도 1a-1c는 엔테로모르파(Enteromorpha) 조류의 사진이다. 도 1a: 브르타뉴의 북쪽 해안(48°46'N, 3°06'W)의 트리외 피요르드(TR)에서 대발생 후, 2018년 11월에 수집된 이전에는 엔테로모르파로 칭명되는 녹색 관상 조류. 도 1b: 관형은 20℃ 및 일광 노출에서 1개월 동안 마르세유 만(43°18'N 5°16'E 또는 도 2의 스팟 X(RS))에서 2018년 6월에 수집된 해수와 배양 후 사라진다. 도 1c: "엔테로모르파"는 20℃ 및 일광 노출에서 3개월 후 전형적인 울바 락투카가 되었다.
도 2는 마르세유 만 해수의 독특한 샘플을 사용한 시험관내 브리튼 울바 락투카 증식의 통계 분석을 보여주는 도식이다. 2018년 6월에 마르세유 만의 3개의 다른 지점에서 수집된 해수 샘플. X(RN)는 43°18'N, 5°16'E였고; Y(RS)는 43°15'N, 5°19'E였고, Z(PR)는 43°14'N, 5°21'E였다. 해수 샘플은 3개의 튜브 그룹으로 나누어졌다(n=36). 2018년 6월에 브레헥(브르타뉴의 북쪽 해안 48°43'N 2°06'W)에서 수집된 브리튼 울바 락투카는 1cm2 조각으로 절단하고, 샘플링 하루 전(D1)에 수집된 마르세이 만의 지점 X, Y 및 Z에 상응하는 세 그룹의 튜브에 넣었다. 울바 락투카 증식은 무산소증을 유발하기 위해 테이프로 밀봉된 50ml 튜브 내의 해수로 25℃에서 수행되었다. 증식은 외해에 상응하는 X 지점에서 25개 튜브/36개(69%)에서 관찰된 반면, Y 지점에서는 14개 튜브/36(39%), 해안에서 가장 가까운 Z 지점에서는 1개 튜브/36(2.7%)에서만 관찰되었다(삽입된 그래프 참조). 울바 락투카가 증식할 수 있는 튜브에서 1주일 후에 합류점에 도달했고, 산도가 검출되었다. 울바 락투카가 성장하지 못한 튜브에서 산도가 관찰되지 않았고, 울바 락투카는 5일 후에 백색이 되었다. Z 지점의 해수는 브리튼 울바 락투카로 다시 배양되기 전에 D30에서 D180까지 보관되었고, 증식은 D30의 경우 12개 튜브/36(33%), D180의 경우 36개 튜브/36(100%)에서 관찰되었다(삽입된 그래프 참조).
도 3a-3d는 세 가지 다른 상태에서 울바 락투카의 광학 현미경 검사와의 비교를 보여주는 사진이다. 도 3a: 울바 락투카는 20℃ 및 일광 노출에서 마르세유 만의 Z 지점으로부터의 해수와 배양할 때 5일 만에 백색이 되었다. 도 3b: 백색 울바 락투카의 광학 현미경 검사(10X). 울바 락투카 조직은 울바 세포의 규칙적인 조직에 향을 받지 않고 잔류한다. 도 3c: 건강한 울바 락투카의 광학 현미경 검사(10X). 도 3d: 산성 생분해 후 울바 락투카의 광학 현미경(10X). 울바 락투카 조직은 무산소증에도 불구하고 녹색으로 잔류하는 엽록소의 방출로 파괴된다. Nikon Eclipse Ti L100 현미경(Nikon, 일본 도쿄)에 연결된 카메라 Nikon D3100으로 촬영했다.
