CN109196100A - 增强植物特性的方法及无核果实的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种不采用转基因技术，增强植物特性的新技术。通过将植物组织冻结的冻结步骤、将冻结的植物组织解冻的解冻步骤、以及从解冻的植物组织中发育出植物的发育步骤对植物进行处理。

Description

增强植物特性的方法及无核果实的生产方法
技术领域
本发明涉及一种不依赖于基因操作而增强植物特性的方法。本发明还涉及一种不依赖基因操作、化学处理而获得无核果实的技术。
背景技术
自古以来，人类便通过品种改良的方法培育出具有优异性质的植物。以往的品种改良方法为了使植物具有某些特性常要花费很长的时间，后来由于世代促进技术的出现，缩短固着特性所需时间成为可能。但是即使采用世代促进技术，仍然存在使植物固着某些特性需要数年时间的问题。为此，目前正在开发不需要固着步骤的花药培养等生物技术。
另外，已知转基因技术作为培育具有优异特性的植物的方法。通过转基因技术，能够培育出除草剂耐性农作物、抗害虫性农作物、抗病性农作物、高保存性农作物等。
另一方面，提出了通过实施某种特定的处理诱导突变，从而增强植物特性的方法。例如，专利文献1公开了包含γ射线照射和染色体加倍处理步骤的付与耐寒性的品种改良方法。
另外，提出了在不改变基因序列的情况下，调控植物特性的方法。例如，专利文献2公开了在植物营养成长期，通过给予由栽培环境引起的盐胁迫、寡照胁迫、强光胁迫、干旱胁迫、高湿度胁迫、高温胁迫、低温胁迫、营养胁迫、重金属胁迫、病害胁迫、缺氧胁迫、臭氧胁迫、CO2胁迫、强风胁迫等胁迫处理，从而调控植物次世代开花时期的方法。
日本的大部分地区处于温带，北海道、东北地区等处于亚寒带(冷带)，因此目前对于在亚热带～热带地区栽培的、不适合在日本的气候下栽培的农作物主要依靠进口。
另外，果实一般是指在被子植物内部含有核的结构。因此，通常果实中含有核，人在食用果实的时候，需要去除作为不能食用的部分的核。但是去核的动作较繁杂。
鉴于这种问题，提出培育出没有核的果实的方法。而赤霉素处理法则作为典型的获取无核果实的方法(无核化)(专利文献3)。
还有，如一般在市面上流通的香蕉那样，通过对具有由突变而结出无核果实的性质的植株进行分株的方法来增产。
也有由于植物的种类不同不发生授粉，而自然结出无核果实的情况。
雌雄同体的木瓜种也作为这样的例子，若不发生授粉的话可能发生单性结实。但是，其效率非常低(5～10％左右)。
另外，由于两性种木瓜其雄花和雌花交替开花来进行自体授粉，因此，几乎不会发生单性结实。
还已知通过品种改良得到的单性结实的木瓜种(品种登记编号16161号)
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2006-25632号公报
专利文献2：特开2016-182094号公报
专利文献3：再表97/031536号公报
发明内容
如上所述，在亚热带～热带地区栽培的农作物，大部分不适合在温带～寒带环境中栽培，所以在温带～寒带地区需要进口这些农作物。但是，对于进口农作物来说，为了实现大规模栽培，大量使用农药，或为了进口有时进行熏蒸等化学处理，所以有很多对人体有害的物质。另一方面，没有进行这样处理的农作物，价格高，大多数情况下不能轻松购买。
基于这种情况，希望开发将亚热带～热带地区栽培的农作物，能够在温度低的温带～寒带地区培育的技术。
另外，根据植物种类不同，从播种至收获需要数年时间的较多，所以关于这类植物的栽培，在投资回收方面产生相关课题。
基于这样的问题，希望开发促进植物生长速度的技术。
如上所述，希望开发增强植物的生长速度以及耐寒性的技术。作为解决方案，采用品种改良方法存在达到目的所需时间过长的问题、花药培养技术存在植物种间的栽培难易程度不同的问题、转基因技术有基因源的污染问题、突变诱导方法有达到目的的不可靠性高等问题。
目前还没有在不改变基因序列的情况下，增强植物的生长速度和环境适应特性的技术。
鉴于这样的问题，本发明想要解决的第1课题在于提供一种在不进行转基因操作的情况下，增强植物特性的新技术。
