CN108896520A - 基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V) - Google Patents

基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V) Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，属于环境分析技术领域。先制备量子点@铽离子‑单磷酸鸟嘌呤核苷酸(QDs@Tb‑GMP)复合物，酸性磷酸酶(ACP)催化GMP水解从而破坏QDs@Tb‑GMP的结构，导致Tb的绿色荧光淬灭，而QDs的红色荧光不变。As(V)可抑制ACP的活性，使得Tb的荧光不淬灭，随着As(V)浓度的增大，Tb与QDs的荧光比值(I547/I652)逐渐增加，构建了比率荧光法检测As(V)。此外，在紫外灯下，随着As(V)浓度的增加，QDs@Tb‑GMP溶液从红紫色变为橙色，可实现As(V)的可视化分析。QDs@Tb‑GMP的制备方法简便、水溶性好、环境友好，该比率荧光法不仅改善了测定As(V)的灵敏度，结合氧化处理还可用于检测实际样品中无机砷总量。

Description

基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)
技术领域
本发明涉及一种基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，属于环境分析技术领域。
背景技术
无机砷污染是当前环境重金属污染问题中最为严重的问题之一。环境中五价砷(As(V))的存在十分广泛，尤以在含氧高的环境中为主。且水中的As(V)可轻易进入到鱼类、稻谷等水生动植物中，动植物体内As(V)的累积通过食物链而进入人体，从而造成砷对人类健康的危害。因而，世界卫生组织(WHO)对饮用水中砷的最高允许值规定为10ppb。
As(V)和磷酸具有极高的相似性，如相同的化学结构，几乎相同的尺寸和pKa值，完全相同的含氧原子，热化学半径仅相差4％以及相似的金属亲和性等(Elias M,Wellner A,Goldin-Azulay K,Chabriere E,Vorholt JA,Erb TJ,Tawfik DS.The molecular basisof phosphate discrimination in arsenate-rich environments.Nature,2012,491,134-137)。磷酸是生命体组成必须的成分，而砷酸具有毒性，磷酸与砷酸的高度相似性为某些领域中砷酸盐有效取代磷酸盐提供了有力证据(Wolfe-Simon F,Blum JS,Kulp TR,Gordon GW,Hoeft SE,Pett-Ridge J,Stolz JF,Webb SM,Weber PK,Davies PCW,AnbarAD,Oremland RS.A bacterium that can grow by using arsenic insteadofphosphorus,Science,2011,332,1163-1166.)。由于砷取代磷酸形成的金属酯中间体稳定性较天然磷酸酯中间体更高，因此，As(V)被认为是磷酸酶的有效抑制剂。Cosnier等人基于酸性磷酸酶(ACP)和多酚氧化酶构建了双酶电化学传感器，利用As(V)对ACP的特异性抑制作用对水解后产物的分析实现了As(V)的灵敏电化学测定(Cosnier S,Mousty C,Cui X,Yang X,Dong S.Specific determination of As(V)by an acid phosphatase-polyphenol oxidase biosensor.Analytical Chemistry,2006,78,4985-4989)；利用As(V)对ACP的特异性抑制作用，电化学分析法(Sanllorente-Méndez S,Domínguez-RenedoO,Arcos-Martínez MJ.Development of acid phosphatase based amperometricbiosensors for the inhibitive determination of As(V).Talanta,2012,93,301-306)以及AuNPs比色分析法(Zhang J,Zhang C-L,Yu S-H.Tuning gold nanoparticleaggregation through the inhibition of acid phosphatase bioactivity:Aplasmonic sensor for light-up visual detection of arsenate(AsV).ChemPlusChem,2016,81,1147-1151)也可用于定量检测As(V)。
