CN101647389B - 一种快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，将切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于浓度为150～250mg/L的镰刀菌酸溶液中，在20～27℃条件下浸泡6～9h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间即可。该方法具有适应性广，选择效率高，实用性强，对环境影响小的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，属于农业技术领域。
背景技术
节瓜枯萎病是节瓜的主要病害之一，给节瓜生产造成严重损失。目前节瓜种质资源中抗枯萎病材料较为缺乏，是节瓜抗病育种的瓶颈。
目前通用的筛选枯萎病突变体的方法是通过自然发病筛选或苗期人工接种筛选，前者须在发病年份、发病严重的田块进行，受自然条件和季节的限制；后者虽然可以在人工控制条件下进行，但必须有严格的隔离条件，以防病菌扩散到田间。
研究者曾建立利用离体筛选技术筛选节瓜抗枯萎病无性系的方法，与常规利用枯萎病菌接种筛选的方法相比，可以提高筛选效率，节省土地，并且可以避免病菌污染环境。但离体筛选技术的不足是必须依赖于成熟的离体培养和植株再生体系，而目前节瓜离体再生体系受品种类型的制约，有些品种至今无法建立成熟稳定的离体再生体系，因而难以进行抗枯萎病材料的离体筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，该方法具有适应性广，选择效率高，实用性强，对环境影响小的特点。
本发明在幼苗水平上利用镰刀菌酸筛选抗枯萎病变异材料，兼有苗期人工接种筛选不依赖于成熟稳定离体培养体系，适应性广的特点，以及抗性离体筛选不受季节自然条件限制，可以避免病菌污染环境的特点，一旦筛选出抗性材料，即可立即种植到田间。
为达到上述目的，本发明提供的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，将切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于浓度为150～250mg/L的镰刀菌酸溶液中，在20～27℃条件下浸泡6～9h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间即可。
其中，所述节瓜幼苗的培育过程为：取节瓜种子用水浸泡3～5h，在30℃恒温箱中催芽，待种子萌发后播种于育苗盘中，按正常育苗程序育苗。
进一步的，在按正常育苗程序育苗后，待节瓜幼苗达到1片真叶展开至2叶1心时移出植株，用水洗净根部育苗基质，切除部分须根即可。
优选的，将所述切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于镰刀菌酸溶液中在23～27℃浸泡8h。
所述镰刀菌酸的浓度为195～205mg/L。
所述镰刀菌酸溶液的配制过程为：取商品镰刀菌酸，先用少量乙醇溶解后，再用纯净水配制成溶液。
本发明具有以下优点：
(1)田间自然筛选方法应用的前提是田间必须有节瓜枯萎病发生，同时发病群体的大小、病害发生的严重程度均会影响选择效果；利用本发明镰刀菌酸进行苗期抗枯萎病变异体快速筛选在人工胁迫的条件下进行筛选，胁迫压力可以人工控制，不受自然气候条件及病害是否发生的限制，可以更快地筛选出具有强抗性的材料；
(2)与苗期人工接种筛选方法相比，利用镰刀菌酸进行苗期抗枯萎病变异体快速筛选不用活菌进行接种，且工作可以在实验室条件下进行，不仅可以节省土地，还可以避免因人工接种不慎而导致病菌污染环境；
(3)与抗枯萎病变异体离体筛选方法相比，利用镰刀菌酸进行苗期抗枯萎病变异体快速筛选不依赖于成熟的组织培养技术，应用的范围较广，可广泛应用于各种节瓜育种材料。
附图说明
图1是切除幼苗全部根系对镰刀菌酸FA胁迫下幼苗萎蔫指数的影响；
图2是切除部分须根对镰刀菌酸FA胁迫下幼苗萎蔫指数的影响；
图3是感病材料A06在不同浓度镰刀菌酸和不同浸泡时间条件下对节瓜幼苗萎蔫指数的影响；
图4是抗病材料A02在不同浓度镰刀菌酸和不同浸泡时间条件下对节瓜幼苗萎蔫指数的影响。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
第一部分：快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法
实施例1
本实施例提供的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法如下：将切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于浓度为150～250mg/L的镰刀菌酸溶液中，在20～25℃条件下浸泡6～9h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间即可。
实施例2
本实施例提供的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法如下：将切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于浓度为150～250mg/L的镰刀菌酸溶液中，在25～27℃条件下浸泡6～9h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间即可。
其中，节瓜幼苗的培育过程为：取节瓜种子用水浸泡3～5h，在30℃恒温箱中催芽，待种子萌发后播种于育苗盘中，按正常育苗程序育苗，待节瓜幼苗达到1片真叶展开至2叶1心时，移出植株，用水洗净根部育苗基质，切除部分须根即可。
镰刀菌酸溶液的配制过程为：取商品镰刀菌酸，先用少量乙醇溶解后，再用纯净水配制成溶液。
实施例3