另外，如上所述，在不进行授粉的情况下，木瓜虽然能得到单性结实，但其效率非常低。
品种改良能够作为用于得到结出无核果实的木瓜的方法，但需要非常长的时间，并且可靠性也低。
另外，还有进行赤霉素等的化学处理的方法，但有化学物质残留等的问题，因此并非优选。
鉴于这样的问题，本发明想要解决的第2课题在于提供一种得到木瓜的无核果实的新技术。
为解决课题的技术方案
为了解决上述第1课题，本发明提供一种增强植物特性的方法，包括：将植物组织冻结的冻结步骤；将冻结的植物组织解冻的解冻步骤；由解冻的植物组织发育出植物的发育步骤。
采用本发明的特性增强方法，尤其能够增强植物的生长特性和/或耐寒性。
还有，在本发明优选的技术方案中，在所述冻结步骤中，冻结时的最低温度为-20℃以下。冻结时的温度设定为-20℃以下，能够进一步增强植物的特性。
在本发明优选的技术方案中，在所述冻结步骤中，以小于0.5℃/日的速度来降温，冻结所述植物组织。如此缓慢降低温度，能够提高冻结步骤后的植物组织的生存率，进而提高本发明方法的效率。
在本发明优选的技术方案中，所述冻结步骤的期间为180天以上。经过上述期间来冻结植物组织，能够提高植物特性的增强效果。
在本发明优选的技术方案中，在所述冻结步骤中，在浸泡于糖类水溶液中的状态下冻结所述植物组织。通过这种方式，能够提高解冻步骤后的植物组织的生存率，进而提高本发明方法的效率。
在本发明优选的技术方案中，所述糖类为海藻糖。通过使用海藻糖，能够进一步提高解冻步骤后的植物组织的生存率。
为了解决上述第2课题，本发明提供一种木瓜科植物的无核果实的生产方法，包括：将木瓜科植物的植物组织冻结的冻结步骤；将冻结的植物组织解冻的解冻步骤；由解冻的植物组织发育出植物的发育步骤；培育由发育步骤得到的植物的第1培育步骤。
采用本发明的生产方法，相对于品种改良短期、且不进行赤霉素处理等的化学处理，能够高效率地得到木瓜科植物的无核果实。
在本发明优选的技术方案中，在没有生物传播花粉的环境下进行所述第1培育步骤。不发生昆虫等传播的授粉，因此，能够非常高效地得到无核果实。
在本发明优选的技术方案中，包括：采集通过所述第1培育步骤培育出的植物的植物组织，进行组织培养的培养步骤；以及培育通过培养步骤得到的植物的第2培育步骤。
通过第1培育步骤得到的植物也结出无核果实，但经过培养步骤并通过第2培育步骤得到的植物，被确认为在结花蕾的阶段子房肥大，具有能够确认结出无核果实的特殊性质。并且，能够确认结果的花蕾占整体花蕾的90％左右。即，能够极高效地得到无核果实。
在本发明优选的技术方案中，所述第2培育步骤为露地栽培。
通过第2培育步骤得到的植物，采用常规的昆虫传播授粉的露地栽培，也能高效地结出无核果实。
在本发明优选的技术方案中，包含：观察在所述第2培育步骤的过程中发育出的花蕾，除去不能确认结果的花蕾的挑选步骤。
通过挑选步骤去除不能确认结果的花蕾，在结花蕾的阶段仅留下能够确认结果的花蕾，能够使结果的全部果实成为无核果实。
本发明还提供利用上述生产方法生产的无核果实。所涉及的无核果实与利用赤霉素等的药品而得到无核化的果实不同，不用担心残留物质，能够安心食用。
本发明还提供通过上述无核果实的生产方法中的第1培育步骤得到的结出无核果实的植物。所涉及的植物高效地结出无核果实。
本发明还提供通过上述无核果实的生产方法中的第2培育步骤得到的结出无核果实的植物。所涉及的植物，如上所述，被确认为在结花蕾的阶段子房肥大，具有能够确认结出无核果实的特殊性质。
本发明还提供采用上述的方法得到的特性增强的植物、由该植物得到的作为嫁接用接穗使用的植物组织以及其作为接穗嫁接得到的植物、及由这些植物得到的能够发育出独立于该植物的植物个体(除了种子)的植物组织。
本发明还提供一种植物特性增强基因的检索方法，包括：通过上述方法对植物进行处理的步骤；鉴定与未经过所述处理的植物相比较，在经过所述处理的植物中呈现高表达量的RNA的步骤。
本发明还提供一种植物特性增强因子的筛选方法，该方法包括如下步骤：与未经过上述方法处理的植物相比较，在经过该处理的植物中，呈现高表达量的RNA作为指标，当使用了被测物质的植物中的所述RNA的表达量高于未使用被测物质的植物中的所述RNA的表达量时，将该被测物质作为植物特性增强因子来筛选。
