SU1303610A1

SU1303610A1 - Способ определени концентрации жизнеспособных спор бактерий

Info

Publication number: SU1303610A1
Application number: SU843771185A
Authority: SU
Inventors: Эвелина Григорьевна Тутова; Александр Васильевич Воробей; Ирина Владимировна Жавнерко; Павел Степанович Куц; Евгений Александрович Черницкий; Анатолий Иванович Попов
Original assignee: Институт тепло- и массообмена им.А.В.Лыкова; Институт фотобиологии АН БССР
Priority date: 1984-06-11
Filing date: 1984-06-11
Publication date: 1987-04-15

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промьшшенности и может быть использовано дл количественного определени жизнеспособных спор микроорганизмов в различных препаратах , в частности энтомопатогенных. Цель изобретени - упрощение способа и сокращение длительности определени . Готов т суспензию спор в дистиллированной воде, гомогенизируют до получени однородной мелкодисперсной суспензии, прогревают при суб- летальной температуре 69-75 С, ввод т в питательную среду, выдерживают 10-30 мин, отбирают пробу, устанавливают в термостатируемую чейку по- л рографа, измер ют скорость поглощени кислорода и рассчитывают концентрацию (Т) жизнеспособных спор микроорганизмов по формуле: T K VjQ j где К - эмпирический коэффициент, характеризующий культуру микроорганизмов , кл-мин/мл м; (Ог скорость поглощени кислорода, м/мин. 1 з.п. . ф-лы, 5.ил., 2 табл. о с (Л со о 00 О5

Description

рп

Изобретение отно логической быть использовано го определени жизг микроорганизмов в ратах.

Целью изобретенна щение способа и ности процесса

На фиг. 1 установки дл на фиг, 2 - поглощени кислорода держивани после av 70°С в течение 10- зависимость скорости

итс к микробио промышле|нности и может

количественно еспособных спор р| аз личных препа вл етс упро- сойращение длитель- определени . изображена

рсуще ствлени

зaвиcи ость

(О

лорода спорами от при 60, 70 и 80°С; висимость скорости рода от концентрац1 и изменение силы ток

блок-схема

способа скорости от времени вы- тивации и при мин; на фиг. 3 поглощени кис ремени активации на фиг. 4 - за- поглощени кисло спор ; на фиг.5 во времени.

зав симости

Способ заключае 1|с

Биомассу, в

центрации спор мик1: оорганизмов (0,1-1 г сухого

10 г пасты, или 10ной жидкости), дистиллированной вс)ды

Нижние пределы от чувствительности верхние определ ютс ности измерений пр поглощени кислоро;,а тарных дл высокой роорганизмов,

следующем, от конв ней или 1г культураль- сусйендируют в 100 мл

концентрата

100

разведений завис т установки, а

снижением точ- высоких скорост в чейке, харак концентрации микПолученную суспфнзию низируют на микрои лучени однородной суспензии. При исп измельчител РТ-2 : ществл ют 1,5-2 ми) реактивируют путем сублетальной темпе; питательную среду i оптимальной дл ро- Отбирают пробу, ус мостатируемую чей: рость поглощени к: тывают концентраци: ных спор

спор гомоге- мельчителе до по- мелкодисперсной шьзовании микро- омогенизацию осу- . Затем споры прогрева их при атуре, ввод т в ; вьщерживают при ixa температуре, анавливают в тер у, измер ют ско- cлopoдa и рассчи 0 (Т) жизнеспособмикроорга измов по формуле

де К Чог

.V(,J

эмпирическ

характериз

микроорган

скорость

рода.

1 )

й коэффициент, ующий культуру дзмов; пЬглощени кислоКоэффициент К определ ют экспе- риментэльно. Дл этого определ ют титр одного образца микробиологическим способом и скорость поглоще6 ни кислорода V;

(oz

данным способом.

Коэффициент К рассчитывают по формуле , п .

;

К -- п

V

(oj

где п - количество образцов.

Данный способ может быть осуществлен дл определени количества жизнеспособных спор различных видов мик- роорганизмов,.

Предлагаемый способ осуществл етс на установке., представленной на фиг. 1.

Установка состоит из чейки 1 с мембранными датчиками типа Кларка, пол рографа 2, самописца 3, термостата 4 и магнитной мешалки 5.

