CN101831409B - 保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于包括下述步骤：1)在4～8℃的低温和暗室条件下进行一级过滤，去除直径大于0.2μm的非病毒性颗粒或细菌；然后经切向流系统进行浓缩处理，可获得粗浓缩病毒液；2)在无菌、4～8℃和暗室条件下进行二级过滤，进一步去除直径大于0.22μm的非病毒性颗粒和一级过滤操作中可能污染的杂菌，得到纯度较高的浓缩病毒液；3)特异性海洋藻病毒的分离。本发明可以高通量的处理大批量的海水样品，并且保持病毒活性，对特异性的海洋浮游藻类病毒的分离而言具有操作简单、方便、快捷等特点。

Description

保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法
技术领域
本发明涉及海洋浮游病毒的分离技术领域，尤其指一种保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法。
背景技术
Bergh O等早在1989年就研究发现，在海洋生态系统中，病毒和浮游植物是其重要的一类生物，对海洋生态系统具有重要的调节作用。病毒在海水表层中大量存在会造成宿主的死亡从而导致海洋初级生产力的下降，McDaniel L等(2002)已证实藻类病毒能够调节水生态系统中的藻细胞密度。藻类病毒所特有的生态功能，暗示藻类病毒可能会成为将来的一种新型的生物防治有害藻类水华的手段，这种可能性已被越来越多的研究者所肯定。Bratbak G等(1993)的研究证实藻类病毒作为水生态系统中的重要组成部分，能够引起一些有害藻类细胞的裂解死亡，对有害藻华起到一定的控制作用。Nagasaki K等(1999)的研究证实了用赤潮异弯藻病毒HaV01作为一种微生态制剂来控制此类有害藻华的可能性。
我国在藻类病毒方面的研究报道为数不多，田波等(1998)用空斑法(Plaque FormingUnits，PFU)对小球藻病毒进行了分离报道；赵以军等(2002)采用小型反向超滤浓缩(Backflushing Ultrafiltration)装置对淡水蓝藻病毒(噬藻体)首次进行了分离报道。相比较而言，PFU法只适用于能在固体培养基上生长的藻类病毒的分离，而大部分的藻类(尤其是海洋藻类)是不能在固体培养基上培养的，因此就不能采用此方法进行分离；反向超滤浓缩法只适用于小量体积淡水水样的浓缩处理，相对于海水大量体积样品的浓缩处理而言是不适宜的。目前就我国藻类病毒的研究报道来看，只有淡水藻类病毒的几例分离报道，海洋藻类病毒的分离报道为数甚少。因此，如果想寻求用海洋藻类病毒来治理赤潮的新方法，藻类病毒的分离工作显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法中所使用的切向流膜包的清洗和保存方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于包括下述步骤：
1)在4～8℃的低温和暗室条件下进行一级过滤：
首先用0.2μm的滤芯对海水样品进行预过滤处理：调节蠕动泵的泵速在90～100rpm之间，去除直径大于0.2μm的非病毒性颗粒或细菌，得到预处理后的海水样品；整个操作在4～8℃的暗室条件下进行；
然后用切向流膜包对预处理后的海水样品进行超滤浓缩处理：调节蠕动泵的泵速在110～120rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，按原样∶浓缩样体积比1000～500∶1进行浓缩，对预处理后的海水样品反复进行切向流渗透，获得粗浓缩病毒液；
2)在无菌、4～8℃和暗室条件下进行二级过滤：
首先用0.1％～0.5％(M/V)的小牛血清白蛋白润湿0.22μm无菌针头式过滤器，在该过滤器中对粗浓缩病毒液进行二级过滤，进一步去除直径大于0.22μm的非病毒性颗粒和一级过滤操作中可能污染的杂菌，得到纯度较高的浓缩病毒液；其中小牛血清蛋白的浓度是指将一定克数的小牛血清蛋白溶解在以毫升为单位的纯净水中得到的；
3)特异性海洋藻病毒的分离：
用经二级过滤的浓缩病毒液，对预先培养的不同种类的海洋藻细胞进行反复的液体感染，即可建立藻病毒-宿主藻的特异性系统，分离出与浓缩病毒液中具有特异性的海洋藻类病毒。
所述的切向流膜包在使用前最好先进行润湿，具体操作如下：
用纯净水润湿膜包，纯净水的用量大于等于10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba、回流压Poutlet＝0.5～1ba、渗透压Pper＝0ba；循环流动润湿膜包，直到纯净水全部渗透流出。
所述的切向流膜包在超滤浓缩后进行清洗，清洗方法如下：
1)先用生理盐水对超滤浓缩后的切向流膜包进行等渗清洗，生理盐水的用量大于等于10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，直到生理盐水全部渗透流出；
2)用1mol/L的NaOH溶液碱洗等渗清洗后的切向流膜包，NaOH溶液的用量大于等于1L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，循环流动切向流清洗膜包，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0ba；清洗三次，每次清洗10～15分钟，清洗结束后打开透过液阀门，让NaOH溶液全部渗透流出；
3)用纯净水清洗碱洗后的切向流膜包，纯净水的用量大于等于10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，直到纯净水全部渗透流出。