采用本发明，能够简便地筛选植物特性增强因子。
本发明的效果：
采用解决第1课题的发明，在不基于所需数年的品种改良方法以及转基因技术的情况下，能够获得特性增强的植物。尤其采用本发明，能够增强植物的生长特性和/或耐寒性。
采用解决第2课题的发明，能够高效地得到木瓜科植物的无核果实。
附图说明
图1是无核果实的生产方法的方案。
图2是进行了冻结、解冻处理的木瓜和未处理的木瓜发芽30天后的照片。
图3是进行了冻结、解冻处理的木瓜和未处理的木瓜发芽45天后的照片。
图4是进行了冻结、解冻处理的木瓜和未处理的木瓜发芽60天后的照片。
图5是进行了冻结、解冻处理的木瓜和未处理的木瓜发芽3个月后的照片。
图6是进行了冻结、解冻处理的木瓜和未处理的木瓜在收获期的照片。
图7是普通木瓜的花蕾和在第2培育步骤的过程中结果的木瓜的花蕾的比较照片。
图8是普通木瓜的花蕾的剖面和在第2培育步骤的过程中结果的木瓜的花蕾的剖面的比较照片。
图9是表示在栽培进行了冻结、解冻处理的菠萝和未处理的菠萝的过程中，随栽培时间观察到的状态的照片；最下面的照片为发芽一年后的菠萝。
图10是进行了冻结、解冻处理栽培的香蕉的照片。
图11是进行了冻结、解冻处理栽培的咖啡树的照片。
具体实施方式
特性增强方法：
本发明的特性增强方法，对于适用范围不予特别限定，可适用于所有的植物种。例如，可适用于属于番木瓜科(Caricaceae)、凤梨科(Brome-liaceae)、芭蕉科(Musaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、桑科(Moraceae)、锦葵科(Malvaceae)、茜草科(Rubiaceae)、樟科(Lauraceae)、西番莲科(Passifloraceae)、无患子科(Sapindaceae)、金丝桃科(Clusiaceae)、柿树科(Ebenaceae)、芸香科(Rutaceae)、番荔枝科(Annonaceae)、棕榈科(Arecaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、蔷薇科(Rosaceae)的植物等。
具体的，可适用于属于番木瓜属(Carica)、凤梨属(Ananas)、芭蕉属(Musa)、罗汉果属(Siraitia)、番石榴属(Psidium)、阳桃属(Averrhoa)、榕属(Ficus)、可可属(Theobroma)、咖啡属(Coffea)、樟属(Cinnamomum)、西番莲属(Passiflora)、荔枝属(litchi)、藤黄属(Garcinia)、柿树属(Diospyros)、香肉果属(Casimiroa)、番荔枝属(Annona)、椰枣属(phoenix)、量天尺属(Hylocereus)、樱属(Cerasus)的植物等。
本发明的特性增强方法，包括将植物组织冻结的冻结步骤。
用于冻结步骤的植物组织，优选为由植物获得的能够发育出独立于该植物的植物个体的植物组织。
植物具有全能性，所以无论植物的哪一部分都可以为“由植物获得的能够发育出独立于该植物的植物个体的植物组织”，具体的，可以为植物的种子、根、芽、茎、叶、花瓣等，优选为种子、根以及芽。
这些组织用于冻结步骤时，可以直接冻结，也可以切除一部分以切片的形式冻结。
在冻结步骤中，优选在将植物组织浸泡在液体的状态下冻结。作为浸泡植物组织的液体，优选使用DMSO(二甲基亚砜)、甘油、乙二醇、糖类等的水溶液制备而成的抗冻害剂。其中，优选为糖类水溶液，更优选为海藻糖水溶液。
在冻结步骤中，冻结时的最低温度的上限优选为-20℃以下，更优选为-30℃以下，更优选为-40℃以下，更优选为-50℃以下，最优选为-55℃以下。
还有，冻结时的最低温度的下限优选为-200℃以上，更优选为-150℃以上，更优选为-100℃以上，更优选为-80℃以上，更优选为-70℃以上，最优选为-65℃以上。
在冻结步骤中，并不急速降温至冻结时的最低温度，而是缓慢降低温度为好。从解冻后的生存率的角度来看，降温速度优选为0.8℃/日以下，更优选为0.6℃/日以下，更优选为0.5℃/日以下，更优选为0.3℃/日以下，更优选为0.2℃/日以下，最优选为0.1℃/日以下。
