CN109401996B - 苯系物降解菌fb1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苯系物降解菌FB1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用，其中，所述苯系物降解菌FB1为绿蓝假单胞菌属(Pseudomonas viridilivida)，保藏编号为CCTCC No：M 2018347。所述筛选方法包括：从焦化厂周边污染土壤样品中，经富集、驯化、分离和纯化后得到。本发明通过从焦化厂周围苯系物污染的农田中提取土壤，并从中筛选出苯系物降解菌FB1，通过上述苯系物降解菌FB1对受到苯系物污染的土壤进行生物降解，达到土壤净化和修复的效果。且该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。

Description

苯系物降解菌FB1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用

技术领域

本发明涉及土壤和水体的生物降解处理技术领域，具体地，涉及苯系物降解菌FB1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用。

背景技术

苯、甲苯、乙苯和二甲苯的三种同分异构体统称为苯系物，是环境中重要的挥发性有机污染物。苯系物属于单环芳香烃类物质，主要存在于原油和石油产品中，也作为工业原料被广泛应用。进入环境中的苯系物会造成以下的影响：(1)苯系物具有挥发性，容易进入大气，参与光化学反应，促进臭氧生成，进一步加剧光化学烟雾的形成；(2)苯系物的水溶性较低，进入水体中会在水体表面形成一层薄膜，影响水体的水气交换，进而对水体动植物产生影响；(3)进入土壤的苯系物，会堵着土壤的孔隙和改变土壤的理化性质，进而对土壤的耕作能力和土壤中生物体产生影响；(4)苯系物对人体具有“三致”作用以及动植物具有毒害作用。因此，环境中苯系物污染已经引起人类的关注。

随着化工企业的发展，化工企业含苯系物的废水排放和污水灌溉，造成土壤和水体苯系物污染越来越严重。同时，随着时间的推移，早期建设的地下储油库和石油运输管道已经出现泄漏情况，进一步加剧了土壤的苯系物污染。相比石油中其他组分，苯系物的水溶性更强，它可以随着水体的地表径流和渗透造成地表水体和地下水体的苯系物污染。因此，苯系物污染的土壤和水体治理是石油化工行业待解决的关键问题。

对苯系物污染的土壤和水体的处理，分为化学、物理和生物处理方法。其中，物理法不改变污染物质的化学性质，只能对污染起到转移作用，处理效率很低，往往需要化学和生物法的共同作用才能达到处理效果。化学法是通过化学反应对污染物进行分解转化，投药量大，耗能多，同时会产生对环境有负面影响的化学物质。

而现有技术中针对苯系物的生物处理方法往往很少，且处理效果往往不能达到预期的效果，并且处理过程往往较为复杂，同时会使得在处理后仍然有大量的苯系物残留。

因此，提供一种处理过程简单，能对苯系物污染的土壤和水体进行生物降解处理，转化为无害的物质排放到环境中，无有害物质的额外排放，对环境的负面影响最低，安全、经济、高效、无二次污染、不需要大型设备、操作简单，且降解率高的苯系物降解菌FB1及其筛选方法是本发明亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中对苯系物处理方法所存在的处理效率低、对环境产生其他负面影响等问题，从而提供一种处理过程简单，能对苯系物污染的土壤和水体进行生物降解处理，转化为无害的物质排放到环境中，无有害物质的额外排放，对环境的负面影响最低，安全、经济、高效、无二次污染、不需要大型设备、操作简单，且降解率高的苯系物降解菌FB1及其筛选方法和在降解苯系物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种苯系物降解菌FB1，其中，所述苯系物降解菌FB1为绿蓝假单胞菌属(Pseudomonas viridilivida)，保藏编号为CCTCC No：M 2018347。

本发明还提供了一种根据上述所述的苯系物降解菌FB1的筛选方法，其中，所述筛选方法包括：从焦化厂周边污染土壤样品中，经富集、驯化、分离和纯化后得到。

本发明还提供了一种根据上述所述的苯系物降解菌FB1在降解苯系物中的应用。

通过上述技术方案，本发明通过从焦化厂周围苯系物污染的农田中提取土壤，并从中筛选出苯系物降解菌FB1，通过上述苯系物降解菌FB1对受到苯系物污染的土壤进行生物降解，达到土壤净化和修复的效果。且该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。所述苯系物降解菌FB1的保藏单位为中国典型培养物保藏中心(地址为中国.武汉.武汉大学)，保藏日期为2018年06月05日，分类命名为Pseudomonasviridilivida FB1。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明中提供的一种苯系物降解菌FB1的涂布培养图；