도 4a-4d는 SYBR 염색 후 형광 현미경 검사를 보여주는 사진과 그래프이다. 도 4a-c: 표백을 유발하는 지중해의 해수를 울바 없이(패널 A) 및 울바와 함께(패널 B 및 C) 배양했다. 도 4d: 입자 수/ml로 표시되는 바이러스-유사 입자의 양을 도시한다. 해수는 0.2㎛로 여과하였다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 : 울바 락투카의 사망을 촉진하는 해수 샘플의 확인
1) 재료 및 방법
a) 울바 락투카 다형성
녹조류는 브르타뉴의 북쪽 해안(48°46'N, 3°06'W)의 트리외 피요르드에서 수집되었다. 증식은 마르세유 만(프랑스 남부 프로방스)으로부터의 해수 샘플을 사용하여 시험관내에서 수행되었다. 브르타뉴 북쪽 해안(48°46'N, 3°06'W)의 트리외 피요르드에서에서 대발생 후 2018년 11월에 이전에 엔테로모르파라고 칭명되는 녹색 관상 조류가 수집되었다. 배양은 20℃ 및 일광 노출에서 마르세유의 북쪽 만(43°18'N, 5°16'E; RN)에서 2018년 6월에 수집된 해수로 한 달 동안 수행되었다.
b) 울바 락투카 증식
해수 샘플은 마르세유의 3개의 다른 지점(도 2), 프로방스의 2개의 지점, 브르타뉴의 3개의 지점(표 1 참조)을 포함하는 8개의 상이한 지점에서 봄철(2018년, 2019년, 2020년 6월) 지표에서 수집했다. 해수 샘플은 3개 그룹의 튜브로 나누어졌다(n=36). 2018년 6월에 브레헥(브르타뉴의 북쪽 해안 48°43'N 2°6'O)에서 수집된 브리튼 울바 락투카는 1cm2 조각으로 절단하고, 샘플링 하루 전(D1)에 수집된 마르세유 만의 지점 X, Y 및 Z에 상응하는 세 그룹의 팔콘 튜브(50ml)에 넣었다. 산도는 크리슨 pH 미터(바르셀로나, 카탈로니아)로 시험하였다. pH 미터는 임의의 측정 전에 교정되었다. 질산염은 용출제로서 3.2mM Na2CO3/1mM NaHCO3를 사용하여 Metrosep 컬럼 A supp 5 150/4mm가 장착된 METRHOM 크로마토 이온 장치(스위스, 베른)로 측정하였다. 해수를 1/8로 희석하고 표준을 사용하여 질산염의 양을 교정하였다.
c) 광학 현미경 검사
광학 현미경 검사(10X)는 합류점 전, 산성 생분해 후 건강한 울바 락투카 및 5일 후 백색 울바 락투카에서 마르세유 만의 Z(PR) 지점에서 수집된 물 샘플을 사용하여 수행되었다. 촬영은 Nikon Eclipse Ti L100 현미경(Nikon, 일본 도쿄)에 연결된 카메라 Nikon D3100을 사용하여 수행되었다.
d) 다이오드 어레이 검출 고성능 액체 크로마토그래피(DAD HPLC )
해수 샘플을 0.2㎛로 여과하고, H2O 0.1% TFA(A) 및 CH3CN 0.1% TFA(B)를 사용하여 역상(C8) 컬럼이 장착된 Beckman HPLC 시스템 골드 장치로 분석하였다. 구배는 40분에서 10% 내지 50% B였고, 90% B에서 10분, 10% B에서 10분이었다. 다이오드 어레이 검출기 Beckman 장치는 인젝터(injector) 뒤에 결합시켰다. 유속은 0.8ml/분이었다.
e) SYBR 염색 후 형광 현미경 검사
울바 락투카 샘플을 포함하거나 포함하지 않는 지중해 해수를 0.22㎛ 막 필터(Millex®; 카탈로그 번호 SLGP033RS)를 통해 여과하여 세포를 제거한 다음, 진공 여과 시스템을 사용하여 0.02㎛ 양극 필터(Whitman®; 카탈로그 번호 WHA68096002)를 통해 여과하여 바이러스 입자를 수집했다.