这样在缓慢降低温度时，在冻结步骤中优选使用程序降温仪。
冻结步骤的期间的下限优选100天以上，更优选120天以上，更优选150天以上，更优选160天以上，最优选180天以上。
其中，“冻结步骤的期间”是指从开始降低植物组织温度的时间点到开始解冻步骤为止的期间。
对于解冻步骤中的解冻方法不给予特别限定。可以将冻结状态的植物组织放置在常温中，使其自然解冻，也可以将冻结状态的植物组织用流水冲洗，使其解冻。
本发明的特性增强方法，包括由采用上述方法解冻的植物组织发育出植物的发育步骤。
在冻结步骤和解冻步骤中使用的植物组织为植物的种子时，能够将其用常规的方法播种，进而使其发育出植物个体。
在冻结步骤和解冻步骤中使用的植物组织为种子以外的植物部位时，可以将其直接转移至土壤或培养基中使其发芽，也可以将该植物部位切成小块，按照常规方法进行细胞培养，经过愈伤组织诱导、不定胚诱导、不定芽诱导等方式发育出植物个体。
经过上述的冻结步骤、解冻步骤以及发育步骤发育出的植物，其特性被增强。
具体的，采用本发明的特性增强方法，能够显著增强植物的生长速度以及耐寒性。
即，即使只能在热带～亚热带地区栽培的植物，通过采用本发明的特性增强方法，能够在温带～寒带地区栽培。
以作为霉菌的一种的香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)为病原体的香蕉传染病-新巴拿马病，对马来西亚、菲律宾、台湾以及非洲等多国的香蕉栽培带来了损害，而近年其灾害扩大到中国、印尼、澳大利亚、约旦、莫桑比克、中美洲等多国。
该霉菌主要在亚热带～热带地区带来传染灾害，而在温带～寒带地区，因为脱离了最适的温度，因此不会扩大到这些地区。
因此，通过本发明的特性增强方法增强香蕉的耐寒性，并将其栽培在温带～寒带地区，能够不受新巴拿马病的威胁，稳定提供香蕉。
另外，采用本发明的特性增强方法的一优选技术方案，能够增强植物的耐暑性、高地适应特性以及低地适应特性等环境适应性。即，采用本发明的特性增强方法，即使是只能在温带～寒带地区栽培的植物，也能够适应在热带～亚热带地区的栽培，或使在高地栽培的植物，能够适应在低地的栽培，反之也可以。
还有，采用本发明的特性增强方法的一优选技术方案，还能够增强植物的丰产性、抗病害虫性和抗腐根性等。
本发明的特性增强方法还能够包括筛选步骤。
即，作为植物组织使用种子时，取多个种子进行冻结步骤、解冻步骤、发育步骤，并对经处理后的每一个种子进行发芽以及栽培，再从中筛选出具有优异特性的植株。
还有，作为植物组织使用种子以外的植物部位时，进行冻结步骤、解冻步骤以及发育步骤后，从发育出的多个芽、愈伤组织、不定胚以及不定芽中培育出植物个体，再从这些植物个体中筛选出具有优异特性的植株。
由实施本发明的特性增强方法的植物中，以有性生殖以外的方法得到的次世代植物能够遗传增强的特性。因此，若能够通过本发明的特性增强方法获得特性增强的植物，那么从该植物得到的且能够发育出独立于该植物的植物个体的种子以外的植物组织(子株)中发育出的次世代以后的植株也具有该增强的特性。
还有，实施本发明的特性增强方法的植物，作为嫁接用接穂使用时，也能发挥增强的特性。
采用了本发明的特性增强方法的处理的植物，与未采用相同处理的植物相比较，其植物细胞内的RNA表达量显著增加。可以认为该RNA表达量的显著增加是特性增强的主要原因。即，可以认为通过应用本发明的特性增强方法而在植物细胞内表达量增加的RNA的编码基因是该植物特性的增强基因。
因此，通过分析和鉴定实施本发明的特性增强方法后在植物细胞内表达量增加的RNA，可以进行植物特性的增强基因的检索。
即，本发明还提供植物特性的增强基因的检索方法，该检索方法包括：采用本发明所述的特性增强方法对植物进行处理的步骤；以及鉴定与未经过所述处理的植物相比较，在经过所述处理的植物中呈现高表达量的RNA的步骤。
对于本发明的检索方法中的鉴定RNA的步骤，能够采用常规方法进行。例如，能够利用基因芯片、RNA测序等转录组分析方法来鉴定在采用本发明特性增强方法处理的植物中呈现高表达量的RNA。
