CN104988229A - 一种精子dna碎片检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种精子dna碎片检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法。试剂盒包括Ⅰ液盐酸；Ⅱ液：氯化钠、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、3－巯基－1,2－丙二醇的混合液；还包括琼脂糖包被的载玻片、低熔点琼脂糖、瑞氏染液、瑞氏缓冲液等；本试剂盒检测结果可靠性，精子染色质量等都得到极大的提高；试剂盒检测结果图像清晰，形成的光晕清晰且与头部分界明显，便于判定精子DNA损伤程度；本发明试剂盒及其检测方法有利于实验室的标准化，分析费用低，不需要特殊仪器和试剂，运用范围广，满足中小型实验室检测需求，也可适用于单个精子的DNA碎片检测；可与后期自动化仪器兼容，用于大型实验室检测，提高检测效率。

Description

一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，尤其属于DNA检测技术领域，特别涉及一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
遗传物质的完整性对于成功妊娠和子代的健康是至关重要的,DNA碎片程度能够反映精子遗传物质的完整性,深入的评估男性生育力,预测治疗结局和指导治疗。目前常用的检测精子DNA碎片的方法主要有：精子染色质结构分析试验,单细胞凝胶电泳试验,末端转移酶介导的dUTP末端标记法,荧光原位杂交技术,8-羟基脱氧鸟苷测定等。然而这些方法大都需要流式细胞仪或荧光显微镜分析观察，或检测试剂昂贵或步骤繁琐，限制了这些方法的临床应用。
精子染色质扩散试验检测方法是利用正常精子经过酸处理去除核蛋白后,精子染色质结构松散,DNA环附于残留的核结构,形成光晕。精子染色质损伤处产生单链DNA片断,从而抑制了DNA光晕的扩散，根据光晕的大小可区分精子DNA损伤程度。
中国申请201410203476.5公开了一种精子DNA碎片检测试剂盒，所述试剂盒包括包被载玻片，易熔凝胶，A液，B液，瑞氏染液，瑞氏缓冲液，SCD保存液。该申请还公开了应用试剂盒对精子DNA碎片的检测方法。该申请所述SCD保存液，可以有效的保存精液标本，使DNA碎片率在-20℃冻存两个星期内不发生变化，利于标本保存；但其配方及其检测过程方法精子尾部显色效果不好，计数的准确率有待提高。
发明内容
本发明根据现有技术的不足公开了一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法。本发明要解决的问题是提供一种精子尾部显色效果更好，准确率更高，检测时间更短的用于精子DNA碎片检测试剂盒组成及其应用检测方法。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括：
Ⅰ液：含0.04～0.08mol/L盐酸；
Ⅱ液：含7.305～146.1g/L氯化钠、1.86～37.2g/L乙二胺四乙酸、0.0607～1.214g/L三羟甲基氨基甲烷、0.5～20g/L十二烷基肌氨酸钠、1～20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32～86.4mL/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH＝7～7.5；
0.5～2％琼脂糖包被的载玻片；
0.5～2％低熔点琼脂糖；
盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；
其中“％”表示重量百分比浓度。
上述试剂盒各组成制备方法如下：
一、Ⅰ液的制备方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，量取浓盐酸0.335～6.7mL，加入容量瓶中，搅拌混匀。
2)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。
二、Ⅱ液的制备方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取氯化钠7.305～146.1g、乙二胺四乙酸1.86～37.2g、三羟甲基氨基甲烷0.0607～1.214g、十二烷基肌氨酸钠0.5～20g，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。
2)量取聚乙二醇辛基苯基醚1～20mL、3－巯基－1,2－丙二醇4.32～86.4mL，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。
3)在PH检测下，缓慢加入氢氧化钠，调节PH至7～7.5。
4)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。
三、琼脂糖包被的载玻片制作方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。
2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。