核酸/核苷酸与稀土离子组成的螯合聚合物纳米材料具有尖锐的发射峰、大的斯托克斯位移、长荧光寿命和高光化学稳定性等独特性质，在传感领域有广泛的应用。Nishiyabu等人发现核苷酸与镧系离子在水溶液中通过一步自适应性组装可得到无定型和超分子的网状结构(Nishiyabu R,Hashimoto N,Cho T,Watanabe K,Yasunaga T,EndoA,Kaneko K,Niidome T,Murata M,Adachi C,Katayama Y,Hashizume M,KimizukaN.Nanoparticles of adaptive supramolecular networks self-assembled fromnucleotides and lanthanide ions.Journal of the American Chemical Society,2009,131,2151-2158)。这种聚合物的制备方法简单，而且可以与其他无机纳米粒子进行组合形成纳米复合物，在传感分析中有很好的性能。
比率荧光方法是克服单信号不稳定性的有效策略，而双发射的比率荧光探针可以通过内置的双荧光信号实现自我校准，以消除环境因素和生物样品产生的干扰，因而在荧光传感和成像中有着广泛的研究和应用(Chen T,Hu Y,Cen Y,Chu X,Lu Y.A dual-emission fluorescent nanocomplex of gold-cluster-decorated silica particlesfor live cell imaging of highly reactive oxygen species.Journal of theAmerican Chemical Society,2013,135,11595-11602)。更重要的是，基于比率荧光的传感体系有利于实现对靶物的可视化分析。探针上的两个分开的发射峰的荧光强度比值可以修正内在环境的干扰并排除激发光强度的波动，因而可提高定量分析的精确度。所以，发展简单而灵敏的基于稀土配位聚合物的比率荧光法检测As(V)在环境监测中具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供了一种基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，它具有检测灵敏和可视化分析的优点。
本发明通过如下技术方案实现：
基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，包括以下步骤：
(1)制备QDs@Tb-GMP纳米复合物：将10μL 8μM的量子点(QDs)溶液、100μL 10mM核苷酸(GMP)溶液与800μLHEPES缓冲溶液混合，再向溶液中加入100μL 10mM的Tb3+溶液，并立刻剧烈震荡使溶液混合均匀，将得到黄色浑浊溶液在10000rpm转速下离心10min，收集黄色沉淀，用超纯水清洗沉淀三次，将得到的黄色沉淀产物分散在1mL HEPES缓冲溶液中，制成QDs@Tb-GMP溶液；
(2)比率荧光法检测As(V)：将20μL 800U/L的酸性磷酸酶溶液、不同浓度的As(V)溶液和50μLHEPES缓冲溶液混合，用超纯水稀释到总体积为100μL，在37℃水浴中反应90min，再加入150μL步骤(1)制备的QDs@Tb-GMP溶液，漩涡混匀后，在37℃水浴中反应40min，采用荧光分光光度计测量在激发波长为280nm时溶液的荧光光谱，根据不同浓度的As(V)与对应的Tb与QDs的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对As(V)的高灵敏和选择性检测，进而还可结合氧化处理来用于检测实际样品中无机砷总量，或在紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化来实现对As(V)的快速可视化分析。