如上所述，实施本发明特性增强方法的植物中表达量上升的RNA为特性增强的主要原因，从而将该RNA作为指标时，能够筛选出植物的特性增强因子。
即，本发明还提供特性增强因子的筛选方法，该方法具体为：在使用了被测物质的植物中的所述RNA的表达量高于未使用被测物质的植物中的所述RNA的表达量时，将该被测物质作为植物特性增强因子来筛选。
作为植物的特性增强的主要原因的RNA的表达量的确认，能够由Nouthern印迹法、实时定量荧光PCR等常规方法来进行。
无核果实的生产方法：
以下，参照图1，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明的无核果实的生产方法能够适用于属于Cylicomorpha属、Carica(木瓜)属、Horovitzia属、Jarilla属、Jacaratia属、Vasconcellea属等木瓜科(Caricaceae)的植物。具体的，能够适用于属于木瓜属(Carica)的植物、更具体的，能够适用于木瓜(Caricapapaya L)。
本发明的无核果实的生产方法包括：冻结植物组织的冻结步骤S11。
作为用于冻结步骤S11的植物组织，优选为由植物获得的能够发育出独立于该植物的植物个体的植物组织。
植物具有全能性，所以无论植物的哪一部分都可以为“由植物获得的能够发育出独立于该植物的植物个体的植物组织”，具体的，可以为植物的种子、根、芽、茎、叶、花瓣等，优选为种子、根以及芽，更优选为种子。
这些组织用于冻结步骤S11时，可以直接冻结，也可以切除一部分以切片的形式冻结。
在冻结步骤S11中，优选在将植物组织浸泡在液体的状态下冻结。作为浸泡植物组织的液体，优选使用DMSO(二甲基亚砜)、甘油、乙二醇、糖类等的水溶液制备而成的抗冻害剂。其中，优选为糖类水溶液，更优选为海藻糖水溶液。
在冻结步骤S11中，冻结时的最低温度的上限优选为-20℃以下，更优选为-30℃以下，更优选为-40℃以下，更优选为-50℃以下，最优选为-55℃以下。
还有，冻结时的最低温度的下限优选为-200℃以上，更优选为-150℃以上，更优选为-100℃以上，更优选为-80℃以上，更优选为-70℃以上，最优选为-65℃以上。
在冻结步骤S11中，并不急速降温至冻结时的最低温度，而是缓慢降低温度为好。从解冻后的生存率的角度来看，降温速度优选为0.8℃/日以下，更优选为0.6℃/日以下，更优选为0.5℃/日以下，更优选为0.3℃/日以下，更优选为0.2℃/日以下，最优选为0.1℃/日以下。
这样在缓慢降低温度的情况下，在冻结步骤S11中优选使用程序降温仪。
冻结步骤S11的期间的下限优选100天以上，更优选120天以上，更优选150天以上，更优选160天以上，最优选180天以上。
其中，“冻结步骤S11的期间”是指从开始降低植物组织温度的时间点到开始解冻步骤S12为止的期间。
对于解冻步骤S12中的解冻方法不给予特别限定。可以将冻结状态的植物组织放置在常温中，使其自然解冻，也可以将冻结状态的植物组织用流水冲洗，使其解冻。
本发明的无核果实的生产方法，包括由采用上述方法解冻的植物组织发育出植物的发育步骤S13。
用于冻结步骤S11和解冻步骤S12中的植物组织为植物的种子时，能够将其用常规的方法播种，进而使其发育出植物个体。
用于冻结步骤S11和解冻步骤S12中的植物组织为种子以外的植物部位时，可以将其直接转移至土壤或培养基中使其发芽，也可以将该植物部位切成小块，按照常规方法进行细胞培养，经过愈伤组织诱导、不定胚诱导、不定芽诱导等方式发育出植物个体。
将由发育步骤S13发育出的植物个体在第1培育步骤S14进行培育。第1培育步骤S14可以为任何方法，例如能够应用露地栽培、大棚栽培、温室栽培等公知的植物栽培方法。
由第1培育步骤S14培育出的植物41，若由昆虫传播而发生自然授粉，会结出有核的果实。因此，在第1培育步骤S14，为了使单性结实的效率更加提高，优选在温室等不由昆虫等生物进行花粉传播的环境中进行。
鉴于在木瓜科植物的栽培中的最佳温度，第1培育步骤S14可以在热带～亚热带地区或进行与这些地区的气候同等温度管理的室内进行。