3)趁热将2)中溶液至载玻片表面平铺，烤干。
四、低熔点琼脂糖的制作方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。
2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。
3)趁热将2)中溶液分装至1.5mL样品管中，每管0.12mL。
五、瑞氏染液及瑞氏缓冲液有市售。
本发明还提供了采用所述试剂盒进行精子DNA碎片的检测方法，包括以下步骤：
1)将低熔点琼脂糖加热充分溶解后，以60μL/管分装到1.5mL EP管内，4℃保存；
2)以生理盐水或PBS溶液将新鲜精液样本稀释为10～20×106个/mL；
3)取60μL低熔点琼脂糖溶化，在37℃孵育3分钟；
4)步骤2)稀释后样本溶液30μL与步骤3)低熔点琼脂糖60μL混匀,在37℃孵育2分钟；
5)取20μL步骤4)混合液滴于包被载玻片，并迅速盖上盖玻片，于4℃条件下静置5～7分钟，使其凝固；
6)取出步骤5)的玻片后小心移去盖玻片，立即将载玻片垂直浸入Ⅰ液反应池内7分钟；拭去载玻片背面多余液体后，将载玻片垂直浸入Ⅱ液反应池25分钟；拭去玻片背面多余液体后，置超纯水浸泡2～3分钟；
7)从步骤6)所述超纯水中取出后将载玻片分别依次置于50％乙醇溶液中2分钟,70％乙醇溶液中2分钟，95％乙醇溶液中2分钟，取出后自然晾干；
8)染片，每张载玻片以瑞氏染液4～6滴覆盖,稍等片刻再缓慢加入瑞氏缓冲液8～12滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液,室温放置15分钟后用流水轻轻冲洗染片；
9)晾干后，普通光学显微镜下观察，镜下观察100～500个精子，计算存在DNA碎片的精子数量；
上述“％”表示重量百分比浓度；
精子DNA碎片率由下式得到：
精子DNA碎片率(％)＝存在DNA碎片精子数/被观察精子总数×100％。
本发明有益性：本发明精子DNA碎片检测方法简单、快捷，结果可靠,有利于实验室的标准化，分析费用低，不需要特殊仪器和试剂，运用范围广，满足中小型实验室检测需求，也可适用于单个精子的DNA碎片检测；本试剂盒利用精子染色质扩散试验原理检测精子DNA碎片程度，结果可靠性，精子染色质量等方面都得到极大的提升；试剂盒检测结果图像清晰，形成的光晕清晰且与头部分界明显，便于判定精子DNA损伤程度，检测时间短，方便操作，可与后期自动化仪器兼容，完成自动化后可用于大型实验室检测，大大提高检测效率。
附图说明
图1是正常精液样本经本发明试剂盒所述方式检测精子DNA碎片的结果，精子DNA不存在碎片的精子头部周围可见明显光晕，且与头部分界明显，精子DNA存在碎片的精子头部周围没有明显光晕或有很小光晕。
图2是精液经过氧化氢处理后，通过本发明试剂盒所述方法检测精子DNA碎片，精子头部周围光晕不明显或有很小光晕。
由上图可看出在加入过氧化氢(已知的促进精子DNA损伤试剂)后，用本试剂盒发现精子的光晕消失，表明精子的DNA出现损伤，本发明试剂盒对精子染色效果好，光晕与背景的比值高。
图3是正常精液样本经本发明试剂盒所述方式检测精子DNA碎片的结果，精子DNA不存在碎片的精子头部周围可见明显光晕，且与头部分界明显，精子DNA存在碎片的精子头部周围没有明显光晕或有很小光晕。
图4是利用同类试剂盒产品方法检测精子DNA碎片，精子光晕不明显，分界不明确。
比较图3和图4，可知：本发明与同类产品的比对实验发现，本试剂盒的精子染色效果明显强于同类产品；光晕与背景的比值较高，提高了计数的准确性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。
一、精子DNA碎片检测试剂盒的制备
Ⅰ液：含0.04～0.08mol/L盐酸；
Ⅱ液：含7.305～146.1g/L氯化钠、1.86～37.2g/L乙二胺四乙酸、0.0607～1.214g/L三羟甲基氨基甲烷、0.5～20g/L十二烷基肌氨酸钠、1～20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32～86.4mL/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH＝7～7.5；
0.5～2％琼脂糖包被的载玻片；
0.5～2％低熔点琼脂糖；
盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；
其中“％”表示重量百分比浓度。
上述试剂盒各组成制备方法如下：
Ⅰ液的制备方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，量取浓盐酸0.335～6.7mL，加入容量瓶中，搅拌混匀。
2)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。
Ⅱ液的制备方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取氯化钠7.305～146.1g、乙二胺四乙酸1.86～37.2g、三羟甲基氨基甲烷0.0607～1.214g、十二烷基肌氨酸钠0.5～20g，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。
