CN115806897A - 一株乳酸链霉菌及其在抗青枯病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株乳酸链霉菌及其在抗青枯病中的应用。该菌株的名称为乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)ZY‑20，保藏编号为CCTCC NO:M2022561，于2022年5月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。本发明的菌株对青枯劳尔氏菌有显著的拮抗作用，为青枯病的防治又提供了一种途径。此外，本发明公开了杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A在抗青枯病中的应用，本发明发明人首次发现了杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A对青枯劳尔氏菌有很强的抑制作用，为新型的青枯病生防制剂的制备提供了新的选择。

Description

一株乳酸链霉菌及其在抗青枯病中的应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一株乳酸链霉菌及其在抗青枯病中的应用。

背景技术

植物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种维管束毁灭性土传细菌性病害，青枯劳尔氏菌是一种臭名昭著的土传细菌，可在数百种植物中引起灾难性的青枯病，包括番茄、马铃薯、香蕉、茄子和胡椒等重要作物，在亚热带、热带和温带地区发生普遍系统侵染的毁灭性土传病害，俗称“植物瘟病”。青枯劳尔氏菌被认为是由许多遗传上不同的菌株组成的复合体，通常称为青枯劳尔氏菌物种复合体，青枯劳尔氏菌在侵染过程中可产生多种毒力因子，导致寄主植物出现典型的萎蔫症状。目前，细菌性青枯病的防治是世界公认的一大难题，它广泛分布于世界各地，在我国南方省市发生严重，尤其在浙江，近年来不但茄科、瓜类受害，大面积发生的桑青枯病更对蚕业生产造成严重损失。

目前，青枯病的防治方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂和施用生防菌剂等，但实践证明，田间管理难以有效控制青枯病发生，抗性材料的选育耗时长，而化学防治污染环境、破坏生态平衡，且化学药剂的长期使用易使病原菌产生抗药性。因此，利用生防菌株及其活性产物防治生姜青枯病越来越受到人们的重视。大量研究表明，部分细菌、放线菌是较理想的青枯病拮抗菌。

目前，尚未见乳酸链霉菌作为青枯病生防菌剂的研究报道，因此，有必要寻找一种更为高效的防治青枯病的化合物用于防治青枯病。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株乳酸链霉菌。

本发明的另一目的在于，提供一种利用上述乳酸链霉菌生产杀粉蝶菌素的方法。

本发明的再一目的在于，提供一种上述乳酸链霉菌及杀粉蝶菌素在抗青枯病中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株乳酸链霉菌，名称为乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)ZY-20，保藏编号为CCTCC NO:M 2022561，于2022年5月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

所述乳酸链霉菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。

所述乳酸链霉菌的菌落形态为：菌株细胞杆状，在LB琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落不透明。

所述乳酸链霉菌的生理生化特征为：明胶液化、牛奶凝固、牛奶胨化、果糖利用、蔗糖利用、葡萄糖利用、淀粉水解、硝酸盐还原为阳性，黑色素的产生、阿拉伯糖利用、棉子糖利用、纤维素水解、木糖利用、蜜二糖利用、甘露醇利用为阴性。

所述乳酸链霉菌在抗青枯病中的应用，优选为将乳酸链霉菌施加于培养农作物的土壤中或是喷洒在农作物的表面。

一种青枯病防治药剂，含有上述的乳酸链霉菌。

一种利用上述乳酸链霉菌生产杀粉蝶菌素的方法，具体步骤如下：

将上述乳酸链霉菌通过发酵、分离、离心、萃取后得到杀粉蝶菌素。

一种杀粉蝶菌素在抗青枯病中的应用。

所述杀粉蝶菌素为杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A，其中，杀粉蝶菌素B1的结构式如式I，杀粉蝶菌素A的结构式如式Ⅱ所示：