另外，经过冻结步骤S11、解冻步骤S12以及发育步骤S13而得到的植物41，其耐寒性急剧提升，因此，能够在相对于热带～亚热带地区气温低的温带～寒带地区或进行与这些地区的气候同等温度管理的室内进行栽培。
在第1培育步骤S14培育出的植物41，若没有进行自然或者人工授粉，能够高效地结出无核果实31。
用常规的栽培方法栽培的木瓜科植物若不授粉的话，也能结出单性结实，但其效率非常低。另一方面，通过第1培育步骤S14培育出的植物41能够高效地结出单性结实，因此，具有优异的无核果实的生产率。
在本发明优选的技术方案中，采集通过第1培育步骤S14培育出的植物的植物组织，进行组织培养(培养步骤S21)。组织培养的方法不给予特别限定，例如培养叶等器官的器官培养、培养茎顶的分生组织克隆培养(茎顶培养)、培养未熟胚的胚培养、培养花药的花药培养、培养原生质体的原生质体培养等。
培养步骤S21不需要等到在第1培育步骤S14中所述的植物41结出果实。无论处于任何生长阶段的植物41都能够用于培养步骤S21。
通过培养步骤S21发育出新的植物个体后，进行培育该得到的植物的第2培育步骤S22。
作为第2培育步骤S22的条件，能够适用上述的第1培育步骤S14的内容。只是，经过培养步骤S21的植物42被确认为在结出花蕾的阶段子房肥大，具有能够确认结出无核果实的特殊性质。而且，能够确认结果的花蕾，占总花蕾的90％左右。这样，在结出花蕾阶段，确认结出单性结实的花蕾占有大部分，因此，不会发生由于进行露地栽培产生昆虫传播的自然授粉而单性结实效率下降的问题。因此，第2培育步骤S22可以进行露地栽培。进行露地栽培对降低生产成本也非常有利。
如上所述，经过培养步骤S21的植物42能够用花蕾的状态来确认单性结实。因此，进行去除不能确认结果的花蕾(有由于授粉而结出有核果实的可能性)的挑选步骤S23为好。若进行挑选步骤S23，能够提高所有结果的果实中无核果实32所占的比例。通过挑选步骤S23去除全部的不能确认结果的花蕾，能够使全部结果的果实成为无核果实32。
如上所述，植物41以及42具有高效结出无核果实的性质。从植物41以及42中，以有性生殖以外的方法得到的次世代植物遗传高效地结出单性结实的特性。因此，从由植物41以及42得到的且能够发育出独立于该植物的植物个体的种子以外的植物组织(子株等)中发育出的次世代以后的植株也具有高效地结出单性结实的特性。
还有，植物41以及42，作为嫁接用接穂使用时，也能发挥高效地结出单性结实的特性。
实施例1木瓜的特性增强以及无核果实的生产
在将木瓜种子浸泡在海藻糖水溶液中的状态下，静置于程序降温仪内进行冻结(冻结步骤)。以0.5℃/日的速度来缓慢冻结180天，冻结时最低温度达到-60℃。
以将冻结的木瓜种子用流水冲洗的方式进行解冻(解冻步骤)，对解冻的种子进行播种、栽培(发育步骤、第1培育步骤)。栽培地为日本的冈山县。
对于经过冻结、解冻处理的种子和未经处理的种子，随着其栽培时间观察生长情况，结果如图2-6。
如图2-6所示，相对于未经处理的木瓜，经过上述冻结、解冻处理的木瓜的生长速度显著提高。这一结果显示，采用本发明的特性增强方法，能够增强植物的生长特性。
木瓜的原产地为由墨西哥南部至西印度诸岛，木瓜在热带的各国中栽培，其耐寒性较差。但是，经过本发明的冻结、解冻处理的木瓜，即使在处于温带的冈山县栽培时，也能够正常生长，如图2-6所示。这一结果显示，采用本发明的特性增强方法能够增强植物的耐寒性。
还有，如图6所示，经过冻结、解冻处理的木瓜比未经处理的木瓜结果更多。这一结果显示，采用本发明的特性增强方法能够增强植物的丰产性。
在本实施例中，虽然没有使用农药，但能够在没有受到病虫害侵害的情况下栽培木瓜。还有，即使在不使用农药而大规模栽培利用与本实施例相同的方法进行冻结、解冻处理的木瓜时，也能够在没有受到病虫害侵害的情况下进行栽培。这一结果显示，采用本发明的特性增强方法能够增强植物的抗病虫害性。
还有，还确认了经过冻结、解冻处理的木瓜具有耐腐根性。这一结果显示，采用本发明的特性增强方法能够增强植物的耐腐根性。
在收获木瓜的果实并确认其瓤时，大概95％的果实为无核果实。