图2A是本发明中提供的一种苯系物降解菌FB1的透射电镜图；

图2B是本发明中提供的一种苯系物降解菌FB1的另一透射电镜图；

图3是本发明中提供的一种苯系物降解菌FB1的biolog鉴定结果图；

图4是本发明中提供的一种苯系物降解菌FB1的系统发育树。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种苯系物降解菌FB1，其中，所述苯系物降解菌FB1为绿蓝假单胞菌属(Pseudomonas viridilivida)，保藏编号为CCTCC No：M 2018347。

本发明还提供了一种根据上述所述的苯系物降解菌FB1的筛选方法，其中，所述筛选方法包括：从焦化厂周边污染土壤样品中，经富集、驯化、分离和纯化后得到。

这里的筛选方法可以根据实际需要进行选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述筛选方法包括：

1)液体培养基的制备：将基础培养基、微量元素混合液和苯系物混合液混合，制得液体培养基；

2)富集和驯化：取焦化厂周边污染土壤样品加入部分步骤1)中制得的液体培养基中进行混合，制得第一混合液；再将第一混合液转移至另一部分步骤1)中制得的液体培养基中，制得第二混合液；将第二混合液转接并进行驯化培养，制得驯化后的菌液；

3)分离和纯化：将驯化后的菌液稀释后培养，得到苯系物降解菌FB1。

进一步地，这里的焦化厂周边污染土壤样品与部分步骤1)中制得的液体培养基的用量可以根据实际需要进行调节，例如，可以8-25g土壤样品加入1L的液体培养基中。同样地，第一混合液转移至液体培养基这一过程中，二者的用量也可以根据实际需要进行调节，例如，在第一混合液转移至液体培养基这一过程中，第一混合液与液体培养基的体积比可以为0.5-1.5:10。当然，本发明并不局限于此。

这里的驯化培养条件可以根据实际选择，例如，可以置于温度为30℃，摇床转速为150r/min的条件下进行驯化培养，且7-9天转接一次进行驯化培养，共转接7-8次。当然，本发明并不局限于此。

当然，这里的液体培养基中基础培养基、微量元素混合液和苯系物混合液可以根据本领域技术人员所公知的方式进行制备，例如，一种优选的实施方式中，步骤1)中，所述基础培养基至少包括硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化铵；所述微量元素混合液至少包括硫酸锌、氯化镁、氯化铁、硫酸铜和氯化钙；所述苯系物混合液至少包括苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、邻二甲苯和间二甲苯。

更进一步地，这里的分离和纯化过程中，对菌液进行稀释的过程可以由本领域技术人员根据本领域常规使用的方式进行操作，例如，可以将驯化后的菌液与蒸馏水按照1:9的体积比进行混合稀释，并且在每次稀释后再取1体积份稀释后的菌液与9体积份的蒸馏水进行多次稀释，从而使得其稀释浓度为原先驯化后的菌液的10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、，再将上述五个梯度的菌液各取100μL加入到以苯系物为唯一碳源的无机盐固体培养基(这里的无机盐固体培养基可以为本领域常规使用的类型，例如，这里的无机盐固体培养基可以为上述液体培养基中的基础培养基、微量元素混合液加入琼脂进行混合即可)上，用涂布棒涂布均匀后，再置于30℃的培养箱中培养7-9天，而后用接种环挑取长出的单菌落放入以苯系物为唯一碳源的无机盐培养基中培养7-9天，再结合平板划线法，重复上述操作3-5次即可获得苯系物降解菌FB1菌株。

进一步地，还可以在分离纯化后对获得的苯系物降解菌FB1菌株进行PCR扩增和Biolog鉴定。这里的PCR扩增可以为对菌株的16S rDNA基因进行扩增。PCR过程中的扩增引物可以选用本领域常规使用的引物对，例如，可以为细菌16S rDNA基因常规使用的通用引物对，具体如下：