所述的杀粉蝶菌素在制备青枯病防治药剂中的应用。

一种青枯病防治药剂，含有上述的杀粉蝶菌素。

所述的青枯病防治药剂是指能够抑制青枯劳尔氏菌的增值、生长、致病力、β-半乳糖苷酶活性的药剂。

所述的青枯病是由青枯劳尔氏菌导致的青枯病。

一种治疗由青枯劳尔氏菌导致的青枯病的方法，是将含有乳酸链霉菌或杀粉蝶菌素的药剂施用在培养农作物的土壤中或是喷洒在农作物的表面。

所述的农作物为易于被青枯劳尔氏菌感染的农作物；优选为茄科作物；更优选为番茄。

所述的农作物为已被青枯劳尔氏菌感染的农作物，或是未被青枯劳尔氏菌感染的农作物。

所述的利用乳酸链霉菌生产杀粉蝶菌素的方法，具体步骤为：

(1)将乳酸链霉菌ZY-20进行发酵，得到的发酵液进行固液分离；在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜去除不溶物，得到含活性成分的有机溶液I；

(2)用C18反相硅胶装柱，将含活性成分的有机溶液I上样，通过C18反相硅胶吸附活性成分；再用10％～100％色谱甲醇梯度洗脱，每500mL洗脱液收集到干净的三角瓶中为一个馏分；收集80％甲醇馏分，经过旋转蒸发后溶解在甲醇中，过0.22μm的滤膜去除不溶物；

(3)对步骤(2)去除不溶物的80％甲醇馏分进行半制备高效液相层析；其中，溶剂A相为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯乙腈；洗脱程序为：对有抑菌活性的80％甲醇:20％水馏分进行半制备高效液相层析(反相半制备柱XSelect HSS T3 Prep 5μm,250×10.0mmColumn；溶剂A相为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯甲醇；洗脱程序为：75％B，0～1.5min；75％B到100％B，1.5～7.5min；100％B，7.5～17.5min；100％B到75％B，17.5～18.5min；75％B，18.5～20min；流速为3.0mL/min，收集10～12min得到化合物1杀粉蝶菌素B1，收集13～14min得到化合物2杀粉蝶菌素A。

步骤(1)中所述的乳酸链霉菌ZY-20，保藏编号为CCTCC NO:M 2022561，于2022年5月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

步骤(1)中所述的发酵所用的发酵培养基优选为LB培养基。

所述的LB培养基的组成如下：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0～7.2。

步骤(1)中所述的发酵的条件优选为于26～28℃，200～250rpm发酵；更优选为于28℃、220rpm发酵。

步骤(1)中所述的发酵的程度优选为达到乳酸链霉菌的对数生长期或稳定期；更优选为OD₆₀₀＝3。

步骤(1)中所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的离心的条件优选为8000～12000×g离心10～20min；更优选为10000g离心15min。

步骤(1)中所述的乙酸乙酯的用量优选为与所述的上清液等体积。

步骤(2)中所述的用C18反相硅胶装柱中的柱子优选为柱高0.3m，柱直径2cm。

步骤(3)中所述的半制备高效液相层析中的柱子优选为反相半制备柱XSelectHSS T3 Prep 5μm,250×10.0mm Column。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的发明人首次发现了杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A对青枯劳尔氏菌有很强的抑制作用，为新型的青枯病生防制剂的制备提供了新的选择。

(2)本发明提供的杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A的制备方法，是以乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)为菌种，经过培养、分离和提纯得到；该方法步骤简洁，操作简单，这有利于进行工业化生产。

附图说明

图1是本发明中菌株ZY-20对青枯劳尔氏菌的拮抗效果照片图。

图2是本发明中青枯病拮抗菌生防实验效果图，图中V_GMI1000为青枯劳尔氏菌GMI1000，V_S.latis为乳酸链霉菌ZY-20。

图3是本发明中菌株ZY-20单菌落的照片图。

图4是杀粉蝶菌素B1的核磁结果图。

图5是杀粉蝶菌素B1的质谱结果图。

图6是杀粉蝶菌素A的核磁结果图。

图7是是杀粉蝶菌素A的质谱结果图。

图8是杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A对青枯劳尔氏菌抑菌活性测定结果图，其中图8(a)为杀粉蝶菌素B1，图8(b)为杀粉蝶菌素A。