上述方法中，步骤(1)所述的HEPES缓冲溶液的浓度为25mM，pH为7.4；步骤(2)所述的HEPES缓冲溶液的浓度为50mM，pH为7.4，含25mM的Mg2+。
本发明的原理是：本发明通过一步自适应组装得到量子点@铽离子-单磷酸鸟嘌呤核苷酸(QDs@Tb-GMP)纳米复合物，在单一激发波长下可同时发射QDs和Tb的荧光信号；在酸性磷酸酶(ACP)存在时，ACP催化GMP水解而破坏QDs@Tb-GMP的结构，切断了GMP向Tb的能量传递途径，从而导致Tb的绿色荧光淬灭，而QDs在652nm处的红色荧光不变；当As(V)存在时，As(V)可与ACP的活性位点结合而抑制ACP的活性，使得ACP不能催化GMP水解，QDs@Tb-GMP的结构中的GMP可以向Tb传递能量，QDs@Tb-GMP中Tb的绿色荧光不被淬灭；随着As(V)浓度的增大，ACP的活性逐渐减弱而对GMP的水解能力下降，Tb的绿色荧光逐渐恢复。
本发明在对As(V)含量的检测的应用时，溶液中的Tb与QDs的荧光信号强度的比值(I547/I652)与As(V)浓度在0.5-200ppb范围内呈线性，检测限为0.39ppb；此外，在紫外灯下，随着As(V)浓度的增加，QDs@Tb-GMP溶液从红紫色变化为橙色，根据溶液颜色变化可实现对As(V)的可视化分析。
本发明相较于现有技术，其有益效果在于：
1、制备得到的QDs@Tb-GMP具有制备简便、水溶性好、环境友好等优点；
2、本发明提出的检测溶液中的As(V)浓度的比率荧光法可修正环境的干扰并排除激发光强度的波动，提高了As(V)定量分析的精确性，而且还可结合氧化处理来检测样品中无机砷总量。
附图说明
图1是(A)QDs、(B)Tb-GMP和(C)QDs@Tb-GMP的透射电镜图。
图2是(A)(a)QDs、(b)Tb-GMP和(c)QDs@Tb-GMP的荧光发射光谱图；(B)(a)QDs@Tb-GMP、(b)QDs@Tb-GMP+ACP、(c)Tb-guanosine和(d)QDs@Tb-GMP+As(V)/ACP的荧光发射光谱图。
图3是(A)溶液pH值对QDs@Tb-GMP的荧光和ACP活性的影响，(B)ACP与QDs@Tb-GMP的反应时间优化，(C)As(V)与ACP的结合时间优化，(D)ACP用量优化。
图4是(A)QDs@Tb-GMP对不同浓度As(V)的荧光光谱图。(B)I547/I652对As(V)的校准曲线。
图5是QDs@Tb-GMP对As(V)检测的选择性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此；
实施例1
制备QDs@Tb-GMP纳米复合物：将10μL 8μM的QDs溶液、100μL 10mM的GMP溶液与800μL25mM pH 7.4的HEPES缓冲溶液混合，再向溶液中加入100μL 10mM的Tb3+溶液，并立刻剧烈震荡使溶液混合均匀，将得到黄色浑浊溶液在10000rpm转速下离心10min，收集黄色沉淀，用超纯水清洗沉淀三次，将得到的黄色沉淀产物分散在1mL25mMpH7.4的HEPES缓冲溶液中，制成QDs@Tb-GMP溶液；
采用透射电镜(TEM)分别对QDs、Tb-GMP和QDs@Tb-GMP进行表征，结果如图1所示。其中，图1为QDs、Tb-GMP和QDs@Tb-GMP的TEM图。在QDs的TEM图中清晰可见均匀的且单独分离的量子点(图1A)，而Tb-GMP(铽配位聚合物)则是无定型超分子网络结构(图1B)，QDs@Tb-GMP纳米复合物中，QDs表面覆盖了一层无定形超分子网状物，表明通过QDs、Tb和GMP的组装，Tb-GMP层通过Tb3+连接作用锚定在QDs表面(图1C)。