本实施例提供的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法如下：
(1)将节瓜种子用清水浸种4h，在30℃恒温箱中催芽，待种子萌发后播种于育苗盘中，按正常育苗程序育苗；
(2)待节瓜幼苗1片真叶展开到2叶1心时，小心移出植株，用水轻轻洗净根部育苗基质，采用切除部分须根；
(3)将商品镰刀菌酸用少量无水乙醇溶解后，用纯净水配成200mg/L溶液；
(4)将切除部分须根的幼苗置于10ml试管中，加入浓度为200mg/L的镰刀菌酸溶液，是幼苗茎基部浸于溶液中，在25℃±2℃条件下浸泡8h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗重新转到育苗盘中在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间。
第二部分：节瓜抗镰刀菌酸的离体筛选
2.1试验材料
选用节瓜抗病品种A02和感病品种A06进行镰刀菌酸抗性筛选试验；
镰刀菌酸为Sigma公司产品，配制时先用少量无水乙醇溶解，再用纯净水配成不同浓度的溶液。
2.2筛选方法
2.2.1幼苗处理方法的确定
将节瓜种子播种于育苗盘中，幼苗1片真叶展开到2叶1心时，小心移出植株，用水轻轻洗净根部育苗基质，采用切除部分须根、切除全部根系2种方法处理方式，将幼苗基部浸于镰刀菌酸FA浓度为200mg/L溶液中，每隔1h观察萎蔫情况，统计萎蔫指数，确定适宜的幼苗处理方式。
2.2.2镰刀菌酸浓度的确定
利用切除须根的幼苗处理方法，将幼苗基部浸于FA浓度分别为50、100、200、400mg/L的溶液中，每隔1h观察萎蔫情况，统计萎蔫指数，确定适宜的镰刀菌酸处理方式。
2.2.3筛选方法有效性的验证
选用抗镰刀菌酸技术筛选出的3个抗性株系，用苗期人工接种法(传统的抗性鉴定技术)进行抗性验证，调查其病情指数。
2.3实验结果
2.3.1幼苗处理方法的确定
利用切除部分须根、切除全部根系2种幼苗处理方法，分别将不同处理的幼苗浸于镰刀菌酸FA浓度为200mg/L的溶液中，观察其幼苗萎蔫情况。
如附图1所示，发现切除全部根系的处理无论是抗病材料或感病材料，浸泡2h即可观察到萎蔫现象，但抗病材料和感病材料的萎蔫指数均同步上升，至浸16h，感病材料A06的萎蔫指数达到60％，抗病材料的萎蔫指数也达到73％，虽然抗/感材料间有一定差异，但区分度不够明显。
如附图2所示，切除部分须根的处理中，感病材料从浸泡2h后植株就开始萎蔫，且萎蔫指数随时间延长而快速上升，至浸泡16h，萎蔫指数已达到75％；而抗病材料则表现出对镰刀菌酸的高度耐受性，直至浸泡10h才开始出现萎蔫症状。
因此认为切除部分须根的幼苗处理方式可以将抗性材料和感病材料明显区分，适宜用于节瓜FA抗性筛选。
2.3.2镰刀菌酸浓度的确定
将感病材料A06、抗病材料A02的幼苗进行切须根处理后，浸于不同浓度的镰刀菌酸溶液中，观察感病材料A06和抗病材料A02在不同浓度镰刀菌酸和不同浸泡时间条件下对节瓜幼苗萎蔫指数的影响。
如附图3所示，对于感病材料A06，镰刀菌酸浓度为50mg/L时植株未显示明显萎蔫现象，浓度为100mg/L时处理伊始萎蔫不明显，5h以后萎蔫指数逐渐提高，而浓度为200mg/L和400mg/L时，萎蔫现象发展迅速，处理4-5h萎蔫指数已经超过50％。
如附图4所示，而抗性材料在50mg/L～200mg/L的处理浓度下，植株萎蔫指数均小于10％，即使400mg/L的浓度下植株萎蔫指数也仅为19.9％。
分析上述结果认为，镰刀菌酸浓度为100mg/L～400mg/L时抗病品种和感病品种间萎蔫现象差异显著，可以作为抗性筛选的浓度，其中200mg/L和400mg/L处理的萎蔫指数走势相似，筛选效果稳定。
因此认为200mg/L是节瓜幼苗抗性筛选的最佳浓度，经大田试验证实，在镰刀菌酸的浓度为150～250mg/L的镰刀菌酸溶液中，在20～25℃条件下浸泡6～9h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间效果很好，尤其是当镰刀菌酸的浓度为195～205mg/L时，将切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于镰刀菌酸溶液中在20～25℃浸泡8h时效果最好。
2.3.3筛选方法有效性的验证
利用镰刀菌酸苗期筛选技术筛选出的3个抗镰刀菌酸株系，经苗期接种节瓜枯萎病菌，结果表明，抗性分别达到抗病水平。表明利用苗期快速筛选技术筛选节瓜抗枯萎病材料是有效的。
表1抗镰刀菌酸株系枯萎病抗性表现
Claims (4)
1.一种快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，其特征在于，将切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于浓度为150～250mg/L的镰刀菌酸溶液中，在20～25℃条件下浸泡6～9h后，将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间即可；
所述的节瓜幼苗为：在按正常育苗程序育苗后，待节瓜幼苗达到1片真叶展开至2叶1心。
2.根据权利要求1所述的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，其特征在于，所述节瓜幼苗的培育过程为：取节瓜种子用水浸泡3～5h，在30℃恒温箱中催芽，待种子萌发后播种于育苗盘中，按正常育苗程序育苗。
3.根据权利要求1所述的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，其特征在于，将所述切除部分须根的节瓜幼苗茎基部浸于镰刀菌酸溶液中在20～25℃浸泡8h。
4.根据权利要求3所述的快速筛选节瓜抗枯萎病变异体的方法，其特征在于，所述镰刀菌酸的浓度为195～205mg/L。
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