上游引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

当然，这里的PCR扩增过程可以根据本领域常规使用的方式进行操作。

例如，整个扩增体系为：

DNA模板(浓度为20-50ng/μL)：0.5μL

10×Buffer：2.5μL

dNTP：1μL

Taq酶：0.2μL

引物(浓度为10μmol/L)：各0.5μL

双蒸水：19.8μL

PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环，72℃修复延伸10min。

这里DNA模板的提取可以按照本领域常规的总DNA的提取，在此不多作赘述。

这里的Biolog鉴定过程可以按照本领域技术人员常规能够理解的方式进行操作。例如，可以为：采用划线分离的方法将FB1菌株在Biolog专用培养基(BUG)上纯化两代，33℃培养获得纯培养物。将分离后的纯种用棉签挑到接种液IF-A中，浊度计测得的菌悬液浓度在92％～98％T为合适，随后按每孔100μL的量加到GenⅢ板孵育16h(33℃)后开始读板。

本发明还提供了一种根据上述所述的苯系物降解菌FB1在降解苯系物中的应用。

一种优选的实施方式中，所述应用包括：在无机盐培养基中加入苯系物和菌液后，于温度为25-35℃，摇床转速为120-180r/min的条件下培养；其中，所述菌液中苯系物降解菌FB1的含量为5×10⁷-4×10⁸cfu/mL。

当然，这里的无机盐培养基可以为本领域技术人员常规使用的无机盐液体培养基，在此不多作赘述。

进一步优选的实施方式中，所述无机盐培养基和所述菌液的用量的体积比为100:0.8-1.2。

一种更为优选的实施方式中，所述苯系物至少包括苯、甲苯和乙苯中的至少一种，且相对于1L的所述无机盐培养基，所述苯的含量为180-220mg，所述甲苯的含量为180-220mg，所述乙苯的含量为180-220mg。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。液体培养基：向体积为1L的烧杯中加入1L基础培养基、100μL微量元素混合液，摇匀；向250mL血清瓶中加入上述混合后的培养基100mL，将血清瓶用透气封口膜密封，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，灭菌结束后取出血清瓶，放入无菌操作台，打开紫外灯灭菌10min；灭菌后加入苯系物混合液(各1000mg/L)作为唯一碳源，血清瓶封口作为液体培养基备用；

其中基础培养基中各物质的浓度为：MgSO₄·7H₂O：0.7g/L，KCl：0.7g/L，Na₂HPO₄·12H₂O：2.13g/L，KH₂PO₄：1.08g/L，NH₄Cl：2.13g/L，余量为水；

微量元素混合液中各物质的浓度为：ZnSO₄·7H₂O：0.1mg/L，MgCl₂·4H₂O：0.005mg/L，FeCl₃·6H₂O：0.1mg/L，CuSO₄·5H₂O：0.005mg/L，CaCl₂：0.002mg/L，余量为水；

苯系物混合液组成为：经0.22μm微孔滤膜过滤的苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯(1:1:1:1:1:1)，即相对于1L的所述苯系物混合液，苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯的含量各自为1000mg。

无机盐培养基：1L基础培养基、100μL微量元素混合液，摇匀并灭菌。

无机盐固体培养基：1L基础培养基、100μL微量元素混合液，摇匀后，添加18g琼脂混合灭菌。

实施例

富集和驯化：在焦化厂旁边的污染区域收集土壤，取10g土壤加入液体培养基中，摇匀后制得第一混合液，而后将上述第一混合液与液体培养基按照1:10的体积比接种至液体培养基中；于25℃，150r/min的条件下，每8天转接一次进行驯化培养，共转接7次(培养过程中使用250mL的血清瓶，采用专用瓶盖密封，防止苯系物挥发)；

分离和纯化：取上述驯化后的菌液1mL加入到9mL蒸馏水中，菌液浓度记作10^-1；然后从浓度为10^-1的菌液中取1mL，加入到9mL蒸馏水中，菌液浓度记作10^-2；依次稀释直到得到10^-7的菌液，取10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7菌液各100μL加入到以苯系物为唯一碳源的无机盐固体培养基上，用涂布棒涂布均匀后，放在30℃的恒温培养箱中培养8天，观察菌群在平板上的生长情况。用接种环挑取长出的单菌落放入以苯系物为唯一碳源的无机盐培养基中培养8天，再结合平板划线法，重复上述操作4次获得一株降解苯系物的纯菌株，即为苯系物降解菌FB1。