采用荧光光谱法分别对QDs、Tb-GMP CPs和QDs@Tb-GMP进行表征，结果如图2所示。其中，图2A为QDs、Tb-GMP和QDs@Tb-GMP的荧光光谱图。由图2A可见，在激发波长为280nm时，QDs在652nm处有发射峰(曲线a)，而Tb-GMP CPs中的Tb3+的四个特征发射峰分别为492nm、547nm、588nm和620nm(曲线b)，这是由于鸟嘌呤碱基到Tb3+中5D4发射态的能量转移所致。在Tb3+的连接作用下，自组装所得QDs@Tb-GMP的荧光光谱兼具QDs和Tb3+的特征荧光发射峰(曲线c)，因此，上述荧光光谱表明通过QDs、Tb和GMP的一步适应性自组装可以制备QDs@Tb-GMP纳米复合物。图2B为QDs@Tb-GMP、QDs@Tb-GMP+ACP、Tb-guanosine和QDs@Tb-GMP+As(V)/ACP的荧光光谱图。由图2B可见，与QDs@Tb-GMP的荧光光谱(曲线a)相比，向QDs@Tb-GMP中加入ACP后，Tb3+的特征荧光强度明显降低(曲线b)，而当含有ACP的QDs@Tb-GMP溶液中同时还含有As(V)时，As(V)与ACP反应，使得ACP的活性受到抑制而不能有效催化GMP水解，QDs@Tb-GMP+As(V)/ACP的荧光强度(曲线d)比QDs@Tb-GMP+ACP的荧光强度(曲线b)明显升高，QDs的荧光保持不变，而Tb3+-鸟嘌呤(Tb-guanosine)没有荧光发射信号(曲线c)。因此，基于QDs@Tb-GMP纳米复合物与酶抑制策略的比率荧光方式可用于对As(V)的定量分析。
此外，将QDs、Tb-GMP、QDs@Tb-GMP溶液分别在365nm紫外灯照射，观察溶液的颜色变化，QDs溶液在在紫外灯下显红色，Tb-GMP显示绿色荧光，而QDs@Tb-GMP溶液则显示出两种颜色的复合色。
实施例2
实验条件的优化：对影响材料荧光和分析性能的主要实验条件进行了详细考察，包括反应pH、ACP与QDs@Tb-GMP反应时间、As(V)与ACP的结合时间以及ACP用量。
由图3A可见，QDs@Tb-GMP的荧光依赖pH而变化。在pH 5.0或pH 8.0的偏酸性或偏碱性的环境中，由于Tb3+水合物的形成或配体的质子化导致Tb3+-GMP解离而荧光减弱。当pH为7.4时，荧光比值I547/I652最大。当存在ACP时，不同pH条件下ACP对GMP的水解反应程度不同，I547/I652在pH 7.4时达到最大。因此，选用pH 7.4为最佳反应pH。
图3B为不同浓度的ACP在不同反应时间对QDs@Tb-GMP的荧光强度的动力学表征图。ACP与QDs@Tb-GMP反应40min后，随时间继续延长而荧光比值I547/I652变化很小，因此，选择40min作为ACP与QDs@Tb-GMP的反应时间。
图3C为As(V)与ACP结合时间对酶活性的影响。当结合时间从0逐步延长到90min时，荧光比值I547/I652逐渐升高，当结合时间超过90min时，荧光比值I547/I652保持不变。因而As(V)与ACP的结合时间选用90min。
图3D为ACP的用量对As(V)的分析效果的影响。不同浓度的ACP与80ppb As(V)反应后，荧光比值I547/I652逐渐降低。当以不存在As(V)时的I547/I652为参考时，相对应的差值Δ(I547/I652)在ACP浓度为160U/L达到最大。因此，160U/L的ACP用作As(V)分析的最佳用量。
实施例3
比率荧光法检测As(V)
将20μL 800U/L的ACP溶液、不同浓度的As(V)溶液和50μL 50mMpH7.4且含25mMMg2+的HEPES缓冲溶液混合，用超纯水稀释到总体积为100μL，在37℃水浴中反应90min，再加入150μL的QDs@Tb-GMP溶液，漩涡混匀后，在37℃水浴中反应40min，采用荧光分光光度计测量在激发波长为280nm时溶液的荧光光谱。由图4A可见，当As(V)浓度从0逐渐增加到200ppb时，Tb与QDs的荧光强度的比值I547/I652也不断增大。这是由于随着As(V)浓度的增加，ACP的活性降低，导致GMP水解反应效率降低，因而Tb的荧光逐步上升。通过荧光比值I547/I652对As(V)浓度做校准曲线，I547/I652与As(V)浓度在0.5-11ppb和11-200ppb范围内呈线性关系，方法的检测限为0.39ppb，远低于WHO对饮用水中砷的最高限定值10ppb。
