CN109694837A - 一种降解有机污染物的产电菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水产养殖有机物污染去除及微生物应用的技术领域和新能源领域，具体为一种降解有机污染物的产电菌株及其应用。该菌株为肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02已于2019年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.17110,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。该菌为单细胞，杆状细菌。该细菌能够利用降解有机污染物作为电子供体，利用微生物燃料电池装置检测其具有产电能力，该菌株对实现废物资源的可持续利用具有较好的应用潜力。

Description

一种降解有机污染物的产电菌株及其应用
技术领域
本发明涉及水产养殖有机物污染去除及微生物应用的技术领域和新能源领域，具体为一种降解有机污染物的产电菌株及其应用。
背景技术
海参，被誉为“海产八珍”，隶属于棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothuroidea)。我国当前海参养殖主要以刺参为主，在20世纪海参凭借其较高的营养和药用价值深受人们青睐。海参养殖业是我国特色海水养殖产业之一，主要分布在山东沿海及辽宁地区。海参是水产养殖的主要种类，水产养殖业的支柱之一，山东沿海地区拥有大量的野生海参与海参养殖区，相对于海参人工育苗迅速发展的规模，与海参养殖技术相关的基础研究还比较滞后，已经引起了一系列的问题，如严重的富营养化及海水污染造成了大量的经济损失。
微生物燃料电池，是利用产电微生物将有机物中的化学能及生物能转化为电能的装置，一种获得新能源的有效方式，微生物的胞外电子传递效率直接影响着微生物燃料电池的内阻、功率和库伦效率，产电微生物的胞外电子传递效率直接关系到微生物燃料电池的电能产出。利用产电微生物降解环境污染物如十溴联苯醚获取电能是一种经济环保的新能源技术，相比传统的化石能源的消耗，微生物燃料电池具有环境友好，能量利用率高等特点。
随着经济的发展，随之而来的有机物污染问题日益严重，同时能源短缺导致获得清洁新能源也成为近年来社会发展亟需解决的问题。如何治理或利用有机污染物获取新能源，实现能源的再生利用具有重要的生态意义和经济意义。
发明内容
本发明提供了一种降解有机污染物的产电菌株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种降解有机污染物的产电菌株，该菌株为肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02已于2019年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCCNo.17110,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
所述菌株肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02为单细胞，革兰氏阴性菌，菌体大小(0.3～1.5)μL×(0.6～6.0)μL。
肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02已于2019年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.17110,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
所述菌株肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02为单细胞，革兰氏阴性菌，菌体大小(0.3～1.5)μL×(0.6～6.0)μL。
所述菌株分离自山东省沿海海参养殖区海域，在含有有机污染物的Luria-Bertani培养基中驯化培养后，取适量培养液涂于无菌培养基上，将培养基放置于20～37℃恒温箱进行培养，培养8～48小时后，培养挑取单菌落，重复4～10次该操作，获取单菌落纯菌株。
所述肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02属于变形杆菌门(Proteobacteria),γ-变形菌纲(γ-proteobacteria),肠杆菌目(Enterobacteriales)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。革兰氏阴性菌，菌体大小(0.6～0.9)微米×(1～3)微米，杆状，可以在多种培养基上生长。
一种降解有机污染物的产电菌株的应用，所述菌株肠杆菌Enterobacteriaceaesp.HS02在在作为有机污染物降解菌中的应用。
所述有机污染物为水体中的有机污染物。
所述有机污染物为十溴二苯乙烷、十溴二苯醚、十溴联苯醚、三氯甲烷、一溴二氯甲烷或三溴甲烷等。
一种降解有机污染物的菌株的应用，所述菌株作为产电溶藻菌在微生物燃料电池中将生物能转换为电能中的应用。