图9是杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A对青枯劳尔氏菌epsA基因表达水平检测结果图。

图10是杀粉蝶菌素A对青枯病的生防实验效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1细菌进行分离纯化

1.培养基

LB琼脂培养基(LB固体培养基)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，用H₂O定容至1000mL，pH 7.0～7.2。121℃灭菌20分钟。

2.实验步骤

(1)样品采集：选择具代表性的地点(青枯病发病田地中健康植株根系土壤，地点福建省龙岩市)，铲去表层土，用采土工具采取距离地表下5～10厘米深度的土层中的土壤，每个地点采5个样本，装入袋中并作好记录。

(2)土壤悬浮液的制备：称取10g土壤，放入装有90mL无菌水的三角瓶中充分振荡，制成1：10浓度的土壤悬浮液。待土粒沉淀后，吸取1mL上清液，移入盛有9mL灭菌水的试管中，制成1：100浓度的土壤悬浮液，依次类推，梯度稀释制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍的土壤悬浮液备用。

(3)细菌分离：选择10^-3、10^-4、10^-5和10^-6四个浓度的土壤悬浮液各0.1mL，将稀释的土壤悬浮液分别倒入LB琼脂培养基培养皿中，将涂布棒在酒精灯火焰充分灼烧灭菌，待冷却后涂布平板。将接种完的培养皿倒置，30℃恒温培养，设置三个重复。

(4)结果：共分离得到1288个菌落。

实施例2分离得到的细菌对青枯劳尔氏菌的平板拮抗试验

1.培养基

TTC固体培养基：

(1)蛋白胨10g，酸水解酪蛋白(Casein Acid Hydrolysate)1g，葡萄糖5g，琼脂15g，用H₂O定容至1000mL，pH6.8～7.2；121℃灭菌20分钟，得到溶液I；

(2)TTC(2,3,5－氯化三苯四氮唑)用蒸馏水配成质量百分比1％的溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到溶液II；

(3)在溶液I冷却至约45℃时，每100mL溶液I加入0.5mL溶液II，即可倒平板。

CPG液体培养基：制备方法参照TTC固体培养基，不加琼脂和TTC即可。

2.实验步骤

2.1平板拮抗试验

2.1.1菌种活化

青枯劳尔氏菌和细菌进行菌种活化：青枯劳尔氏菌(Pseudomonas solanacear)GMI1000(ATCC)转接至TTC固体培养基平板，于28℃培养2天；实施例1分离得到的1288个菌落转接至LB固体培养基平板，于30℃培养1天，备用。

2.1.2带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌的制备

利用pME2-lacZ质粒构建青枯菌胞外多糖EPS合成酶基因epsA的报告质粒pME2-pepsA-lacZ(质粒和菌株的构建方法参照文献Ralstonia solanacearum promotespathogenicity by utilizing l-glutamic acid from host plants,doi.org/10.1111/mpp.12963)。将构建好的pME2-pepsA-lacZ质粒通过电击方式导入青枯劳尔氏菌GMI1000中，获得含epsA基因的带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌。挑取带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌单菌落接种在10mL CPG液体培养基中，28℃220rpm/min振荡培养一天得到菌液，再将3mL带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌菌液加入到30mL融化的TTC固体培养基中(冷却到45℃左右)，再加入150μL x-gal倒成平板，凝固后得到青枯劳尔氏菌平板。

2.1.3平板拮抗试验初筛

用灭菌的牙签挑取活化的288个菌落，点接在青枯劳尔氏菌平板上，每个平板接36株不同的菌落，3个重复，28℃培养，24h、36h和48h分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的有无。