К pa6o4eNry электроду термостати- руемой чейки от пол рографа подаетс напр жение, и после выдерживани суспензии реактивированных спор в чейке в течение 20-30 мин при посто нном перемешивании магнитной мешалкой на самописце регистрируют зменение в чейке силы тока, которое р мо пропорционально изменению кон- ентрации кислорода в образце.

Скорость поглощени кислорода в образце наход т по формуле

35

V,

СО.)

.. ГОг

где о - концентраци кислорода в дистиллированной воде при услори х (температура,, давление) измерени /U ;

-В

1с значени силы тока дл

контрольных растворов соответственно дистиллированной воды и бескислородного раствора (0,1 г сульфит натри на 100 Mji воды), мкА;

45:

-

1 значени силы тока дл

исследуемого образца соответственно в моменты времени /, и

Величина

А (константа 1, -1

чейки) характеризует чувствительность используемых датчиков чейки к кислороду ,1

It((0. у скорость изменеС - о,

НИЯ силы тока в образце в единицу времени, которую наход т из пол ро- граммы, т.е.

Со.)

A-V

С помощью установки, описанной выше, была исследована зависимость скорости дыхани спор бактерий Bacillus thuringiensis от времени.

Вы вленна зависимость скорости поглощени кислорода от времени активации представлена на фиг. 2.

Из представленных данных видно, что через 20 мин дл различных образцов , независимо от времени активации наблюдаетс посто нна скорость дыхани .

Было исследовано вли ние температуры и времени активации спор на скорость поглощени кислорода (фиг. 3). Установлено, что при активации спор при 60 С скорость поглощени кислорода достигает максимума через 50 мин нагрева.

Скорость поглощени кислорода при обработке спор при 70 С в течение 20-50 мин максимальна , при увеличении продолжительности более 50 мин отмечаетс снижение скорости погло- щени , что обусловлено гибелью части спор. Активаци же спор при 80 С происходит быстрее, но уже через 10 мин клетки начинают гибнуть.

В св зи с полученными данными оптимальными услови ми активации спор бактерий Bacillus thuringiensis вл ютс : температура 70 С-, врем 20- 50 мин.

Было установлено, что максимальна скорость поглощени кислорода спорами пропорциональна конструкции клеток в исследуемом образце (фиг. 4

Пример 1. Концентрацию жиз- неспособных спор определ ют в сухом препарате, полученном культивированием штамма Bacillus thuringiensis var dendrolimus 49-8. Дл этого навеску концентрата (0,2 г) развод т в 100 мл дистиллированной воды, гомогенизируют на микроизмельчителе РТ-2 в течение 2 мин. Полученную суспензию прогревают в вод ной бане при 70 С в течение 20 мин, затем охлаж

дают проточной водой.

В пробирку заливают 5 мл суспензи обработанных спор и 5 Ыл водной питательной среды, содержащей 0,9% NaCl, 0,9% глюкозы и 0,134% инозина. Полученную суспензию помещают в вод ную баню и выдерживают 15 мин. Затем отбирают 1,5 мл суспензии, заливают в чейку пол рографа и через 10 мин (минимальное врем выхо на

рабочий режим установки) записывают пол рограмму-(рис. 5).

Рассчитывают концентрацию жизнеспособных спор следующим образом.

Наход т значение силы тока в моменты времени сГ 21 мин; ,8 мкА; I.

б 25 мин;

,.0,4 мкА;

(0.)

где

0,8-0,4 , 1 , 0,1 мкА/мин

2,27 -10 0,,227. 10 м/мин;

2,2710 м/мкА - константа чейки .

Ко 5ффициент К дл спор бактерий 5 .Bacillus thuringiensis 49-8 равен (0,3510,04)- 10 кл-мин/м-мл; т:„

0,35 1о -2,27- ,9-10 кл/мл С учетом сделанных разведений

титр сухого концентрата Т

СПО

Р

в кон

центрате равен 79,2-10 кл/мг,

П р и м е р 2. Дл определени концентрации жизнеспособных спор используют препарат из Bacillus thu- ringiensis штамм 98.

Дл этого 1 г концентрата внесли в 100 мл дистиллированной воды. Дальнейшие операции повторили, как в примере 1 .

Экспериментально установлено, что коэффициент К дл спор Bacillus thuringiensis № 98 равен 1,1710,08

XlO КГ МИН/МЛ М.

Из пол рограммы контрольных растворов наход т

1ц-т,..-0,936 мкА.