所述菌株以有机污染物作为电子供体的进行胞外电子传递，进而将生物能转换成电能，实现资源的可持续利用。
所述菌株为肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02、该菌株的培养液、该菌株的培养液浓缩物、该菌株的培养液的菌悬液、或该菌株的培养液分离的上清液。
所述菌株在将生物能转换为电能时电子供体为十溴二苯乙烷、十溴二苯醚、十溴联苯醚、三氯甲烷、一溴二氯甲烷或三溴甲烷等。
所述菌株产电能力可利用单室微生物燃料电池和双室微生物燃料电池进行检测。单室微生物燃料电池阳极的碳布电极，阴极为空气阴极，双室微生物燃料电池阳极和阴极均为碳布电极，采用阳离子交换膜分离阴极和阳极。
所述将菌株HS02培养在含有机污染物十溴二苯乙烷或十溴二苯醚的培养基中，可以十溴二苯乙烷或十溴二苯醚作为电子供体，通过微生物燃料电池装置产生并检测到电流。其产生的电压可达到0.2mA到0.8mV。
本发明所具有的优点：
本发明所述的产电细菌HS02在山东省沿海海参养殖区海域分离获得，可用于有机污染物的降解及通过微生物燃料电池获取新能源的应用研究。由于近年来工农业的发展，造成了严重的环境污染，环境有机污染物的导致生态系统遭受到严重的破坏，为满足工农业生产的需求，化石燃料的燃烧也造成了不可再生资源的大量消耗，利用产电微生物以有机污染物作为电子供体，将生物能转换为电能在未来环境治理及获取新能源方面具有较好的应用，同时可实现自然资源的可持续再利用。
附图说明
图1为本发明实施例提的菌株HS02与NCBI数据库比对相似性较高序列菌株的系统发育树；
图2为本发明实施例提的菌株HS02构建的以十溴二苯乙烷作为电子供体的微生物燃料电池的电压变化图；
图3为本发明实施例提的菌株HS02构建的微生物燃料电池的氧化还原曲线；
图4为本发明实施例提的菌株HS02构建的以十溴二苯醚作为电子供体的微生物燃料电池的电压变化图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1：菌株HS02的分离纯化及鉴定
1.菌株的富集：2018年7月采集山东省烟台市长岛周边海参养殖池的水样，利用无菌的玻璃瓶，将水样采集送至无菌实验室，加入500mL含有机污染物十溴二苯乙烷的培养基中进行菌株的富集、分离培养。培养基组成：十溴二苯乙烷1.0μg L-1,氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01g L-1，六水氯化铁0.05g L-1。
2.菌株的纯化培养：配置固体平板培养基，取100μL上述富集培养后的培养液涂于固体平板培养基，置于恒温30℃培养箱培养24h后，挑取单菌落，重复该操作5次，获得单菌落纯菌株HS02。固体平板培养基组成：十溴二苯乙烷1.0μg L-1,氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01g L-1，六水氯化铁0.05g L-1，琼脂20g L-1。
3.挑取单菌落HS02，培养于10mL无菌培养基中，培养条件与纯化培养条件相同，培养18h，5 000g离心15min，收集细菌细胞。无菌培养基组成：十溴二苯乙烷1.0μg L-1,氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01g L-1，六水氯化铁0.05g L-1。
4.利用细菌提取试剂盒，提取总DNA，琼脂糖凝胶电泳监测后，送往测序公司进行16S rRNA的序列进行测序，随后在NCBI数据库比对确定细菌属于肠杆菌科。细菌的16SrRNA序列：GCTACCATGCAGTCGAGCGGTAGCACAGAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGAGGTAGTGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAAGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCGAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAAGAATACCGGTGGCGAACGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCAGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGAGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGTGGTTTATTCGATGCACGCGAAAACCTTACCTACTCTTGACTCCAGAA
与相似性较高的细菌序列做系统发育树(参见图1)；经NCBI数据库比对确定细菌隶属于肠杆菌科，与相似性较高的细菌序列做系统发育树，比对后表明菌株YN_01属于Enterobacteriaceae科。
实施例2菌株HS02降解有机物的降解效率测定
1.在无菌培养基(无菌培养基成分为柠檬酸钠3.0g L-1,氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01g L-1，六水氯化铁0.05g L-1)中培养菌株HS02至对数期后，5 000g离心15min收集细菌菌体，利用无菌水在5 000g离心15min条件下清洗细菌菌体。