3、结果

通过初筛试验得到有拮抗效果的细菌10株，菌株ZY-20就是其中一株。

由图1可以看出抑菌圈明显，说明菌株ZY-20对青枯劳尔氏菌具有明显的拮抗作用。

实施例3菌株ZY-20的生物防治效果试验

为了检验菌株ZY-20的生防效果，将菌株ZY-20发酵液在盆栽上对青枯病进行生防效果试验。

实验步骤：

1.1准备番茄苗

通过商业渠道购买在大棚中育好的番茄苗。

1.2苗移栽

在花盆(规格170mm×160mm)装满基质土，略压紧，然后每盆移入1株番茄苗，浇水后两指在根部略压紧，在大棚中培养。花盆中培养4周左右。

1.3青枯劳尔氏菌和拮抗菌活化和发酵液制备

青枯劳尔氏菌GMI1000和拮抗菌ZY-20分别活化(具体步骤参考实施例2中步骤2.1.1)，然后挑单菌落分别接入CPG液体培养基和LB液体培养基摇瓶培养，28℃，200rpm，青枯劳尔氏菌GMI1000过夜培养(到OD600约0.5)得到青枯劳尔氏菌发酵液，拮抗菌ZY-20培养约两天(到OD600约2.5)。

1.4青枯劳尔氏菌和拮抗菌接种

本实验设置2个对照组，即CK1和CK2。CK1：不加任何菌，只加入20μLCPG液体培养基；CK2：加5μL青枯劳尔氏菌发酵液，不加拮抗菌发酵液。

实验组设置菌株ZY-20处理：按照体积比混合青枯劳尔氏菌发酵液和菌株ZY-20培养液，比例分别为1:0.5和1:2，制备2种不同比例的实验组，每组的总加入量分别为7.5μL,15μL。

具体实验方法为：按加入量取配制好的实验组和对照组直接感染4周龄的番茄苗，使用毛细管将样本注射到第一片真叶叶柄上方的茎中，并在标准条件下培育植物，每组实验处理10盆。

1.5观察和记录

隔一天记录发病植株数和发病严重程度。

2、结果

如图2所示，接种实验后，只接CPG液体培养基的对照组CK1不发病，死亡率0，只接青枯劳尔氏菌GMI1000发酵液的对照组CK2全部发病，死亡率100％，接种青枯劳尔氏菌GMI1000发酵液和菌株ZY-20发酵液的处理组1:0.5、1:2死亡率均为37.5％。由此可见，菌株ZY-20发酵液处理能使番茄植株青枯病的发生得到有效控制。

实施例4对分离得到的细菌进行鉴定

经广东省微生物分析检测中心检测，其检测依据为《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)《伯杰细菌鉴定手册》第九版以及《分子克隆实验指南》第二版(黄培堂译2002科学出版社)，鉴定结果为：菌株ZY-20的16S rDNA序列与Streptomyceslactacystinicus(乳酸链霉菌)的同源性达99.78％，其形态特征及生理生化特性与Streptomyces lactacystinicus(乳酸链霉菌)最相似。具体检测结果如下：

1.该保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征

乳酸链霉菌ZY-20：属乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)；样品链霉菌的成熟孢子链呈直线型，每条链含有20个以上孢子，孢子圆柱形，1.1～1.3×0.6～0.7μm。(如图3所示)。

2.菌株ZY-20理化实验

实验结果如表1所示：

表1

试验项目

结果

试验项目

结果

试验项目

结果

试验项目

结果

明胶液化

+

果糖利用

+

纤维素水解

－

硝酸盐还原

+

牛奶凝固

+

蔗糖利用

+

木糖利用

－

蜜二糖利用

－

牛奶胨化

+

阿拉伯糖利用

－

葡萄糖利用

+

甘露醇利用

－

黑色素的产生

－

棉子糖利用

－

淀粉水解

+

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

3.16S rRNA序列比对

菌株ZY-20 16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID NO:1所示，将16S rRNA基因序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析，得到与乳酸链霉菌相似度达99.78％，其形态特征及生理生化特性与乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)最相似，因此根据16S rRNA基因序列测定和形态特征、生理生化特性结果来看，该菌株可以归为乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)。