总结以上结果可知，将木瓜经过冻结步骤、解冻步骤、发育步骤、第1培育步骤处理，能够高效地得到木瓜的无核果实。另外，采用本方法进行栽培的木瓜，丰产性非常好。即，可知采用本发明的方法能够非常高产率地得到无核果实。
另外，采用本方法进行栽培的木瓜，其耐寒性、抗虫性、耐腐根性良好，因此，第1培育步骤既能够在温带进行，还能够进行无农药栽培。
实施例2木瓜的无核果实的生产(2)
采集经过实施例1中的冻结步骤、解冻步骤、发育步骤以及第1培育步骤而得到的木瓜的茎顶，将其进行分生组织克隆培养(培养步骤)。将经过培养步骤发育出的木瓜个体的苗进行露地栽培(第2培育步骤)。
图7、图8展示了在第2培育步骤的过程中结出的花蕾与普通的木瓜的花蕾的比较照片，其不同点一目了然。如图7所示，能够看出在第2培育步骤的过程中结出的花蕾其子房肥大。还有，如图8所示，观察花蕾的剖面，可发现在第2培育步骤的过程中结出的花蕾已经结果。因为在该结出花蕾阶段结果的果实没有授粉，当然为无核果实。
能够确认单性结实的花蕾占在第2培育步骤的过程中结出的总花蕾的比例大约为90％。
对如图7所示的不能确认子房肥大的花蕾(大约10％)进行挑选，并将其去除(挑选步骤)。完成挑选步骤后，最终由经第2培育步骤培育出的木瓜得到的果实的全部为无核果实。
实施例3菠萝的特性增强
将菠萝种子用与实施例1相同的方法进行冻结、解冻处理，然后进行播种、栽培。将经过冻结、解冻处理的菠萝和未经处理的菠萝同时进行播种、栽培，记录随着时间观察到的生长情况，结果如图9所示。
如图9所示，同实施例1中的木瓜一样，经冻结、解冻处理的菠萝的成长特性以及耐寒性也被增强。
实施例4香蕉的特性增强(1)
将香蕉新株的根切成圆片，用与实施例1相同的方法来进行冻结和解冻。冻结、解冻后，把根切成小块，将片段化的生长细胞块在培养基中培养，使其发芽。生长成适当程度的幼苗转移至土壤进行栽培。栽培在日本的冈山县进行。
其结果，种植幼苗后约9个月，生长成可以收获果实的状态(图10)。一般情况下，种植香蕉幼苗后，直到生长成能够收获果实为止最快也需要1年，但这一结果显示，采用本发明的冻结、解冻处理方法，能够显著提高香蕉的生长速度。
还有，香蕉和木瓜的原产地均为亚热带～热带，一般在温带地区栽培时不能结果。但在本实施例中，即使在处于温带的日本冈山县栽培，也能够收获得到果实(图10)。
这一结果显示，采用本发明的冻结、解冻处理方法，能够增强香蕉的耐寒性。
实施例5香蕉的特性增强(2)
取香蕉地上部分萌发出的腋芽，除掉叶和根，加工成竹笋状，然后用与实施例1相同的方法来进行冻结和解冻，将解冻后的腋芽转移至盆里种植。之后，茎腐烂消失，但确认萌发了新芽。栽培该新芽，得到了增强生长速度和耐寒性的香蕉。
实施例6咖啡树的特性增强
将台湾台南市中栽培的咖啡树的种子，用与实施例1相同的方法来进行冻结、解冻处理，使其发芽后种植在日本的冈山县(图11)。结果显示，经冻结、解冻处理的咖啡树相对于未经处理的在台南市栽培同体咖啡树，其生长速度促进了3～40％。
这一结果显示，采用本发明的冻结、解冻处理，能够提高咖啡树的生长速度。同时，在比台湾的台南市气温低的日本的冈山县也能够正常生长，说明采用本发明的冻结、解冻处理方法，能够提高咖啡树的耐寒性。
实施例7其他植物种的特性增强
将下面列举的植物的种子用与实施例1相同的方法来进行冻结、解冻处理，从处理后的植物组织中发育出植物个体后，进行栽培。
所述植物为罗汉果、番石榴、楊桃、无花果、可可、肉桂、西番莲、荔枝、山竹、黑肉柿(Black Sapote)、白香肉果(white Sapote)、番荔枝、枣椰、红心火龙果、银杏。
其结果表明，上述举例的任何一种植物，通过本发明的冻结、解冻处理后，其生长速度和耐寒性都被增强。这一结果显示，本发明的特性增强方法对所有的植物种有效。
实施例8分子生物学的分析
将未进行冻结、解冻处理的植物作为比较对象，对上述实施例中经过冻结、解冻处理后特性增强的木瓜、香蕉、西番莲、番石榴，进行转录组分析。其结果显示，任何一种植物，经过冻结、解冻处理后，其mRNA表达量提高了32-38倍左右。
这一结果表明，冻结、解冻处理可以显著提高生长特性以及耐寒性相关的增强基因的表达量。
