CN110172430A - 一株桑肠杆菌及其在降解噻虫嗪中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株保藏编号为CGMCC No.16236的桑肠杆菌(Enterobacter mori)及其在降解噻虫嗪中的应用；该桑肠杆菌可制备成菌剂，应用于叶菜种植体系中土壤源噻虫嗪残留污染的修复，以及降低叶菜叶片的噻虫嗪残留，并促进植株生长；该桑肠杆菌属于土壤益生菌，能长期定植于蔬菜植株，在不影响蔬菜品质的前提下，高效降低噻虫嗪残留，实现绿色安全生产。

Description

一株桑肠杆菌及其在降解噻虫嗪中的应用
技术领域
本发明涉及一株桑肠杆菌(Enterobacter mori)及其在降解噻虫嗪中的应用，即针对叶菜种植体系中土壤源塑化剂噻虫嗪残留污染的土壤利用该桑肠杆菌制备的菌剂并加以应用，属于微生物学与食品安全领域。
技术背景
蔬菜产业的发展对我国种植业结构优化调整、农业增效、农民增收、扩大出口创汇等方面具有不可替代的作用。蔬菜生育期短，生长快，复种指数高，在生产过程中极易受到病虫害的危害。据不完全统计，我国蔬菜虫害有200余种，每年需使用大量农药以保障蔬菜免受或少受虫害影响，但农药的大量使用在一定的程度上造成了环境污染和食品安全隐患。除了直接喷施在作物上的农药外，作物还可以从被污染的土壤和水吸收农药残留，被作物吸收的农药残留可能最终进入到食物链中而对人和动物的健康造成威胁。因此消除环境中或作物体内的农药残留对保障食品安全有至关重要的作用。传统的物理和化学方法清除土壤和水中污染物不仅耗资巨大，还会对环境造成一定破坏性。
新烟碱类杀虫剂是近几十年来主要开发的一种新型杀虫剂。该类杀虫剂用量少、持久性强、对大多数节肢动物高神经毒性以及独特的选择性作用机制，在不到20年的时间里，发展为全世界使用最广泛的一类杀虫剂，吡虫啉和噻虫嗪是该类杀虫剂中两个主要的品种。新烟碱类杀虫剂既可用作茎叶处理，也可用于土壤和种子处理。然而，新烟碱类杀虫剂在世界范围内的大量使用对环境和非靶标生物的影响引起了各国的高度关注，已有大量的文献报道了新烟碱类杀虫剂对蜜蜂等授粉昆虫和蚯蚓有高毒，还可引起蜂群崩溃失调病；不仅如此，此类杀虫剂对鸟类还具有高生殖毒性；影响鼠类的呼吸作用和造成肝脏损伤；甚至导致生物多样性的下降。我国登记使用的新烟碱类杀虫剂有效成分8个，涉及相关产品1729个，是我国当前在蔬菜水果和粮食作物上应用最为广泛的一类杀虫剂。
[1]噻虫嗪(thiamethoxam)是1991年由瑞士诺华公司研发的高效、安全、高选择性、低毒的第二代新型烟碱类杀虫剂，以氯噻唑环增加广谱作用并提高活性，极性强，溶解性高，内吸作用强，用于茎叶喷雾、土壤灌根、种子处理，施药后叶片或根系通过内吸迅速传输到植株各部位，可有效防治蚜虫、潜叶蛾等害虫。能在土壤和地表水存在高浓度的噻虫嗪。并在蜂蜜和玉米和向日葵的花粉、糙米、燕麦、柠檬检测到高浓度的残留。已有大量的文献报道了噻虫嗪对蜜蜂等授粉昆虫和蚯蚓有高毒，还可引起蜂群崩溃失调病(“吴迟.几种新烟碱类杀虫剂对意蜂毒性影响研究[D].湖南农业大学,2015”、“Girolami V，Marzaro M，Vivan L，et al.Aerial powdering of bees inside mobile cages and the extent ofneonicotinoid cloud surrounding corn drillers[J].Journal of AppliedEntomology，2013，137(1-2):35-44”、“Garry Codling,Yahya Al Naggar.Neonicotinoidinsecticides in pollen,honey and adult bees in colonies of the European honeybee(Apis mellifera L.)in Egypt[J].2017”、“Jeroen P van der Sluijs1,Noa Simon-Delso1,Dave Goulson2,Neonicotinoids,bee disorders and the sustainability ofpollinator