CN103232963A

CN103232963A - 一种胶原蛋白酶产生菌

Info

Publication number: CN103232963A
Application number: CN2013101991045A
Authority: CN
Inventors: 郑振琴
Original assignee: TIANJIN YILIKANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Maoming Heep Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103232963B

Abstract

本发明涉及一种株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Col04菌株，其保藏编号为CGMCC NO.4500。本发明的枯草芽孢杆菌Col04菌株具有营养要求简单、生长快速，产胶原蛋白酶活性高等优点。研究表明，枯草芽孢杆菌Col04菌株产的胶原蛋白酶对大部分金属离子不敏感、pH范围宽广、胶原蛋白酶活性高、耐受温度能力比之前发现的来源于其他菌株的胶原蛋白酶强，而且该菌株具有安全无毒的特点，利用该菌株进行胶原蛋白或明胶的降解并用于食品和化妆品行业将具有广阔的经济前景。

Description

一种胶原蛋白酶产生菌

技术领域

本发明属于工业微生物筛选应用技术领域，更具体地说是涉及一种胶原蛋白酶产生菌。

背景技术

胶原蛋白酶的化学名为胶原蛋白水解酶（Collagenase），它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。

目前，胶原蛋白酶主要用于医学和科学研究。在临床上胶原蛋白酶主要应用于烧伤、创伤的创面治疗，以及增生性瘢痕、腰椎间盘突出的治疗等。在科学研究方面，胶原蛋白酶主要用于消化生物的器官组织获得原代细胞。

研究表明，胶原蛋白酶除了用于临床医学及科学研究外，胶原蛋白酶还参与角质层新陈代谢，延缓皮肤老化的速度，达到美容功效；而且胶原蛋白酶特异水解胶原蛋白获得胶原蛋白的基本结构——胶原三肽，可以直接补充人体胶原蛋白，达到延缓皮肤衰老达到美容养颜功效。然而，目前用于临床医学及科学研究的胶原蛋白酶大都是克隆来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）的胶原酶基因，然后在大肠杆菌（E. coli）中表达，梭菌及大肠杆菌的毒性影响了其在食品、化妆品行业中的应用。本发明的目的就是要解决胶原蛋白酶在食品、化妆品行业中的应用难题，为食品、化妆品行业提供一种安全且高效的胶原蛋白酶产生菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种胶原蛋白酶产生菌，即一株能够高效表达胶原酶的枯草芽孢杆菌新菌种，以及该菌种在胶原蛋白水解中的应用，即将该菌种产生的胶原蛋白酶应用于水解胶原蛋白获得富含胶原三肽的胶原蛋白粉，解决现有技术所获得产品分子量不均一、胶原三肽含量低等缺点。

本发明首先提供一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株，已于2013年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC NO.7567。

枯草芽孢杆菌Col04菌株的生长温度范围为30-45℃，最佳生长温度为37℃；生长的pH值范围为6.0-8.0，最适pH值为7.0，使用的培养基为LB 培养基。

本发明的菌株可将胶原蛋白和明胶降解成胶原三肽。

所述的菌株用于降解胶原蛋白或明胶，其工艺为：使用产酶培养基（产酶培养基成分如下：葡萄糖 20g/L，酵母提取物1.5 g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙 0.05 g/L，硫酸锰 0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠 0.5 g/L，pH 7.5）培养该菌株48小时，然后离心除去菌体，得到的发酵液用于胶原蛋白或明胶的降解。将胶原蛋白或明胶加入发酵液中，调节pH6.0-8.0，温度35-50℃条件下降解胶原蛋白或明胶。

本发明的枯草芽孢杆菌Col04菌株具有营养要求简单、生长快速，产胶原蛋白酶活性高等优点。研究表明，枯草芽孢杆菌Col04菌株产的胶原蛋白酶对大部分金属离子不敏感、pH范围宽广、胶原蛋白酶活性高、耐受温度能力比之前发现的来源于其他菌株的胶原蛋白酶强，而且该菌株具有安全无毒的特点，利用该菌株进行胶原蛋白或明胶的降解并用于食品和化妆品行业将具有广阔的经济前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

一、枯草芽孢杆菌Col04菌株的筛选

申请人以天津市肉联二厂附近的土壤样品作为基质，先经LB+5%明胶培养基富集培养，然后稀释后涂布到含有10%明胶的LB平板，pH7.0，37℃培养获得了本发明的菌株。对该菌株16s rRNA基因序列进行鉴定，该菌株鉴定为枯草芽孢杆。进一步参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版，科学出版社），并与枯草芽孢杆菌标准菌株生理生化试验对比，发现该菌株与标准菌株在某些特征方面有较明显的差异，是一株新型的枯草芽孢杆菌菌株。