所述的切向流膜包在等渗清洗、碱洗润湿后的短期保存方法：用0.1mol/L的NaOH溶液作为贮存缓冲液润湿切向流膜包，NaOH溶液的用量大于等于5L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，5～10分钟后关闭蠕动泵，同时关闭透过液与回流液阀门，将膜包原位保存在超滤浓缩仪器上。该方法可以保存3天左右。
所述的切向流膜包在等渗清洗、碱洗润湿后的长期保存方法：用0.1mol/L的NaOH溶液作为贮存缓冲液润湿切向流膜包，NaOH溶液的用量大于等于5L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，5～10分钟后关闭蠕动泵，取出膜包于0.1mol/L的NaOH溶液中保存。
与现有技术相比，本发明提供了海洋浮游藻类病毒的新分离方法，即在短时间内大批量的处理水样，在保持病毒活性的前提下，高通量的浓缩病毒后感染藻细胞，从而建立特异性的藻病毒-宿主藻系统，更方便、快捷、更有时效性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
首先用纯净水润湿新的Sartocon切向流膜包，纯净水用量为10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在105rpm之间，此时，硅胶管内的流速为3.50L/min；流速与管的内径和材质有关，管径和材质不同，其流速不同。首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门，使进水压Pinlet＝2ba、回流压Poutlet＝0.5ba、渗透压Pper＝0ba，循环流动润湿膜包，直到纯净水全部渗透流出。
1)海水样品的预过滤：
首先调节蠕动泵的泵速在90～100rpm之间，将50L自然海水经0.2μm聚丙烯折叠滤芯预过滤，去除直径大于0.2μm的非病毒性颗粒或细菌，得到预处理后的海水样品；整个操作在4～8℃的暗室条件下进行；
2)在4～8℃的低温和暗室条件下进行一级过滤：
用润湿的Sartocon切向流膜包对预处理后的50L海水样品进行超滤浓缩处理。具体操作如下：调节蠕动泵的泵速在110～120rpm之间，过滤前关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1.5ba，回流压Poutlet＝0.8ba，按原样/浓缩样体积比800∶1进行浓缩。整个操作在4～8℃的低温暗室条件下进行，经反复的切向流渗透海水之后，可获得40-50mL的粗浓缩病毒液。
3)在无菌、4～8℃和暗室条件下对粗浓缩病毒液进行二级过滤：
首先用0.3％(M/V)的小牛血清白蛋白润湿0.22μm Millex无菌针头式过滤器，然后在该过滤器中对粗浓缩病毒液进行过滤，进一步去除直径大于0.22μm的非病毒性颗粒和一级过滤操作中可能污染的杂菌，得到纯度相对较高的浓缩病毒液；整个操作在4～8℃的无菌低温暗室条件下进行。
4)特异性海洋藻病毒的分离：
用经二级过滤的浓缩病毒液，对预先培养的不同种类的海洋藻细胞进行反复的液体感染，按浓缩病毒液∶培养的海洋藻细胞液体积比1∶2接种，置于光照培养箱中培养观察，每天早晚各摇匀一次，与海洋藻的培养条件相同；如浓缩的病毒液中含有与感染的藻细胞具有特异性的病毒，则可建立藻病毒-宿主藻的特异性系统，感染后的藻细胞会被裂解，从而使培养的藻细胞液呈现出颜色变化，结合进一步的生态学与分子生物学鉴定，即可分离得到特异性的海洋藻类病毒。
为了方便切向流膜包的保存和再利用，在超滤浓缩后最好对使用过的切向流膜包进行冲洗，具体方法如下：
首先进行等渗清洗：用生理盐水对超滤浓缩后的切向流膜包进行等渗清洗，生理盐水用量为10L/10-1m2膜包表面积，调节蠕动泵的泵速在105rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1.5ba，回流压Poutlet＝0.8ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，直到生理盐水全部渗透流出。
然后进行碱洗：用1mol/L的NaOH溶液碱洗等渗清洗后的切向流膜包，NaOH溶液的用量为1L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在105rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，循环流动切向流清洗膜包，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1.5ba，回流压Poutlet＝0ba；清洗三次，每次清洗12～13分钟，清洗结束后打开透过液阀门，让NaOH溶液全部渗透流出；
最后进行水洗：用纯净水清洗切向流膜包，纯净水的用量为10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在105rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1.5ba，回流压Poutlet＝0.8ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，直到纯净水全部渗透流出。