将菌株ZY-20命名为乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)ZY-20，保藏编号为CCTCC NO:M 2022561，于2022年5月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

实施例5：乳酸链霉菌代谢物的提取、分离及结构鉴定

1、菌种和培养基

乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)ZY-20，保藏编号为CCTCC NO:M2022561，于2022年5月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

青枯劳尔氏菌GMI1000，购买自ATCC。LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，H₂O定容至1000ml，pH 7.0～7.2。121℃灭菌20分钟。

LB液体培养基：与LB固体培养基的区别仅在于：不含琼脂。

TTC固体培养基的配制：胰蛋白胨10g，酸水解酪蛋白1g，葡萄糖5g，琼脂15g，H₂O定容至1000ml，pH6.8～7.2；121℃灭菌20分钟，得到基本培养基。TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)用蒸馏水配成0.1％(w/v)溶液并用细菌过滤器过滤灭菌，在基本培养基倒平板前(冷却至约45℃)，每100mL基本培养基加入0.5mL 0.1％(w/v)TTC溶液。

CPG液体培养基：不含琼脂。

2、实验步骤

2.1培养基配制

配制如步骤1的培养基。

2.2乳酸链霉菌ZY-20活化

取-80℃保存的乳酸链霉菌ZY-20在LB平板上划线活化，28℃培养箱过夜培养。

2.3乳酸链霉菌ZY-20发酵

取LB固体培养基活化的乳酸链霉菌ZY-20菌株，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养12h获得种子液，按1％(v/v)的接种量接入1000mL LB液体培养基，28℃、220r/min振荡培养，至OD₆₀₀达到3.0，10000×g离心15min去除菌体，收集上清液。

2.4化合物的提取

向上清液中加入等体积的乙酸乙酯，混合均匀后倒入分液漏斗中静置分层，放出下层水相，从上面倒出上层有机相，旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯，加入1mL甲醇溶解，过0.22μm的有机滤膜去除不溶物，得到粗提物，4℃保存。

2.5化合物的初步分离

称取C18反相硅胶于干净三角瓶中，加入色谱甲醇浸泡24h后装柱，柱高0.3m，柱直径2cm，用色谱甲醇冲洗干净后上样(即2.4得到的粗提物)，然后再用10％～100％色谱甲醇梯度洗脱，每500mL洗脱液收集到干净的三角瓶中为一个馏分，旋转蒸发仪蒸干甲醇后，再溶于0.5mL色谱甲醇中，过0.22μm的有机滤膜去除不溶物，然后分别检测每部分的抑菌活性。

2.6抑菌活性检测

抑菌活性的检测采用琼脂扩散法，取-80℃保存的青枯劳尔氏菌GMI1000在TTC平板上划线活化，28℃培养3天，挑取单菌落接种在10mL CPG液体培养基中，28℃220r/min振荡培养一天，再将青枯劳尔氏菌菌液加入到融化的TTC固体培养基中(冷却到45℃左右)倒成平板，凝固后用无菌打孔器(直径8mm)在含菌平板中央打孔，每板1孔，取出菌块丢弃。用移液器在每个孔中加入10μL待测溶液，吹干后28℃倒置培养2天，重复3次，观察抑菌圈，发现80％甲醇馏分有活性。

2.7化合物的二次分离

对有抑菌活性的80％甲醇馏分进行半制备高效液相层析(反相半制备柱XSelectHSS T3 Prep 5μm,250×10.0mm Column；溶剂A相为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯甲醇；洗脱程序为：75％B，0～1.5min；75％B到100％B，1.5～7.5min；100％B，7.5～17.5min；100％B到75％B，17.5～18.5min；75％B，18.5～20min；流速为3.0mL min^-1，收集10～12min得到化合物1，收集13～14min得到化合物2。