그런 다음, 필터를 어둠에서 15분 동안 실온에서 DNA(Invitrogen®; 카탈로그 번호 S11494)에 소중하게 결합하는 SYBR 골드 염료(N',N'-디메틸-N-[4-[(E)-(3-메틸-1,3-벤조티아졸-2-일리덴)메틸]-1-페닐퀴놀린-1-이움-2-일]-N-프로필프로판-1,3-디아민)로 염색하고, 500μL의 멸균 0.02㎛-여과된 mQ 물로 3회 세척했다. 염색된 바이러스-유사 입자는 표면형광 현미경 Leica SP2로 관찰되었다.
2) 결과
a) 브리튼 울바 락투카는 지중해에서 성장할 수 있으며 염분과 관련하여 다른 표현형을 갖는다
울바 락투카는 마르세유 만(프랑스 남부 프로방스)에 자연스럽게 서식하며 매년 겨울에 나타난다. 울바는 2월부터 3월까지 급속히 성장한 후 봄철에 급속히 사라진다. 브르타뉴에서 관찰된 바와 같이, 울바 락투카 대발생은 마르세유 만에서 보고되지 않았지만, 이 만은 인산염과 질소가 고농도이고 얕은 해변이 있다. 첫 번째 가설은 브리튼 울바 락투카가 브르타뉴에서는 쉽게 성장할 수 있지만 지중해에서는 성장할 수 없으며, 보다 특히 질산염 농도가 브르타뉴의 해수에 비해 낮다는 것일 수 있다. 마르세유 근처의 5개 지점이 선택되었고, 해수 샘플을 수집하였고, 브르타뉴의 3개 지점과 비교했다(표 1).
[표 1]
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*봄철에 수집된 해수 샘플을 이용한 시험관내 브리튼 울바 표백의 통계 분석. 모든 실험(n=8)은 2018년, 2019년 및 2020년에 브르타뉴 북부의 트리외 피요르드(TR)에서 수집된 브리튼 울바로 수행되었다. 울바를 1cm2의 조각으로 절단하고, 테이프로 밀봉된 튜브(n = 25) 중 해수(40ml)에 넣고 평균 온도 25℃에서 일광에 정치시켰다.
마르세유 만은 론 강의 하구에서 20km 거리에 있으며, 론 강에서 마르세유로 정기적으로 불어오는 북서풍(미스트랄 및 트라몬탄)이 지배적이다. 표 1은 pH 및 전도도 측정(주로 염분과 관련됨)이 아마도 론 강의 영향으로 인해 RN에서 낮다는 것을 보여준다. 표 1은 연안 해수에서 질산염의 농도가 브르타뉴(BR 및 PO) 및 프로방스(RN, WF, RS)에서 동등함을 보여준다. 그러나, 질산염 농도는 브르타뉴 피요르드(TR) 또는 프로방스의 칼랭크(MU)와 마리나(PR)에서 훨씬 높을 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 브리튼 울바 락투카는 마르세유의 해수에서 빠르게 성장할 수 있다(도 1). 울바 락투카의 다형성은 20℃ ± 10℃ 및 일광 노출(도 1c)에서 3개월 후에 전형적인 울바 락투카가 된 팽폴시(브르타뉴 북부) 근처의 트리외 피요르드에서 수집된 이전에 엔테로모르파라고 칭명된 녹색 관상 조류(도 1a)로 시험되었다. 이 실험은 이전에 기재된 바와 같이 울바 락투카의 다형성에서 염분의 중요성을 보여준다(참조: Rybak, Ecological Indicators, 2018, 85, 253-261).
b) 브리튼 울바 락투카 증식은 마르세유 만의 물 샘플링의 위치 및 시기가 다르다.
해변에서 자연적인 생분해는 울바 락투카가 H2S 생성을 특징으로 하는 무산소증을 유발하는 합류점에 도달할 때 발생한다. 이 생분해의 경우, 울바는 탈수로 인해 백색이 될 수 있다. 그러나, 이것은 본 발명자들이 마르세유에서 수집된 해수에서 브리튼 울바 락투카에서 관찰했던 다른 현상이다. 브리튼 울바 락투카는 탈수 없이 하루 만에 빠르게 백색으로 변했다(표백). 이 자연적인 과정을 시뮬레이션하기 위해, 울바 락투카의 증식은 무산소증을 유발하기 위해 테이프로 밀봉된 50ml 튜브에서 해수를 사용하여 수행되었다.