对本发明方法的选择性进行了考察。由图5可见，10ppb的As(V)使得QDs@Tb-GMP的荧光强度发生明显变化，而100ppb的其他常见金属离子包括As(III),NH4 +,Na+,K+,Ag+,Fe3 +,Cr3+,Al3+,Hg2+,Cd2+,Co2+,Cu2+,Ni2+,Pb2+,Fe2+,Ca2+,Mg2+等几乎不影响QDs@Tb-GMP的荧光信号，表明QDs@Tb-GMP对As(V)检测具有良好的选择性。
实施例4
紫外灯照下，随着As(V)浓度的变化，Tb-GMP溶液的颜色变化较为单一且不易辨别。当As(V)浓度从0增大到1.5ppm时，QDs@Tb-GMP溶液从红紫色逐渐变为橙色，这种清晰易辨别的颜色变化有利于裸眼观察。因此，QDs@Tb-GMP可用于可视化分析样品中的As(V)。
实施例5
采集赣江南昌段的水、前湖水、润溪湖水作为实际水样。所采集的江水和湖水首先经过12000rpm转速离心5min去除颗粒物，再经过0.22μm微孔膜过滤去除细小颗粒和微生物杂质。采用本发明构建的比率荧光方法和ICP-MS法分别对实际水样中As(V)的污染水平进行分析，向水样中加入10ppb的As(V)标准溶液后，采用本发明构建的比率荧光法进行分析，获得的结果与ICP-MS法的测定结果进行比较。以HNO3与H2O2(2:1,V/V)混合溶液作为强氧化剂对水样进行氧化处理，氧化处理后的溶液经过加热和调节pH为中性，采用本发明构建的比率荧光法测定氧化后的空白水样以及加入10ppb As(V)标准溶液后的水样中的As(V)含量，并以ICP-MS法测定结果作比较，每个样品进行三次平行测定。结果表明，采用本发明构建的比率荧光分析法未检测出赣江水中砷的存在，而前湖水和润溪湖水中的As(V)含量分别为0.81ppb和1.61ppb，以上结果与ICP-MS测定结果之间的相对误差分别为6.6％和5.9％。此外，由于水中可能存在As(III)，进一步对水样进行氧化处理后再分析，本发明构建的比率荧光法分析氧化处理后的赣江水，仍未检测到砷的存在，而前湖水和润溪湖水中检测到的砷总量分别为2.31ppb和6.67ppb，所得结果与ICP-MS测定结果相一致。以上结果表明，本发明构建的比率荧光法对As(V)和无机砷总量的分析具有良好的准确性，可用于对实际水样分析。

Claims (4)

1.基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在于，包括以下步骤：
将20μL 800U/L的酸性磷酸酶溶液、不同浓度的As(V)溶液和50μL HEPES缓冲溶液混合，用超纯水稀释到总体积为100μL，在37℃水浴中反应90min，再加入150μL的QDs@Tb-GMP溶液，漩涡混匀后，在37℃水浴中反应40min，采用荧光分光光度计测量溶液在激发波长为280nm时的荧光光谱，根据不同浓度的As(V)与对应的Tb与QDs的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对As(V)的高灵敏和选择性检测，或还可结合氧化处理检测实际样品中无机砷总量，或在紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化来实现对As(V)的快速可视化分析。
2.根据权利要求1所述基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在于，所述HEPES缓冲溶液的浓度为50mM，pH为7.4，含25mM的Mg2+。
3.根据权利要求1所述基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在于，所述QDs@Tb-GMP溶液的制备方法包括以下步骤：
将10μL 8μM的QDs溶液、100μL 10mM的GMP溶液与800μL HEPES缓冲溶液混合，再向溶液中加入100μL 10mM的Tb3+溶液，并立刻剧烈震荡使溶液混合均匀，将得到黄色浑浊溶液在10000rpm转速下离心10min，收集黄色沉淀，用超纯水清洗沉淀三次，将得到的黄色沉淀产物分散在1mL HEPES缓冲溶液中，制成QDs@Tb-GMP溶液。
4.根据权利要求3所述基于酸性磷酸酶活性抑制原理的比率荧光法检测As(V)，其特征在于，所述HEPES缓冲溶液的浓度为25mM，pH为7.4。
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