services[J].2013”)；不仅如此，此类杀虫剂对鸟类还具有高生殖毒性；影响鼠类的呼吸作用和造成肝脏损伤；甚至导致生物多样性的下降(“Wenchao Han a,YingTian a,b,*,Xiaoming Shen a,**Human exposure to neonicotinoid insecticides andthe evaluation of their potential toxicity:An overview,2018”、“Alzbeta Staraa,b,Roberto Bellinvia b,Josef Velisek a,Alzbeta Strouhova a,Antonin Kouba a,Caterina Faggio,Acute exposure of common yabby(Cherax destructor)to theneonicotinoid pesticide,2019”)。噻虫嗪在土壤中的半衰期为50天(7-72天)。土壤中的噻虫嗪主要靠微生物降解。
目前桑肠杆菌除了报道是致病菌外(蒙姣荣等，广西桑树细菌性枯萎病菌生物学特性及防治药剂筛选[J].广西植保,2015,28(3):1-7.)，还未见有降解污染物或农药方面的文献报道，更无桑肠杆菌属降解新烟碱类杀虫剂的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株桑肠杆菌(Enterobacter mori)，该菌株可针对土壤主要噻虫嗪进行降解，并可进一步制备为修复剂，能够有效降解残留于栽种土壤中的噻虫嗪污染，进而减少其向叶菜中的吸收转移，同时影响叶菜植株的正常生长，以及不引入其他污染源。
为实现上述目的，本发明首先提供了一株保藏号为CGMCC NO:16236的桑肠杆菌(Enterobacter mori)，该菌株分离自多年生落叶乔木或灌木植物桑树体内，菌株呈棒杆状，不内生芽孢，肠杆菌属；该菌株多数对动植物无害，申请人将该菌株自命名为TMX-13，并于2018年8月8日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.16236，分类命名为桑肠杆菌(Enterobacter mori)。
其次，本发明提供了上述保藏号为CGMCC NO:16236的桑肠杆菌在降解噻虫嗪中的应用，特别是在降解土壤或叶菜植株体内噻虫嗪残留中的应用。
进一步，上述菌株CGMCC NO:16236在叶菜植株体内噻虫嗪残留中的应用是指，将保藏号为CGMCC NO:16236的桑肠杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml(OD值为1)的菌液，对叶菜植株进行进行浸根处理24h，用以降解叶菜植株中可食用部位残留的噻虫嗪。
进一步，上述菌株CGMCC NO:16236在降解土壤噻虫嗪残留中的应用是指，将保藏号为CGMCC NO:16236的桑肠杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml(OD值为1)的菌液，对叶菜植株地上部位进行喷施处理(60ml/m2)，用以降解叶菜植株中可食用部位残留的噻虫嗪。
本发明还提供了上述保藏号为CGMCC NO:16236的桑肠杆菌在促进叶菜植株生长，特别是叶菜植株根系生长中的应用。所述应用是指，将该桑肠杆菌制备成菌含量为107- 8CFU/ml(菌液OD600＝1)的菌剂，对叶菜植株进行浸根处理，以促进叶菜植株根系生长。
与现有技术相比，本发明提供的桑肠杆菌(Enterobacter mori)自植物内分离，属于植物内生菌桑肠杆菌(Enterobacter mori)，该菌株可针对植物体内农药噻虫嗪进行降解，并可进一步制备为修复剂，进而减少其向叶菜中的吸收转移，不影响叶菜植株的正常生长，不引入其他污染源。
附图附表说明
图1为桑肠杆菌(Enterobacter mori)TMX-13的扫描电镜图。
图2为桑肠杆菌TMX-13对噻虫嗪的降解功能验证结果示意图。
图3为该微生物菌剂浸根接菌和叶面喷施接菌处理对减少叶菜体内噻虫嗪污染的效果示意图。
图4为该微生物菌剂对叶菜蔬菜促生的效果示意图。
表1为该微生物菌剂对叶菜蔬菜促生的表型数据。
具体实施方式