二、枯草芽孢杆菌Col04菌株的形态、理化参数

1、枯草芽孢杆菌Col04菌株的形态特征

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Col04菌株为杆状，菌落表面粗糙不透明、污白色或微黄色，其菌体长约2.0-3.0μm，菌体宽度为0.7-0.8μm。染色结果显示为革兰氏阳性菌，其芽孢端生，约0.6-0.9μm，为椭圆形，不膨大。菌体不具有荚膜，具有侧生的鞭毛，能运动。

2、培养条件

枯草芽孢杆菌Col04菌在普通培养基上即可生长，当在LB琼脂培养基上37℃培养24小时，菌落表面粗糙无光泽，浅黄色或灰白色不透明，边缘不整齐，直径3.0-6.0mm。在 1%葡萄糖洋菜液体培养基上培养时会混浊生长，形成菌膜，无沉淀现象。枯草芽孢杆菌Col04菌的生长温度范围为35～50℃，通过细胞计数检测，发现在37℃下，细胞传代繁殖时间最短，是该菌的最佳生长温度。

另外，枯草芽孢杆菌Col04菌株培养是在好氧条件下进行，培养基的pH范围为 6.0-8.0，即该菌在偏中性条件下生长繁殖， pH为7.5是其最适的生长条件。

3 、生化反应参数

枯草芽孢杆菌Col菌株生理生化试验结果如下表1

表1：枯草芽孢杆菌Col菌株生理生化试验

其中，“+” 表示枯草芽孢杆菌Col04菌株呈阳性反应、能利用或能生长，“—” 表示呈阴性反应、不能利用或不能生长。

当在培养基中添加D-葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖或D-阿拉伯糖中的一种或几种时，本发明筛选的菌株都可以利用。

枯草芽孢杆菌Col04菌株氧化酶反应呈阴性，接触酶反应为阳性，细胞色素氧化酶反应的检测结果为阴性。

三、枯草芽孢杆菌Col04菌株产胶原蛋白酶的性质

1、胶原蛋白酶的制备

选用LB培养基（LB培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L），调节pH为7.5，在37℃，200rpm对细菌进行扩大培养24小时时停止培养，制得种子液。

取5ml种子液接种到100mL产酶培养基中（产酶培养基成分如下：葡萄糖 20g/L，酵母提取物1.5 g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙 0.05 g/L，氯化镁 0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠 0.5 g/L，pH 7.5。），于30℃，200rpm培养36小时，培养结束后，在4℃条件下、10000rpm离心10min，收集发酵上清液。

上清液先用硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；沉淀用pH7.5的Tris-Hcl缓冲液复溶后经Q_FF离子交换层析、Sephacryl_S-200凝胶过滤后分离得到胶原蛋白酶。SDS-PAGE结果表明，该胶原蛋白酶分子量大小约45kD，其胶原酶活性高达2408.5U/（mg蛋白）。

2、胶原蛋白酶的活性

胶原蛋白酶活性测定方法：

将0.3 mL 1 mg/mLⅠ型胶原溶液，0.2 mL 0.02 mol/L，pH 7.5 Tris-HCl（含50 mmol/L CaC1₂）缓冲液和0.1 mL发酵酶液或者纯化的酶在37 ℃反应20 min后，取出0.l mL反应液于0.5 mL 0.l mol/L HCl中以终止反应。采用茚三酮法依次加入0.6 mL 2 mol/L乙酸缓冲液和0.6 mL茚三酮显色液，于570 nm处比色，测定反应所释放的水溶性氨基酸、短肽的量，空白为加热失活的酶液。酶活力单位定义为：37 ℃，pH 7.5条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生相当于1 μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位。

通过测定不同产酶培养时间（24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h）的发酵液中胶原蛋白酶的活性，结果表明，当产酶培养48小时时，在pH7.5，温度37℃时，发酵液的活力达到最高为167.8U/（mL发酵液）。

考察了产酶培养48小时时的发酵液在不同温度下（25℃、30℃、37℃、42℃、45℃、50℃、55℃）的活性，结果表明，在pH7.5，温度45℃时，其胶原酶活力达到最高为223.6U/（mL发酵液），显著高于来源于其他菌种的胶原酶活性，而且来源于其他菌种的胶原酶当温度超过40℃，其活力急剧下降，因此，本发明的菌株产的胶原酶活力高，耐温能力强，更有利于其在食品、化妆品行业中的应用。