2.8化合物的ESI-MS和NMR检测

ESI-MS检测：将化合物溶解于适量色谱甲醇中并过滤，ESI-MS分析(超高效液相四极杆串联飞行时间质谱联用仪)。

NMR检测：化合物的溶剂挥发干，溶解于氘代甲醇中，再转移到干净的核磁管中，进行NMR测定。测定类型包括：1H NMR,13C NMR，Dept135。

2.9结果

通过对化合物1的ESI-MS和NMR进行检测(见图4～5)，确定化合物1为杀粉蝶菌素B1(Piericidin B1 N-oxide)，相对分子质量446，其结构如式I所示，通过对化合物2的ESI-MS和NMR进行检测(见图6～7)，确定化合物2为杀粉蝶菌素A(Piericidin A)，相对分子质量415，其结构如式Ⅱ所示。

实施例6：化合物对青枯劳尔氏菌的抑菌活性测定

1、培养基

TTC培养基：同实施例2。

CPG液体培养基：同实施例2。

2、实验步骤

2.1培养基配制

同实施例2。

2.2菌种活化

同实施例2。

2.3x-gal活性检测

挑取实施例2制备的带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌单菌落接种在10mLCPG液体培养基中，28℃220r/min振荡培养一天，再将2mL的带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌菌液(制备过程参考实施例2)加入到20mL融化的TTC固体培养基中(冷却到45℃左右)，再加入100μL x-gal倒成平板，凝固后用无菌打孔器(直径8mm)在含菌平板中央打孔，每板1孔，取出菌块丢弃。用移液器在每个孔中加入10μL实施例5制备得到的化合物溶液，吹干后28℃倒置培养2天，重复3次，观察抑菌圈。

2.4化合物对青枯劳尔氏菌的β-半乳糖苷酶活性影响检测

(1)带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌在TTC平板上活化后，挑取单菌落接种于10mLCPG液体培养基，28℃220rpm过夜；

(2)培养好的菌液用新鲜的CPG液体培养基稀释到OD600＝0.1，取无菌15mL离心管，每管加3mL稀释菌液；

(3)加入抑菌物质(即实施例5制备的化合物)，杀粉蝶菌素B1浓度分别为0.5、0.25、0.125μg/mL；杀粉蝶菌素A浓度分别为0.2、0.1、0.05μg/mL，另外加甲醇做对照，28℃200rpm培养至OD_600＝2.0。

(4)通过测定报告菌株中lacZ基因表达情况，可比较分析报告菌株中所插入启动子的活性，在β-半乳糖苷酶的活性测定实验中，以ONPG(2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)作为底物，可通过培养液中颜色变化对β-半乳糖苷酶的活性进行相对定量分析。

β-半乳糖苷酶的活性测定实验步骤如下：

1)报告菌株在TTC平板(含四环素和X-gal)上划线活化，挑取带有pME2-pepsA-lacZ的青枯劳尔氏菌单菌落，接种于10mL的CPG液体培养基中(含四环素)，28℃、200rpm条件下振荡培养过夜；

2)测定各菌株OD 600值，分别用新鲜培养基稀释到OD 600＝0.01，于28℃、200rpm条件下振荡培养；

3)每隔4h取样，取出200μL菌液转移至一新的离心管中，并记录各供试菌株OD 600值；

4)12000rpm离心1min收集菌体，加入200μL的Z-buffer/β-巯基乙醇重悬菌体；

5)加入20μL的0.1％SDS，振荡5min，加入20μL的氯仿，振荡5min；

6)迅速加入200μL的ONPG，37℃条件下水浴至黄色(反应时间不超过30min)，记录水浴时间；

7)立即加入600μL的1M Na₂CO₃终止反应；

8)12000rpm离心1min，取上清测定OD 420值和OD 550值。

9)β-半乳糖苷酶活性计算

3、结果

实验结果证明，杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A对青枯劳尔氏菌具有很强抑菌效果，见图8；其对青枯劳尔氏菌的β-半乳糖苷酶活性具有抑制作用，见图9。