实施例所涉及的培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH 7.0；
无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O(0.4g),FeSO4·7H2O(0.2g),K2HPO4(0.2g),(NH4)2SO4(0.2g),and CaSO4,(0.08g),去离子水1L,pH 7.0～7.2；
种子培养基：K2HPO4(4.8g),KH2PO4(3.5g),(NH4)2SO4(2g),MgCl2(0.16g),CaCl2(0.02g),NaMoO4.2H2O(0.0024g),FeCl3(0.0018g),MnCl2.2H2O(0.0015g),PH＝7.0,加水至1L；
无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/L琼脂；
菌种活化培养基:10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH 7.0；
无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O(0.4g),FeSO4·7H2O(0.2g),K2HPO4(0.2g),(NH4)2SO4(0.2g),and CaSO4,(0.08g),去离子水1L,pH 7.0～7.2；
以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。
实施例1桑肠杆菌TMX-13的分离鉴定与降解功能验证
1、菌株Enterobacter mori sp.TMX-13分离鉴定
申请人于2016年9月采集来自江苏省农业科学院南面试验地桑树地人为喷施了噻虫嗪的桑树植株的根，然后对桑树根进行表面消毒，研磨成汁液，涂布在含有噻虫嗪为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，筛选获得一株具备噻虫嗪降解特性的植物内生菌。申请人将该菌自命名为TMX-13，其电镜图片如图1所示，该菌株呈棒杆状，无内生芽孢。
通过生理生化特性和16SrDNA保守序列比对TMX-13菌株鉴定为桑肠杆菌(Enterobacter mori)，申请人于2018年8月8日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.16236，分类命名为桑肠杆菌(Enterobacter mori)。
2、Enterobacter mori sp.TMX-13菌株降解DBP功能验证
先用LB培养基过夜培养步骤1筛选获得的纯TMX-13菌株，菌体经过离心(5000rpm，15min,4℃)并用无菌磷酸缓冲液(PBS，pH 7.0)洗涤三遍，然后用PBS重悬成TMX-13菌悬液(OD600＝1.0左右)；再按体积比1％的接菌量将TMX-13菌悬液加入2μg/mL的噻虫嗪为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中培养2、6、12、36、48、5小时；最后用高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测无机盐液体培养基中的噻虫嗪残留含量，对比不接菌的对照组(加入1％的PBS)，计算TMX-13菌株的降解率：
噻虫嗪降解率＝(对照组噻虫嗪含量-实验组噻虫嗪含量)/对照组噻虫嗪含量*100％；最终确定Enterobacter mori sp.TMX-13的噻虫嗪降解性能。
上述高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)参见文献：Li Y,Long L,Yan H,Ge J,Cheng J,Ren L,Yu X,2018.Comparison of uptake,translocation and accumulationof several neonicotinoids in komatsuna(Brassica rapa var.perviridis)fromcontaminated soils.Chemosphere 2008,603-611.