통계 분석은 마르세유 만을 포함한 브르타뉴의 3개의 다른 지점과 프로방스의 5개 지점에서 수집된 해수 샘플을 사용하여 수행되었다(표 1 및 도 2). 해수 샘플은 8개 그룹의 튜브로 나누어졌다(n=36). 브리튼 울바 락투카를 1cm2의 조각으로 절단하고, 샘플링 하루 전(D1)에 수집된 마르세유 만의 지점 X(RN), Y(RS) 및 Z(PR), 프로방스의 PR 및 MU, TR 및 BR(브르타뉴 북부) 및 PO(브르타뉴 남부)에 상응하는 8개 그룹의 튜브에 넣었다.
울바 증식이 가장 높은 봄철에 브르타뉴에서 수집된 해수로는 표백이 관찰되지 않았다. 프로방스의 5개의 다른 지점에 대해, 증식이 일어날 수 있는 튜브의 수는 동일하지 않았다. 증식은 외해에 상응하는 X 지점의 경우 25개 튜브/36개(69%), Y 지점의 경우 14개 튜브/36개, 해안에 가장 가까운 Z 지점의 경우 1개 튜브/36개에서만 관찰되었다. 도 3a에 제시된 바와 같이, 튜브에서 울바 락투카는 성장할 수 없었고, 울바 락투카는 산도가 검출되지 않고 5일 내에 20℃에서 일광하에 백색이 되었다. 이 울바 락투카 백색 표현형은 울부 락투카가 썰물 때 해안에 머물렀을 때 브르타뉴에서 관찰된 백색 탈수된 울버 락투카와는 유사하지 않았다. 울바 락투카가 증식할 수 있는 튜브의 경우, 1주일 후에 합류점에 도달하였고, 울바 락투카 생분해의 정규 과정에 따라 산도가 관찰되었다(참조: Dominguez and Loret, Mar Drugs. 2019 Jun 14;17(6). Pii: E357). 자연 조건에서 관찰된 바와 같이, 울바 락투카는 생분해하에 녹색으로 잔류했다. Z 지점으로부터의 해수(도 2)는 브리튼 울바 락투카에 의해 다시 배양되기 전에 D30에서 D180까지 유지되었고, 증식은 D30의 경우 12개의 튜브/36개, D180의 경우 36개의 튜브/36개에서 관찰되었다(도 2). 브리튼 울바 락투카 세포의 사망을 촉진하는 활성 성분은 D1에서 D180까지 동일한 효과를 생성했을 오염 물질이 아니다. 다른 브리튼 조류(주로 갈색)는 마르세유 만의 해수의 영향을 받지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
c) 3가지 다른 상태의 울바 락투카의 광학 현미경 검사와의 비교는 조직이 백색 울바 락투카로 파괴되지 않음을 보여준다
백색 울바 락투카를 보여주는 도 3a에서 일어나는 것은 광학 현미경 검사를 사용하여 조직 수준에서 연구되었다. 도 3b는 울바 락투카의 백색 조직이 세포에 녹색을 제공하는 세포질에 존재하는 엽록소를 갖는 단단한 세포로 구성된 엽상체를 갖는(도 3c) 건강한 울바 락투카에 필적하는 울바 락투카 세포의 규칙적인 조직에 영향을 받지 않은 채로 잔류한다는 것을 보여준다. 도 3b의 백색 색상은 세포가 사망했음을 나타내지만, 이 사망은 도 3c에 도시된 바와 같은 조류 조직의 조직 조직을 파괴할 수 있는 거대 포식자 또는 환경 조건으로 인한 것은 아니다. 이것은 백색 색상을 제공할 수 있는 포자 형성이 아니다. 이러한 예비 실험에서 나온 주요 설명은 울바 락투카 특유의 미생물이 지중해에서 울바 락투카 대발상을 제어한다는 것이다. 미생물의 공격, 특히 바이러스 공격만이 조직 손상 없이 울바 락투카 세포의 이 급속한 사망을 설명할 수 있었다. 또한, 이 가설이 확인되었다. 실제로, 해수가 0.2㎛에서 여과될 때, 울바 락투카는 여전히 백색으로 변할 수 있고, 표백 활성이 0.2㎛ 이상의 크기를 갖는 플랑크톤, 아메바 또는 박테리아에 기인하지 않음을 보여준다.
