CN103772496B - 植物含糖量相关蛋白sps及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物含糖量相关蛋白SPS及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物含糖量相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述SPS基因导入目的植物中，得到含糖量高于所述目的植物的转基因植物。本发明对于制糖业具有重大价值。对植物生物质乙醇燃料的开发将有助于解决能源替代问题。提高植物体内的含糖量可增加生物乙醇的合成量，同时降低乙醇燃料的成本，因此本发明对于植物生物质乙醇燃料的生产也具有重大价值。

Description

植物含糖量相关蛋白SPS及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种植物含糖量相关蛋白SPS及其编码基因和应用。
背景技术
糖类物质是多羟基(2个或以上)的醛类(aldehyde)或酮类(Ketone)化合物，在水解后能变成以上两者之一的有机化合物。在化学上，由于其由碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”聚合，故又称之为碳水化合物。经过建国以来五十多年、特别是改革开放以来的建设，中国糖业获得了巨大的发展。全国糖料播种面积由1949年186.2万亩扩大到2003年2485.5万亩。其中，甘蔗从162.3万亩增加到2113.5万亩，甜菜从23.9万亩增加到372万亩。甜菜，（Beta vulgaris），又名菾菜，二年生草本植物，主要含蔗糖。
蔗糖是人类基本的食品添加剂之一，已有几千年的历史。是光合作用的主要产物，广泛分布于植物体内。蔗糖是一种双糖，是由1个分子的葡萄糖和1个分子的果糖组成的。蔗糖是从糖料作物甜菜或甘蔗中提取出来的。几百年来，蔗糖对人类的营养和健康起了重要的作用。人类享受着蔗糖的甜美及利用蔗糖为添加剂生产出来的食品，还应用着以蔗糖为原料生产出的成百上千种的生活物质（酒精、酵母、柠檬酸、乳酸、甘油、醇类、药品等）。
狼尾草，拉丁名为Pennisetum alopecuroides(L.)Spreng，禾本科狼尾草属，为一年生或多年生草本，分布在热带、亚热带地区。狼尾草生长速度快、分蘖多、生物量高，可生长在贫瘠、沙化、盐碱的土地上，因此种植狼尾草既不占用良田，又可以达到保护环境、改良土壤等效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物含糖量相关蛋白SPS及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来自于狼尾草，命名为SPS蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物含糖量相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述SPS蛋白的基因（命名为SPS基因）也属于本发明的保护范围。
所述SPS基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第9-3221位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物含糖量相关蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物含糖量相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述SPS基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
所述重组载体具体可为将所述SPS基因插入植物表达载体pCAMBIA2301的多克隆位点（如BamHI和Sacl酶切位点之间）得到的重组质粒。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述SPS基因导入目的植物中，得到含糖量高于所述目的植物的转基因植物。所述SPS基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述SPS基因具体可通过所述重组质粒导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为甜菜，如甜菜DF1031品系。所述含糖量具体可为植物根部的含糖量。对于甜菜来说，所述含糖量具体可为块根的含糖量。
本发明还保护所述SPS蛋白、所述SPS基因或所述重组载体在培育含糖量提高的转基因植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为甜菜，如甜菜DF1031品系。所述含糖量具体可为植物根部的含糖量。对于甜菜来说，所述含糖量具体可为块根的含糖量。
本发明对于制糖业具有重大价值。
对植物生物质乙醇燃料的开发将有助于解决能源替代问题。提高植物体内的含糖量可增加生物乙醇的合成量，同时降低乙醇燃料的成本，因此本发明对于植物生物质乙醇燃料的生产也具有重大价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的甜菜均为甜菜DF1031品系。
甜菜DF1031品系：王晓娇、孙亚卿、李国龙、温丽、张少英，农杆菌介导AVP1基因转化甜菜，《分子植物育种》，2011年03期。
植物表达载体pCAMBIA2301：吕申超、汪海涛、鱼斌、孟卫卫、曹树青，拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建，《合肥工业大学学报(自然科学版)》，2012年01期。
根癌农杆菌LBA4404：邹智、吴刚、卢长明，影响农杆菌转化效率的植物因子H2A1基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建，生物技术通报，2007年06期。
实施例1、狼尾草SPS蛋白及其编码基因的获得
1、提取狼尾草的总RNA并反转录为cDNA。
2、对其它物种中具有类似功能的基因进行比对和分析，得出保守区域，然后基于保守区域设计引物，以步骤1得到的cDNA为模板进行PCR扩增，得到1408bp的核心片段。
3、进行两次同源克隆，分别得到5'末端的两个片段（1500bp的片段和600bp的片段）。
4、进行3'RACE，得到650bp的片段。
5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的各个片段进行拼接，然后基于拼接的序列设计引物。
6、以步骤1得到的cDNA为模板，采用步骤5设计的引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物测序，测序结果与拼接序列一致，如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为SPS蛋白。将编码SPS蛋白的基因命名为SPS基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第9-3221位核苷酸所示。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
一、构建重组质粒
人工合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并将其插入植物表达载体pCAMBIA2301的BamHI和Sacl酶切位点之间，得到重组质粒pCAMBIA2301-SPS。
二、制备转基因植物
1、将重组质粒pCAMBIA2301-SPS导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
2、用步骤1得到的重组农杆菌的菌悬液浸泡侵染甜菜DF1031品系的叶柄外植体，在含25mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行抗性筛选，然后依次进行分化和生根，得到再生植株。
分化培养基：MS基本培养基＋6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）3mg/L＋酸水解酪蛋白（CH）0.1g/L＋植物凝胶（phytagel）3.6g/L。
生根培养基：MS基本培养基＋植物凝胶phytagel3g/L。
3、取再生植株的叶片，提取基因组DNA并进行PCR鉴定（采用F1和R1组成的引物对，靶序列约343bp），对于某一植株来说，如果其PCR鉴定阳性，该植株为转基因植株。
F1：5’-CGTGAACTTCAACCCCACGCACT-3’；
R1：5’-GTTCCTCTGGAACTTCTTCTT-3’。
三、制备转空载体植株
用植物表达载体pCAMBIA2301代替重组质粒pCAMBIA2301-SPS，其它同步骤二，得到转空载体植株。
四、含糖量检测
采用手持糖量计分别检测步骤二得到的转基因植株（30株）、步骤三得到的转空载体植株（20株）和甜菜DF1031品系（30株）的块根的含糖量。步骤二得到的转基因植株的含糖量为20.59%±1.03%（平均值±标准差），步骤三得到的转空载体植株的含糖量为16.21%±0.98%（平均值±标准差），甜菜DF1031品系的含糖量为15.97%±1.15%（平均值±标准差）。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第9-3221位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体或重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到含糖量高于所述目的植物的转基因植物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为甜菜。
8.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体在培育含糖量提高的转基因植物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为甜菜。
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无机焦磷酸化酶基因转化甘蔗的遗传研究;赵丽宏等;《生物技术通报》;20091231(第9期);第73-77页 *

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