检测结果如图2所示，图2中，曲线A为实验组，曲线B为对照组。可见1％体积的TMX-13菌液就能够将浓度为2μg/mL的噻虫嗪的半衰期从78小时缩减到39小时，降解率在48小时时达到65％。充分验证了Enterobacter mori sp.TMX-13对噻虫嗪的高效降解特性。
实施例2 TMX-13菌剂的制备
本实施例中，TMX-13菌剂是通过如下步骤获得的：
A)将实施例1获得的菌株TMX-13接种至LB培养基，30℃划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落于菌种活化培养基中，30℃，150-220rpm摇床震荡培养12-24h，获得活化菌种；
B)向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种，接种量为种子培养基体积的1％，25-38℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；
C)向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子，接种量为种子培养基体积的1％，30-35℃,200rpm下避光培养至对数生长期，得到活菌体培养物；
D)取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心20min，取沉淀菌体用无菌生理盐水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至菌液OD600＝1(菌液浓度约107-8cfu/mL)，即获得TMX-13菌剂。
实施例3 TMX-13菌剂灌根接菌修复叶菜噻虫嗪污染实验
取样农田自然土壤，先暴晒风干，再过30目筛子去除过大的石粒，土壤成分性质为pH 5.97,有机质含量66.8g/kg干土,总氮含量0.36％,总碳含量49.61％,总氢含量5.7174％,总硫含量0.01％,氧含量44.37％，黏土含量2.33％，淤泥含量16.1％，沙含量81.5％。
将三叶一心的小青菜上海青的根全部浸泡在实施例2获得的TMX-13菌剂4h后，移栽至上述农田自然土壤，对照组浸泡在生理盐水中；待栽培21d上海青成熟后，在上海青叶面喷施噻虫嗪农药(购自江苏辉丰生物农业股份有限公司，按推荐剂量喷药)，三天后取叶菜可食用部分，用高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测叶菜可食用部分的噻虫嗪残留含量(检测方法参照文献：Li Y,Long L,Yan H,Ge J,Cheng J,Ren L,Yu X,2018.Comparison of uptake,translocation and accumulation of severalneonicotinoids in komatsuna(Brassica rapa var.perviridis)from contaminatedsoils.Chemosphere 2008,603-611.)。
该实验结果如图3所示，可见，噻虫嗪残留含量从1.52mg/Kg(对照组1)降低到0.62mg/Kg(实验组1)，证明TMX-13菌剂能够显著降低叶菜可食用部分的噻虫嗪残留。
实施例4 TMX-13菌剂叶面喷施接菌修复叶菜噻虫嗪污染实验
将小青菜上海青种植于实施例3所述农田自然土壤，种植40天左右上海青成熟后，在上海青叶面喷施噻虫嗪农药(购自江苏辉丰生物农业股份有限公司，按推荐剂量喷药)，待叶面上的农药完全干后，将实施例2获得的TMX-13菌剂喷施于上海青叶面(喷施量约60ml/m2)，照组喷施生理盐水，三天后取叶菜可食用部分，用高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测叶菜可食用部分的噻虫嗪残留含量(检测方法同实施例3)。
该实验结果如图3所示，该菌剂能够将叶菜可食用部分的噻虫嗪残留从1.50mg/Kg(对照组2)显著降低到0.59mg/Kg(实验组2)。
实施例5 TMX-13菌剂灌根接菌对叶菜促生的作用
将三叶一心的小青菜上海青的根全部浸泡在实施例2获得的TMX-13菌剂中24h后，移栽至实施例3所述农田自然土壤，对照组浸泡在生理盐水中；每组设置3个重复；栽培21d上海青成熟后，拔出整颗植株观察生长情况，实验结果如表1及图4所示：
表1
可见，TMX-13能让植株叶绿素和生物量增加，根系更发达，须根显著增多。证明TMX-13菌剂对上海青植株具有促进生长的作用。
上述实施例验证了TMX-13菌剂可降解植株体内噻虫嗪残留，并对上海青具有促生长的作用。

Claims (7)

1.一株保藏号为CGMCC NO:16236的桑肠杆菌（Enterobacter mori），该菌株菌体为直杆状，无内生芽孢。
2.如权利要求1所述桑肠杆菌在降解噻虫嗪中的应用。
3.如权利要求1所述桑肠杆菌在促进叶菜植株生长中的应用。
4.一种含有如权利要求1所述桑肠杆菌的菌剂。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指，桑肠杆菌在降解叶菜植株体内噻虫嗪中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是指，将所述桑肠杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml的菌剂，对叶菜植株进行浸根或叶面喷施，用以降解叶菜植株中残留的噻虫嗪。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指，将所述桑肠杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml的菌剂，对叶菜植株进行浸根处理，以促进叶菜植株生长。
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