2)量取聚乙二醇辛基苯基醚1～20mL、3－巯基－1,2－丙二醇4.32～86.4mL，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。
3)在PH检测下，缓慢加入氢氧化钠，调节PH至7～7.5。
4)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。
琼脂糖包被的载玻片制作方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。
2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。
3)趁热将2)中溶液至载玻片表面平铺，烤干。
低熔点琼脂糖的制作方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。
2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。
3)趁热将2)中溶液分装至1.5mL样品管中，每管0.12mL。
瑞氏染液及瑞氏缓冲液有市售。
二、采用本发明精子DNA碎片检测试剂盒的检测方法
1)将低熔点琼脂糖加热充分溶解后，以60μL/管分装到1.5mL EP管内，4℃保存；
2)以生理盐水或PBS溶液将新鲜精液样本稀释为10～20×106个/mL；
3)取60μL低熔点琼脂糖溶化，在37℃孵育3分钟；
4)步骤2)稀释后样本溶液30μL与步骤3)低熔点琼脂糖60μL混匀,在37℃孵育2分钟；
5)取20μL步骤4)混合液滴于包被载玻片，并迅速盖上盖玻片，于4℃条件下静置5～7分钟，使其凝固；
6)取出步骤5)的玻片后小心移去盖玻片，立即将载玻片垂直浸入Ⅰ液反应池内7分钟；拭去载玻片背面多余液体后，将载玻片垂直浸入Ⅱ液反应池25分钟；拭去玻片背面多余液体后，置超纯水浸泡2～3分钟；
7)从步骤6)所述超纯水中取出后将载玻片分别依次置于50％乙醇溶液中2分钟,70％乙醇溶液中2分钟，95％乙醇溶液中2分钟，取出后自然晾干；
8)染片，每张载玻片以瑞氏染液4～6滴覆盖,稍等片刻再缓慢加入瑞氏缓冲液8～12滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液,室温放置15分钟后用流水轻轻冲洗染片；
9)晾干后，普通光学显微镜下观察，镜下观察100～500个精子，计算存在DNA碎片的精子数量；
上述“％”表示重量百分比浓度；
精子DNA碎片率由下式得到：
精子DNA碎片率(％)＝存在DNA碎片精子数/被观察精子总数×100％。
具体检测例和对比检测例
实施例一
本实例提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括：
Ⅰ液：含0.08mol/L盐酸；
Ⅱ液：含2.5mol/L氯化钠、0.1mol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷、2％十二烷基肌氨酸钠、2％聚乙二醇辛基苯基醚、0.8mol/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH＝7；
1％琼脂糖包被的载玻片；
1％低熔点琼脂糖；
盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；
其中“％”表示重量百分比浓度。
Ⅰ液的制备方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，量取浓盐酸6.7mL，加入容量瓶中，搅拌混匀。
2)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。
Ⅱ液的制备方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取氯化钠146.1g、乙二胺四乙酸37.2g、三羟甲基氨基甲烷1.214g、十二烷基肌氨酸钠20g，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。
2)量取聚乙二醇辛基苯基醚20mL、3－巯基－1,2－丙二醇86.4mL，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。
3)在PH检测下，缓慢加入氢氧化钠，调节PH至7～7.5。
4)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。
1％琼脂糖包被的载玻片制作方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。
2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。
3)趁热将2)中溶液至载玻片表面平铺，烤干。
1％低熔点琼脂糖的制作方法：
1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。
2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。