2.将步骤1获得的细菌菌体接入有机物污染物培养基中，培养基组成为无菌培养基成分为氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01gL-1，六水氯化铁0.05g L-1，DMSO5g L-1，每个培养瓶内分别加入50.0mg L-1的十溴二苯乙烷、十溴二苯醚、十溴联苯醚、三氯甲烷、一溴二氯甲烷、三溴甲烷溶液，培养7天后，利用液相色谱仪检测有机物污染物在细菌培养前后的浓度变化。
3.采用LC/MS检测有机污染物的含量变化，仪器型号为：AB 5500QqQ质谱仪(ABSCIEX)+Waters I-class超高效液相色谱仪(Waters)色谱柱:Waters,ACQUITY UPLC BEHAmide l.7μm，2.1*100mm column；
色谱条件：样品采用Waters I-class超高效液相色谱仪(Waters)进行分离。流动相：A为水溶液+30mM乙酸铵+30mM氨水(pH～9.75)，B为乙腈。样品置于4℃自动进样器中，柱温38℃，流速为0.3mL min-1，进样量2μL。液相梯度如下：0-1min，B维持在95％；1-14min，B从95％线性变化到65％；14-16min，B从65％线性变化到40％；16-18min，B维持在40％；18-18.1min，B从40％线性变化到95％；18.1-23min，B维持在95％。MRM质谱条件：
采用AB 5500QqQ质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。ESI源条件如下：保护气体温度,350℃；干燥气体温度,350℃；保护气体流速，11L min-1；干燥气体流速10L min-1；毛细管电压,正离子4000V或负离子离子模式-3500V；喷嘴电压,500V；喷雾压力，30psi。
采用MRM模式监测，每个MRM离子对的保留时间为3ms，总的循环时间为1.3s，以2.5mg有机污染物标准品(十溴二苯乙烷、十溴二苯醚、十溴联苯醚、三氯甲烷、一溴二氯甲烷、三溴甲烷)溶解于10mL乙腈内作为标准品，利用峰面积归一法分析获得HS02的培养液中有机污染物的浓度。
4.降解效率：培养七天，检测有机物污染物在菌株HS02培养液内的浓度变化，初始50.0mg L-1十溴二苯乙烷，降低至18.6mg L-1；十溴二苯乙烷降至16.5mg L-1；十溴二苯醚降至34.5mg L-1；十溴联苯醚降低至20.1mg L-1、三氯甲烷降至42.6mg L-1；一溴二氯甲烷37.1mg L-1、三溴甲烷29.8mg L-1；菌株HS02对十溴二苯乙烷的降解效率为62.8％、对十溴二苯醚的降解效率为67％、对十溴联苯醚的降解效率为31％、对三氯甲烷的降解效率为14.5％、对一溴二氯甲烷的降解效率为25.8％、对三溴甲烷的降解效率为40.4％。
实施例3：菌株HS02以十溴二苯乙烷作为电子供体产电效率的测定
1.微生物燃料电池：双室100mL，电极为碳布电极，参比电极为氯化银(AgCl)电极，双室微生物燃料电池利用阳离子交换膜进行间隔，电阻为1000Ω。
2.将上述经纯化后菌株于无菌培养基(无菌培养基成分为十溴二苯乙烷1.0mg L-1,氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01g L-1，六水氯化铁0.05g L-1)中培养至对数期，而后取100mL培养液接种于双室微生物燃料电池阳极中，阴极室溶液为磷酸缓冲液(pH＝7.0)，温度为37℃。培养至第6天时，加入新的无菌培养基，实时记录微生物燃料电池电压变化，检测菌株HS02的产电效率(参见图2)。所述利用数据采集系统(Model 2700,Keithley Instruments,USA)采集电压，Excell INX软件记录每分钟的输出电压。
由图2可见，随着菌株HS02培养，通过微生物燃料电池反应器检测到微生物的电压随之增长，随菌株HS02浓度的变化而变化，产电效率最高可达0.75mA。
利用电化学工作站，循环伏安法，测定微生物燃料电池的氧化还原峰(图3)。图3表示，利用扫描循环伏安法测试菌株的电极表面电子传递行为进行了研究，循环伏安法扫描结果在0.1V和0.3V(vs.Ag/AgCl)出现了氧化还原峰。
实施例4：菌株HS02以十溴二苯醚作为电子供体的产电效率的测定
1.微生物燃料电池：双室80mL，电极为碳布电极，参比电极为氯化银(AgCl)电极，双室微生物燃料电池利用阳离子交换膜进行间隔，电阻为1000Ω。
2.将上述经纯化后菌株于无菌培养基(无菌培养基成分为：十溴二苯醚3.0μg L-1,氯化钠0.53g L-1，磷酸二氢钾2.0g L-1，七水硫酸镁1.0g L-1，无水氯化钙0.01g L-1，六水氯化铁0.05g L-1)中培养至对数期，而后取80mL接种于双室微生物燃料电池阳极中，阴极室溶液为磷酸缓冲液(pH＝7.0)，温度为37℃。实时记录微生物燃料电池电压变化，检测菌株HS02的产电效率(参见图4)。所述利用数据采集系统(Model 2700,Keithley Instruments,USA)采集电压，Excell INX软件记录每分钟的输出电压，根据欧姆定律计算电流密度[C＝U/(RS),C(mA m-2)为电流密度，其中U为输出电压(mV)，R是外电阻(Ω)，S是阳极石墨电极表面积(m2)]由图4可见，随着菌株HS02培养，通过微生物燃料电池反应器检测到随着微生物在阳极室的培养，电流密度最高到16mA m-2。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 一种降解有机污染物的产电菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 950