四、枯草芽孢杆菌Col04菌株在胶原蛋白水解中的应用

培养中发现枯草芽孢杆菌Col04菌株具有降解明胶的特性，因此将枯草芽孢杆菌Col04菌株的发酵液用于胶原蛋白的降解。

实施例1：利用枯草芽孢杆菌Col04发酵液对鱼皮胶原蛋白的降解

1）制备种子液：

选用LB培养基，调节pH为7.5，在37℃，200rpm对细菌进行扩大培养24小时时停止培养，制得种子液。

2）产酶培养

取10ml种子液接种到200mL产酶培养基中，于30℃，200rpm培养36小时，培养结束后，在4℃条件下、10000rpm离心10min，收集上清液（4℃保存备用）。

3）胶原蛋白的降解

取100g鳕鱼皮，将其去鳞洗净后剪成0.5mm×0.5mm大小，然后加入制备的上述发酵液100mL，调节pH7.5，置于37℃条件下，100rpm酶解8小时。酶解结束后95℃灭酶5分钟，从外观看，片状的鱼皮在发酵液作用下被降解成细小的颗粒，且酶解液变浑浊。将酶解液在10000rpm条件下离心10分钟，收集上清液后冻干得到类白色粉末11.5克，其蛋白含量91.2%，收率65.7%。

实施例2：利用枯草芽孢杆菌Col04发酵液对鱼皮胶原蛋白的降解

同实施例1相比，是将枯草芽孢杆菌Col04菌株产酶培养时温度提高到37℃，培养时间延长至48小时，其他条件不变。胶原蛋白降解时的条件不变，在降解8小时后将酶解液离心，上清液冻干得到类白色粉末13.6g，其蛋白含量92.1%，收率77.71%。因为在延长产酶培养的时间后，发酵液中胶原蛋白酶活力增加，导致在降解胶原蛋白时效果更好。

实施例3：利用枯草芽孢杆菌Col04发酵液对鱼皮胶原蛋白的降解

同实施例2相比，枯草芽孢杆菌Col04产酶培养条件不变：pH7.5、温度37℃、200rpm产酶培养48小时。在胶原降解过程中，将降解温度提高到45℃，降解时间维持8小时。在降解8小时后将酶解液离心，上清液冻干得到类白色粉末15.9g，其蛋白含量93.15%，收率90.86%。因为提高胶原蛋白降解温度后，发酵液中胶原蛋白酶活力增加，导致在降解胶原蛋白时效果更好。

实施例4：利用枯草芽孢杆菌Col04发酵液对鱼皮胶原蛋白的降解

同实施例3相比，产酶培养条件不变，胶原蛋白降解时间从8小时缩短为6小时，其他条件不变。鱼皮胶原蛋白降解6小时后将酶解液离心，上清液冻干得到类白色粉末15.8g，其蛋白含量93.04%，收率90.3%。和实施例3对比可以看出，缩短降解时间后，胶原降解的效果差别不明显，说明胶原酶在酶解后期活力显著下降，延长酶解时间不再有明显效果。

本发明的枯草芽孢杆菌Col04菌株也能用于其他胶原蛋白，如：鱼骨胶原蛋白、鱼鳞胶原蛋白、皮革加工废角料等。

本发明的枯草芽孢杆菌Col04菌株具有生长迅速、对培养基营养要求简单，胶原酶活性高等优点，而且对来源不同的胶原蛋白、明胶都有不错的降解效果。而且枯草芽孢杆菌对人畜无毒害作用，因此，其产生的胶原蛋白不仅可以用于医药、还可以用于食品和化妆品行业开发高端的功能性食品和高档化妆品，具有广阔的经济前景。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC NO.4500。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其生长温度范围为30-45℃，；生长的pH值范围为6.0-8.0。

3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其生长温度为37℃。

4.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，生长的pH值范围为7.0。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在将胶原蛋白或明胶降解成胶原三肽中的应用。

6.一种应用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其工艺为：使用产酶培养基培养该菌株48小时，然后离心除去菌体，得到的发酵液用于胶原蛋白或明胶的降解；将胶原蛋白或明胶加入发酵液中，调节pH6.0-8.0，温度35-50℃条件下降解胶原蛋白或明胶，其中产酶培养基成分如下：葡萄糖 20g/L，酵母提取物1.5 g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙 0.05 g/L，硫酸锰 0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠 0.5 g/L，pH 7.5。