d) 고성능 액체 크로마토그래피에 결합된 다이오드 어레이(diode array) 검출(DAD HPLC )
표백을 유발하는 지중해 해수를 0.2㎛로 여과한 다음, 아세토니트릴 구배가 있는 소수성 C8 컬럼으로부터 상이한 시간에 용출되는 각 본체의 UV 스펙트럼 분석을 가능하게 하는 DAD HPLC로 분석했다. 5 내지 45분 사이에 용출되는 피크의 대부분은 243nm에서 최대 흡수를 나타내는 UV 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하며 콜로이드로 불리는 유기 거대분자에 상응한다. DAD HPLC 실행의 3D 관점은 콜로이드가 0.2㎛에서 여과된 해수의 주요 성분임을 보여준다. 세 개의 피크는 상이한 UV 스펙트럼 시그니처를 갖는다. 3.5분에 빨간색 화살표로 표시된 피크는 바이러스 입자의 존재에 상응할 수 있으며, 핵산 및 방향족 아미노산으로 인해 266nm에서 첫 번째 최대 흡광도를 특징으로 한다. 2개의 다른 피크는 각각 260 및 280nm에서 최대 흡광도를 특징으로 하는 6분의 유리 핵산 및 45분의 유리 단백질에 상응한다. 브리튼 울바 락투카를 지중해 해수에 5일 동안 첨가할 때 및 표백이 발생할 때, 바이러스에 상응하는 피크는 266nm에서 7 내지 32mAU 범위의 최대 흡광도로 크게 증가한다. 흥미롭게도, 바이러스 입자와 호환성인 이 피크는 78% 증가하는 반면, 콜로이드 피크는 감소한다(아마도 울바 섭취로 인해).
e) 바이러스-유사 입자 염색 및 형광 현미경 검사
울바 락투카를 포함하지 않거나 포함하는 지중해의 해수를 0.2㎛로 여과한 다음, DNA에 우선적으로 결합하는 SYBR 골드 염료(N',N'-디메틸-N-[4-[(E)-(3-메틸-1,3-벤조티아졸-2-일리덴)메틸]-1-페닐퀴놀린-1-이움-2-일]-N-프로필프로판-1,3-디아민의 경우)으로 칭명되는 방향족 화합물로 염색했다. 이 염료는 바이러스학에서 널리 사용되어 해수 및 기타 수생 샘플에 존재하는 바이러스 유사 입자(VLP)를 염색하고 시각화한다. 이 방법론을 사용하여 생물학적 샘플에서 바이러스를 계수하고 검출하기 위한 수백 개의 공개된 보고서가 있다(참조: Shibata et al., Aquat Microb Ecol. 2006, 43, 223-231). 도 4a-c는 SYBR 염색 후 형광 현미경 검사가 울바 락투카를 해수에 첨가했을 때 높은 바이러스 생산을 나타냄을 보여준다. 이 높은 바이러스 생산은 울바 락투카가 여전히 녹색일 때 이미 중요하다. 그러나, 울바 락투카가 백색으로 되면 바이러스 풍부도는 6.5×108 바이러스/ml에 도달하고, 이는 비정형적 바이러스 고농도이다(도 4d). 이 실험은 바이러스가 활발하게 생성되고, 울바 락투카가 표백되면 더 높은 비율로 방출됨을 시사한다.