切向流膜包的短期保存法：用0.1mol/LNaOH溶液作为贮存缓冲液润湿切向流膜包，NaOH溶液的用量为5L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在105rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1.5ba，回流压Poutlet＝0.8ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，7～8分钟后关闭蠕动泵，同时关闭透过液与回流液阀门，将膜包原位保存在超滤浓缩仪器上，一般可保存3天左右。
切向流膜包的长期保存法：用0.1mol/L的NaOH溶液作为贮存缓冲液润湿切向流膜包，NaOH溶液的用量为5L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在105rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1.5ba，回流压Poutlet＝0.8ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，7～8分钟后关闭蠕动泵，取出膜包于0.1mol/LNaOH溶液中保存。

Claims (5)

1.一种保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于包括下述步骤：
1)在4～8℃的低温和暗室条件下进行一级过滤；
首先用0.2μm的滤芯对海水样品进行预过滤处理：调节蠕动泵的泵速为90～100rpm之间，去除直径大于0.2μm的颗粒或细菌，得到预处理后的海水样品；整个操作在4～8℃的暗室条件下进行；
然后用切向流膜包对预处理后的海水样品进行超滤浓缩处理：调节蠕动泵的泵速在110～120rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，按体积比1000∶1～500∶1浓缩，对预处理后的海水样品反复进行切向流渗透，获得粗浓缩病毒液；
2)在无菌、4～8℃和暗室条件下进行二级过滤；
首先用0.1％～0.5％(M/V)的小牛血清白蛋白润湿0.22μm无菌针头式过滤器，在该过滤器中对粗浓缩病毒液进行过滤，进一步去除直径大于0.22μm的非病毒性颗粒和一级过滤操作中可能污染的杂菌，得到纯度较高的浓缩病毒液；
3)特异性海洋藻病毒的分离；
用经二级过滤的浓缩病毒液，对预先培养的不同种类的海洋藻细胞进行反复的液体感染，即可建立藻病毒-宿主藻的特异性系统，分离出浓缩病毒液中具有特异性的海洋藻类病毒。
2.根据权利要求1所述的保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于所述的切向流膜包在使用前先进行润湿，具体操作如下：
用纯净水润湿膜包，纯净水的用量为大于10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba、回流压Poutlet＝0.5～1ba、渗透压Pper＝0ba；循环流动润湿膜包，直到纯净水全部渗透流出。
3.根据权利要求2所述的保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于所述的切向流膜包在超滤浓缩后进行清洗，清洗方法如下：
1)先用生理盐水对超滤浓缩后的切向流膜包进行等渗清洗，生理盐水的用量为大于等于10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，直到生理盐水全部渗透流出；
2)用1mol/L的NaOH溶液碱洗等渗清洗后的切向流膜包，NaOH溶液的用量为大于等于1L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，循环流动切向流清洗膜包，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0ba；清洗三次，每次清洗10～15分钟，清洗结束后打开透过液阀门，让NaOH溶液全部渗透流出；
3)用纯净水清洗碱洗后的切向流膜包，纯净水的用量为大于等于10L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，直到纯净水全部渗透流出。
4.根据权利要求3所述的保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于所述的切向流膜包在等渗清洗、碱洗润湿后的短期保存方法为：用0.1mol/L的NaOH溶液作为贮存缓冲液润湿切向流膜包，NaOH溶液的用量大于等于5L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，5～10分钟后关闭蠕动泵，同时关闭透过液与回流液阀门，将膜包原位保存在超滤浓缩仪器上。
5.根据权利要求3所述的保持病毒活性的高通量切向流分离海洋藻类病毒的方法，其特征在于所述的切向流膜包在等渗清洗、碱洗润湿后的长期保存方法为：用0.1mol/L的NaOH溶液作为贮存缓冲液润湿切向流膜包，NaOH溶液的用量大于等于5L/10-1m2膜包表面积；调节蠕动泵的泵速在100～110rpm之间；首先关闭透过液阀门，打开回流液阀门，然后慢慢开启透过液阀门，调节回流液阀门至如下参数：进水压Pinlet＝1～2ba，回流压Poutlet＝0.5～1ba，渗透压Pper＝0ba，循环流动冲洗膜包，5～10分钟后关闭蠕动泵，取出膜包于0.1mol/L的NaOH溶液中保存。
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