测试例

将实施例中得到的苯系物降解菌FB1进行扩增，其中，

上游引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

整个扩增体系为：

DNA模板(浓度为20-50ng/μL)：0.5μL

10×Buffer：2.5μL

dNTP：1μL

Taq酶：0.2μL

引物(浓度为10μmol/L)：各0.5μL

双蒸水：19.8μL

PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环，72℃修复延伸10min。

扩增后的产物采用DNA纯化试剂盒纯化回收后采用1.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

将扩增并纯化后的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，根据测序结果，将序列进行同源性比对分析，采用MEGA 5.05软件以Neighbor-joining统计方法自展1000次进行系统发育树的构建。根据比对分析结果，确定该菌株FB1为假单胞菌属(Pseudomonas sp)。

将在Biolog专用培养基(BUG)上纯化两代的纯菌株FB1用棉签挑到接种液IF-A中，浊度计测得的菌悬液浓度在92％～98％T为合适，随后按每孔100μL的量加到GenⅢ板孵育16h(33℃)后开始读板。菌株FB1鉴定为绿蓝假单胞菌(Pseudomonas viridilivide)，SIM＝0.575，DIST＝6.238。

应用例1

在50mL血清瓶中加入10mL无机盐培养基和无机盐培养基体积1％的菌液(菌液中实施例中得到的苯系物降解菌FB1的含量为2×10⁶cfu/mL)，分别做三组(每组三个平行)，再向上述三组血清瓶中各自加入苯、甲苯、乙苯(分别为200mg/L)作为唯一碳源(即第一组血清瓶中加入苯，第二组血清瓶中加入甲苯，第三组血清瓶中加入乙苯，且加入的苯、甲苯、乙苯使得其各自在各自的血清瓶中的浓度为200mg/L)，于30℃，150r/min下培养，每隔6h取样一次，分别检测上述三个血清瓶中各自加入的苯、甲苯、乙苯的浓度，直到苯系物可视为被完全降解。

数据显示，最终苯在30h内降解率达到99.5％，甲苯在18h内降解率达到100％，乙苯在48h内降解率达到99.7％。明显可知，该菌对苯系物有高效的降解效率。

应用例2

在500mL血清瓶中，加入200g风干土壤和无机盐溶液调节土壤含水率至40％，加入苯系物混合体系(每种碳源浓度都为200mg/kg)。在25℃条件下培养4天，取土壤样品，用HS-GC-MS测土壤中苯系物的含量。

数据显示，4天后苯的降解率达47.4％，甲苯的降解率达56.4％，乙苯的降解率达57.3％，邻二甲苯的降解率达51.4％，间二甲苯和对二甲苯的降解率达52.4％(实验中制备间二甲苯和对二甲苯时往往产物二者皆有，且不容易分离，因而这里对于间二甲苯和对二甲苯的检测是对其二者的混合物进行检测)。结果表明，分离纯化出的苯系物降解菌菌株FB1能够对受污染土壤中的苯系物进行有效的降解，达到一定土壤净化和修复的效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一种苯系物降解菌FB1，其特征在于，所述苯系物降解菌FB1为绿蓝假单胞菌属(Pseudomonas viridilivida)，保藏编号为CCTCC No：M 2018347。

2.一种根据权利要求1所述的苯系物降解菌FB1在降解苯、甲苯、乙苯和二甲苯中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述应用包括：在无机盐培养基中加入苯系物和菌液后，于温度为25-35℃，摇床转速为120-180r/min的条件下培养；其中，

所述菌液中苯系物降解菌FB1的含量为5×10⁷-4×10⁸cfu/mL。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述无机盐培养基和所述菌液的用量的体积比为100:0.8-1.2。

5.根据权利要求3所述的应用，其中，所述苯系物至少包括苯、甲苯和乙苯中的至少一种，且相对于1L的所述无机盐培养基，所述苯的含量为180-220mg，所述甲苯的含量为180-220mg，所述乙苯的含量为180-220mg。

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