3) 토론
전세계 해수와 지중해의 평균 질산염 농도는 약 1μM이다. 질산염 농도가 마르세유에서 울바 락투카 증식 부재의 이유인 경우, 특히 봄철에 서유럽에서 녹조가 가장 중요한 브르타뉴 북부 해안에서 최대 100μM의 질산염 농도를 예상할 수 있었지만, 강 또는 피요르드에서는 그렇지 않았다(표 1). 질산염 농도는 계절에 따라 다양하다. 브르타뉴 북부 해안에는 로스코프 해양 정류장에서 평균 5μM이 있었는데, 2018년 및 2019년 겨울에는 거의 10μM, 여름에는 1μM이었다(참조: Service d'Observation en Milieu Littoral (SOMLIT), INSU-CNRS, Roscoff and Marseille" http://somlit-db.epoc.u-bordeaux1.fr/bdd.php). pH 및 전도도 측정과 같은 다른 매개변수도 로스코프의 계절에 따라 다양하다(참조: http://somlit-db.epoc.u-bordeaux1.fr/bdd.php). 브리튼 북부 해안의 BR에서의 데이터(표 1)는 로스코프에서 관찰된 질산염 농도의 범위 내이며, 계절에 관한 동일한 변동성이 마르세유에서 관찰된다(http://somlit-db.epoc.u-bordeaux1.fr/bdd.php). 계절에 대한 이러한 변동성은 스페인 서부의 갈리시아에서도 관찰되었다(Villares et al., Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 1999, 15, 337-341). 울바 녹조의 기원이 반드시 브르타뉴 해안에서 온 것은 아님을 지적하는 것도 중요하다. 울바 증식은 북대서양 중부에서 관찰되며, 울바는 북대서양의 지배적인 서풍으로 인해 브르타뉴로 표류한다. 엽록소 이상은 북대서양에서 점점 더 자주 발생하는 것으로 보이며, 녹조의 주요 원인은 주로 지구 온난화로 인한 것일 수 있다. 질산염 농도의 지속적인 조사는 목적이 동일한 분석 방법과 비교하고, 질산염 농도가 브리튼 북부 해안에 비해 마르세유에서 훨씬 낮을 수 있는 봄철에만 울바 증식의 부재를 설명하기 위한 것이기 때문에 수행되지 않았다. 이것은 사실이 아닌 것으로 밝혀졌으며, 2007년과 2008년에 IFREMER에 의해 마르세유 만에서 수행된 매우 흥미로운 조사에 따르면, 질산염 농도는 2008년 6월에 3회 측정된 8μM 이상의 질산염 농도를 갖는 북부 브르타뉴 해안에 있는 마르세유 인근 외해에서 만큼 높을 수 있음을 보여준다(참조: Young et al., PLoS One. 2016, 11(5):e0155152). 또한, 엽록소 활성은 영양소 농도와 관련하여 비정상적으로 낮은 것으로 나타나고(0.2㎍/ml), 증식을 조절하는 바이러스 용해로 설명될 수 있는 매우 짧은 기간 동안 1㎍/ml까지 성장할 수 있다(참조: Young et al., PLOS One. 2016, 11(5):e0155152).
바이러스는 미세조류 대발생을 제어하는데 참여하는 것으로 익히 공지되어 있지만, 이는 지금까지 대형조류에 대해 입증되지 않았다. 미세조류 대발생의 바이러스 제어는 두 개의 미세조류인 동부 해안에서 유해한 대발생 조류를 유발하는 오레오코쿠스 아노파게페렌스(Aureococcus anophagefferens)(참조: Moniruzzaman et al., Front Microbiol. 2018, 9,752-758) 또는 하와이의 테트라셀미스(Tetraselmis)(참조: Schvarcz and Steward, Virology 2018, 518,423-433)와 함께 최근 미국에서 관찰되었다. 두 경우에, 그것은 거대 바이러스라고 칭명되는 최근에 발견된 바이러스 때문이었다. 거대 바이러스는 아메바에서 처음 발견되었다(참조: La Scola et al., Science 2003, 299, 2033-2038). 도 3b의 현미경에서 움직이는 아메바가 검출되었다는 것은 흥미롭다. 1세기 이후에 공지된 대부분의 바이러스의 크기는 400nm 미만이며, 예를 들어, HIV의 경우 160nm, 최소 바이러스(파보바이러스과 감염 돼지)의 경우 20nm이지만, 거대 바이러스의 크기는 최대 1㎛이다. 그 이후로, 거대 바이러스는 모두 전세계적으로 발견되어 많은 종, 특히 해양 종을 감염시켰다(참조: Abergel et al., FEMS Microbiol Rev 2015, 39,779-796).