实施例7：乳酸链霉菌代谢物的生物防治效果试验

为了检验乳酸链霉菌代谢物的生防效果，使用化合物杀粉蝶菌素A在盆栽上对青枯病进行生防效果试验

实验步骤：

1.1准备番茄苗

通过商业渠道购买在大棚中育好的番茄苗。

1.2苗移栽

在花盆(规格170mm*160mm)中装满基质土，略压紧，然后每盆移入1株番茄苗，浇水后两指在根部略压紧，在大棚中培养。花盆中培养4周左右。

1.3青枯劳尔氏菌活化和发酵液制备

将青枯劳尔氏菌GMI1000活化，然后挑单菌落分别接入CPG液体培养基，28℃，200rpm，青枯劳尔氏菌GMI1000过夜培养(到OD₆₀₀约1.0)，得到青枯劳尔氏菌发酵液。

1.4青枯劳尔氏菌和乳酸链霉菌代谢物接种

本实验设置2个对照组，即CK1和CK2。CK1：不加任何菌，只加入5μL CPG液体培养基；CK2：将2μL甲醇加入100μL青枯劳尔氏菌发酵液中混匀，分别用毛细管吸取5μL的CK1/CK2，注射到第一片真叶叶柄上方的茎中直接感染4周龄的番茄苗。

实验组化合物使用杀粉蝶菌素A处理：在青枯劳尔氏菌发酵液中加入实施例5中步骤2.7制备的杀粉蝶菌素A溶液配制成杀粉蝶菌素A浓度为50ng/mL，25ng/mL的试剂，做2个处理，每个处理10盆，用毛细管吸取5μL试剂注射到第一片真叶叶柄上方的茎中直接感染4周龄的番茄苗，并在标准条件下培育番茄苗。

1.5记录

隔一天记录发病植株数和发病严重程度。

2.结果

如图10所示，人工接种后，只接CPG液体培养基的对照组CK1不发病，死亡率0，接加入甲醇的青枯劳尔氏菌GMI1000发酵液对照组CK2全部发病，死亡率100％，接种青枯劳尔氏菌GMI1000发酵液和化合物杀粉蝶菌素A50ng/mL，25ng/mL处理组的死亡率分别为62.5％和50％。由此可见，化合物杀粉蝶菌素A处理能使番茄植株青枯病的发生得到有效控制。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株乳酸链霉菌，其特征在于：

名称为乳酸链霉菌(Streptomyces lactacystinicus)ZY-20，保藏编号为CCTCC NO:M2022561，于2022年5月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述的乳酸链霉菌在抗青枯病中的应用。

3.一种青枯病防治药剂，其特征在于：

含有权利要求1所述的乳酸链霉菌。

4.一种利用权利要求1所述的乳酸链霉菌生产杀粉蝶菌素的方法，其特征在于具体步骤如下：

将乳酸链霉菌通过发酵、分离、离心、萃取后得到杀粉蝶菌素。

5.一种杀粉蝶菌素在抗青枯病中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述的杀粉蝶菌素为杀粉蝶菌素B1和杀粉蝶菌素A。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：

所述的应用为制备青枯病防治药剂。

8.一种青枯病防治药剂，其特征在于：

含有权利要求5或6所述的杀粉蝶菌素。

9.一种治疗由青枯劳尔氏菌导致的青枯病的方法，其特征在于：

是将含有乳酸链霉菌或杀粉蝶菌素的药剂施用在培养农作物的土壤中或是喷洒在农作物的表面。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述的农作物为易于被青枯劳尔氏菌感染的农作物。

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