<212> DNA
<213> 肠杆菌(Enterobacteriaceae sp. HS02 )
<400> 1
gctaccatgc agtcgagcgg tagcacagaa gagcttgctc tttgggtgac gagcggcgga 60
cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc 120
taataccgca taacgtcgca agaccaaagt gggggacctt cgggcctcat gccatcagat 180
gtgcccagat gggattagct agtaggtgag gtagtggctc acctaggcga cgatccctag 240
ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga 300
ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat 360
gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcgaggaa gaaggcgata aggttaataa 420
ccttgtcgat tgacgttact cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacaga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt 540
ctgtcgagtc agatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcatccg aaactggcag 600
gctagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct 660
ggaagaatac cggtggcgaa cgcggccccc tggacaaaga ctgacgctca tgtgcgaaag 720
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga tgtcgacttg 780
gaggttgttc ccttgaggag tggcttccag agctaacgcg ttaagtcgac cgcctggaga 840
gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggaaca 900
tgtggtttat tcgatgcacg cgaaaacctt acctactctt gactccagaa 950

Claims (8)

1.一种降解有机污染物的产电菌株，其特征在于：该菌株为肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02已于2019年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.17110,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
2.按权利要求1所述的降解有机污染物的产电菌株，其特征在于：所述菌株肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02为单细胞，革兰氏阴性菌，菌体大小(0.3～1.5)μL×(0.6～6.0)μL。
3.一种权利要求1所述的降解有机污染物的产电菌株的应用，其特征在于：所述菌株肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02在作为有机污染物降解菌中的应用。
4.按权利要求3所述的降解有机污染物的产电菌株的应用，其特征在于：所述有机污染物为水体中的有机污染物。
5.按权利要求4所述的降解有机污染物的产电菌株的应用，其特征在于：所述有机污染物为十溴二苯乙烷、十溴二苯醚、十溴联苯醚、三氯甲烷、一溴二氯甲烷或三溴甲烷。
6.一种权利要求1所述的降解有机污染物的菌株的应用，其特征在于：所述菌株作为产电溶藻菌在微生物燃料电池中将生物能转换为电能中的应用。
7.按权利要求6所述的降解有机污染物的菌株的应用，其特征在于：所述菌株为肠杆菌Enterobacteriaceae sp.HS02、该菌株的培养液、该菌株的培养液浓缩物、该菌株的培养液的菌悬液、或该菌株的培养液分离的上清液。
8.按权利要求7或6所述的产电溶藻海洋细菌的应用，其特征在于：所述菌株在将生物能转换为电能时电子供体为十溴二苯乙烷、十溴二苯醚、十溴联苯醚、三氯甲烷、一溴二氯甲烷或三溴甲烷。
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