울바 락투카 대발생은 지구 온난화와 함께 성장할 수 있는 문제의 원인으로 남을 것이다. 그러나, 이 울바 락투카 성공 스토리를 방해할 수 있는 "승자 죽이기"라는 자연 법칙 가설이 있다. 종의 증식이 있을 때, 이 종의 포식자가 이 증식을 제어하는 것으로 보인다. 가장 강력한 자연 포식자 중에서 가장 큰 것이 반드시 가장 효율적인 것은 아니다. 울바 락투카의 특이적 포식자의 출현은 바이러스, 해양 박테리아 및 아메바와 같은 지중해에서 포식자의 고농도의 결과일 수 있다. 바이러스는 점심해(1,000 내지 2,000m) 지역에서도 발견될 수 있는 해수에서 가장 풍부한 생물체이며, 지중해는 주로 표해수층(5m) 지역에서 가장 높은 농도를 갖는 것으로 보인다. 원핵생물과 단세포 조류가 주요 바이러스 숙주인 것으로 보이는 경우, 바이러스 분획으로부터 수득된 서열의 9%만이 식별 가능한 바이러스 기원을 가지며, 거대 바이러스에 특이적인 서열로는 연구가 수행되지 않았다. 포식자 역학은 온도와 관련하여 상이할 수 있고, 이는 온도가 15℃에 도달할 때 봄철 마르세유 만에서 울바 락투카가 사라지는 이유를 설명할 수 있다.
본 발명에 대해 설명된 실험은 마르세유 만으로부터의 물 샘플을 사용하여 브리튼 울바 락투카 증식을 제어할 수 있음을 입증한다. 이 제어는 미시적인 살아있는 활성 성분에 의해 이루어지며, 그의 농도는 마르세유 만의 상이한 지점에 대해 동일하지 않다. 중요한 것은, 마르세유 만의 동일한 지점(PR)에서 3년 연속 봄(2018, 2019, 2020)의 샘플 수집은 모두 울바 락투카 표백을 달성할 수 있었고, 이는 미생물, 특히 바이러스가 이 해양 환경에서 지속적으로 회수되었음을 나타낸다.

Claims (16)

  1. 이를 필요로 하는 해양 환경을 지중해(Mediterranean Sea)로부터 수집된 해수와 접촉시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속(genus Ulva)의 조류(alga)의 대발생(bloom)을 제어 및/또는 방지하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 울바 속의 조류가 울바 락투카 종(species Ulva lactuca)의 조류인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 해수가 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해수가 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해수가 울바 속의 조류의 사망을 촉진할 수 있는 살아있는 미생물을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 살아있는 미생물이 바이러스인, 방법.
  7. 지중해에서 수집된 해수로부터 유래된 하나 이상의 살아있는 미생물(들)과 이를 필요로 하는 해양 환경을 접촉시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 해양 환경에서 울바 속의 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 울바 속의 조류가 울바 락투카(Ulva lactuca) 종의 조류인, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 해수가 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집되는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해수가 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집되는, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 살아있는 미생물이 바이러스인, 방법.
  12. 해양 환경에서 울바 속의 조류의 대발생을 제어 및/또는 방지하기 위한, 지중해에서 수집된 해수로부터 유래된 하나 이상의 살아있는 미생물(들)의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 울바 속의 조류가 울바 락투카 종의 조류인, 용도.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 해수가 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E, 위도 43°18'N 및 경도 5°17'E, 위도 43°14'N 및 경도 5°17'E, 또는 위도 43°15'N 및 경도 5°19'E에서 수집되는, 용도.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해수가 위도 43°14'N 및 경도 5°21'E, 또는 위도 43°09'N 및 경도 5°36'E에서 수집되는, 용도.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 살아있는 미생물이 바이러스인, 용도.
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