- 1ь-1с

По формуле А

наход т

0

5

А

10

,-4

2,19

-4

10 м/мкА;

0,936

,09 мкА/мин (из пол рограммы

Исследуемой суспензии J; 0,19 10 м/мин

Чог) Титр водной суспензии спор

,19-10- - 1,17--10 0,22 х10 кл/мл, при пересчете на сухой концентрат

0 с учетом разведений Т(.44-10 кл/мг. Пример 3. Исследовали споры Вас. subtilis, выращенные на кос ках м со-пептонного агара. Суспензию спор гомогенизировали и выдерживали в во5 д ной бане при в течение

15 мин дл активации, затем охлаждали и разводили в отношении i:1 питательной средой следующего состава: 0,9 г NaCl+0,09 г глюкозы + 0,2 г

Ь-о6 аланина на 10 воды. Затем образе|ц статированную при графа, выдерживали ровали скорость по в образце.

Экспериментальн эффициент К дл равен: ,58fO,04

Из пол рограмм ров получено 1,-1 рограмм исследуемой

51

чл дистиллированной

помещали в термо- 20°С чейку пол ро- 25 мин и регистри- лощени кислорода

СП эр

э определенный коВас . subtilis 10 кл мин/мл м. контрольных раство- 0,9 мкА, Из пол - суспензии:

V. 0,04 1кА/мин

г, оЛ

to

.85

.,

турные данные.

Скорость поглощени образце равна:

Тог

2,85-10

.-4

0,9

-.С

-4

UO м - кисл

,0..0,,2соответственно Титр образца равен:

I

0,58 МО

х10 кл/мл.

Проверку корре1| ции определени титра вестным способами, биологическим, проводили ми. Дл концентрата ringiensis дл одюго повторност х опре;;ел ли биологическим и бами.

Сравнительные нию концентрации бактерий Bacillus л рографическим и способами

представлены

0,12МО 7

результатов предлагаемым и из в частности микр„ .„... двум пут спор Вас. thu-

образца в сем

титр микро- пйедлагаемым спосо;;анные по определе ;визнеспособных спо thuringiensis по- микробиологически

в табл. 1.

Таблица 1

lO м/мин

л9

Т-10 . кл/мг по способу

0,24 0,24 0,23 0,24 0,22

предлагаемому

85,7 84,7 79,4 83,3 77,7

микробиологическому

70,2 89,1 80,3 63,5 78,0

Продолжение табл.1

±0,1 1

13,9

±8,01

25 Дл спор Bacillus subtilis (три образца в двух повторност х) определ ли титр микробиологическим и предлагаемым способами. Результаты экспериментальных данных приведены в

Таблица2

5

0

5

0,11 0,12 0,33 0,33 0,26 0,25

6,38

6,95

19,14

15,08

14,5

5,36

6,12

20,47

21,02

5,64

13,72

50 Данный способ позвол ет в 15- 20 раз ускорить процесс определени концентрации жизнеспособных спор, снижает трудоемкость и исключает субъективность.

55

Claims

1. Способ определени концентрации жизнеспособных спор бактерий.

713

предусматривающий активацию спор путем вьщержки их в питательной среде в течение 15-30 мин и термообработки с последующим определением количе- ства спор расчетным путем, отлича ю щ и и с тем, что, с целью упрощени способа и сокращени длительности процесса определени , перед выдерживанием спор в среде споры внос т в дистиллированную воду, го- могенизируют, термообработку спор осуществл ют при сублетальной температуре в водной суспензии перед внесением в питательную среду, а после выдерживани в среде отбирают сус- пен зию спор и измер ют в ней скорость поглощени кислорода, а концентрацию жизнеспособных спор рассчитывают по формуле

10

(0.)

o,Y

где Т - концентраци жизнеспособных

спор, кл/мг;

К - эмпирический коэффициент, храктеризующий культуру, кл мин/м мл;

- скорость поглощени кислорода , м/мин.

2. Способ по п. 1, отличающийс тем , что при определении количества жизнеспособных спор бактерий Bacillus thuringiensis в качестве питательной среды используют среду, содержащую 0,9% хлористого натри , 0,09% глюкозы, 0,134% инозина, остальное - вода, а термообработку осуществл ют при 69-7l C в течение 20-50 мин.

срие.1

Vet

-if. мин

fffSO..

«3

«7

ff.20

/wi//y

/г w

Фиа

jit , цл

аг

те т. мин