即，该结果显示通过分析由于冻结解冻处理而提高的mRNA，能够鉴定出生长特性、耐寒性等的植物特性的增强基因。
同时，该结果显示，将上述增强基因的转录产物mRNA作为指标，能够筛选生长特性、耐寒性等植物特性的增强因子。
产业上的利用可能性：
本发明能够适用于农作物的生产技术。
本发明还能使用于木瓜的无核果实的生产。

Claims (21)

1.一种增强植物特性的方法，包括如下步骤：
将植物组织冻结的冻结步骤；
将冻结的植物组织解冻的解冻步骤；以及
从解冻的植物组织中发育出植物的发育步骤。
2.根据权利要求1所述的增强植物特性的方法，其特征在于，该方法为增强植物的生长特性和/或耐寒性的方法。
3.根据权利要求1或2所述的增强植物特性的方法，其特征在于，在所述的冻结步骤中，冻结时的最低温度为-20℃以下。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的增强植物特性的方法，其特征在于，在所述的冻结步骤中，以小于0.5℃/日的速度来降温，冻结所述植物组织。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的增强植物特性的方法，其特征在于，所述冻结步骤的期间为180天以上。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的增强植物特性的方法，其特征在于，在所述冻结步骤中，将植物组织浸泡在糖类水溶液中的状态下进行冻结。
7.根据权利要求6所述的增强植物特性的方法，其特征在于，所述糖类为海藻糖。
8.利用权利要求1～7的任一项所述的方法得到的生长特性和/或耐寒性增强的植物。
9.一种属于木瓜科的植物的无核果实的生产方法，其特征在于，包括：
将权利要求1～7的任一项所述的增强植物特性的方法应用于属于木瓜科的植物，对由所述发育步骤得到的植物进行培育的第1培育步骤。
10.根据权利要求9所述的无核果实的生产方法，其特征在于，将所述第1培育步骤在没有由生物进行的花粉传播的环境下进行。
11.根据权利要求9或10所述的无核果实的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集由所述第1培育步骤培育的植物的植物组织，进行组织培养的培养步骤；以及
对由所述培养步骤得到的植物进行培育的第2培育步骤。
12.根据权利要求11所述的无核果实的生产方法，其特征在于，所述第2培育步骤为露地栽培。
13.根据权利要求11或12所述的无核果实的生产方法，其特征在于，包括：
观察在所述第2培育过程中发育出的花蕾，去除不能确认结果的花蕾的挑选步骤。
14.通过权利要求9～13的任一项所述的生产方法生产的无核果实。
15.在权利要求9～13的任一项所述的生产方法中的第1培育步骤得到的结出无核果实的植物。
16.在权利要求11～13的任一项所述的生产方法中的第2培育步骤得到的结出无核果实的植物。
17.由权利要求8、15以及16的任一项所述的植物得到的作为嫁接用接穗来使用的植物组织。
18.由权利要求17所述的植物组织作为接穗嫁接得到的植物。
19.由权利要求8、15以及16的任一项所述的植物得到的、能够发育出与该植物独立的植物个体的除种子之外的植物组织。
20.一种植物特性增强基因的检索方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
采用权利要求1～7的任一项所述的方法处理植物的步骤；以及
鉴定相对于未经过处理的植物，在经过所述处理的植物中呈现高表达量的RNA的步骤。
21.一种植物特性增强因子的筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：与未经过权利要求1～7的任一项所述的方法处理的植物相比较，在经过该处理的植物中呈现高表达量的RNA作为指标，在使用被测物质处理的植物中的所述RNA的表达量高于未使用被测物质处理的植物中的所述RNA的表达量时，将该被测物质作为植物特性增强因子来筛选。
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