3)趁热将2)中溶液分装至1.5mL样品管中，每管0.12mL。
瑞氏染液及瑞氏缓冲液购买
本实例还提供了采用所述试剂盒进行精子DNA碎片的检测方法，包括以下步骤：
1)将1％低熔点琼脂糖加热充分溶解后，以60μL/管分装到1.5mL EP管内，4℃保存；
2)以生理盐水或PBS溶液将新鲜精液样本稀释为10～20×106个/mL；
3)取60μL1％低熔点琼脂糖溶化，在37℃孵育3分钟；
4)步骤2)稀释后样本溶液30μL与步骤3)1％低熔点琼脂糖60μL混匀,在37℃孵育2分钟；
5)取20μL步骤4)混合液滴于包被载玻片，并迅速盖上盖玻片，于4℃条件下静置5～7分钟，使其凝固；
6)取出步骤5)的玻片后小心移去盖玻片，立即将载玻片垂直浸入Ⅰ液反应池内7分钟；拭去载玻片背面多余液体后，将载玻片垂直浸入Ⅱ液反应池25分钟；拭去玻片背面多余液体后，置超纯水浸泡2～3分钟；
7)从步骤6)所述超纯水中取出后将载玻片分别依次置于50％乙醇溶液中2分钟,70％乙醇溶液中2分钟，95％乙醇溶液中2分钟，取出后自然晾干；
8)染片，每张载玻片以瑞氏染液4～6滴覆盖,稍等片刻再缓慢加入瑞氏缓冲液8～12滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液,室温放置15分钟后用流水轻轻冲洗染片；
9)晾干后，普通光学显微镜下观察，镜下观察100～500个精子，计算存在DNA碎片的精子数量；
上述“％”表示重量百分比浓度；
精子DNA碎片率由下式得到：
精子DNA碎片率(％)＝存在DNA碎片精子数/被观察精子总数×100％。
精子DNA碎片判定标准：精子头部未产生光晕或仅有很小光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。
选取样本进行具体检测得到如图1、图3所示镜下结果。
实施例二
选取与图1相同的样本，检测过程中加入适量过氧化氢，采用与实施例一相同的方法检测，得到如图2所示镜下结果。如图所示可见，在加入过氧化氢后，用本试剂盒发现精子的光晕消失，表明精子的DNA出现损伤。
具体加入过氧化氢的方法是：在检测方法步骤2)新鲜精液样本稀释为10～20×106个/mL后，加入过氧化氢溶液100μL，在37℃孵育10分钟，再进行步骤3)琼脂糖溶化及其后续孵育。
实施例三
选取与图3相同的样本，采用市售某试剂盒检测，得到如图4所示镜下结果。如图所示可见，本发明与同类产品的比对实验发现，本试剂盒的精子染色效果明显强于同类产品；光晕与背景的比值较高，提高了计数的准确性。同时计算两组试验批内以及批间精密度，本发明批内精密度为6.71％，批间精密度为13.57％；同类产品批内精密度为21.76％，批间精密度为33.83％。说明本发明稳定性与准确性高于同类产品。

Claims (4)

1.一种精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于：
试剂盒包括：
Ⅰ液：含0.04～0.08mol/L盐酸；
Ⅱ液：含7.305～146.1g/L氯化钠、1.86～37.2g/L乙二胺四乙酸、0.0607～1.214g/L三羟甲基氨基甲烷、0.5～20g/L十二烷基肌氨酸钠、1～20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32～86.4mL/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH=7～7.5；
0.5～2%琼脂糖包被的载玻片；
0.5～2%低熔点琼脂糖；
盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；
其中“%”表示重量百分比浓度。
2.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于：
试剂盒包括：
Ⅰ液：含0.08mol/L盐酸；
Ⅱ液：含2.5mol/L氯化钠、0.1mol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷、2%十二烷基肌氨酸钠、2%聚乙二醇辛基苯基醚、0.8mol/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH=7～7.5；
1%琼脂糖包被的载玻片；
1%低熔点琼脂糖；
盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；
其中“%”表示重量百分比浓度。
3.一种权利要求1或2所述精子DNA碎片检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
Ⅰ液的制备方法：
1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，量取浓盐酸0.335～6.7mL，加入容量瓶中，搅拌混匀；
2）以纯水定容至1000mL，搅拌混匀；
Ⅱ液的制备方法：
1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取氯化钠7.305～146.1g、乙二胺四乙酸1.86～37.2g、三羟甲基氨基甲烷0.0607～1.214g、十二烷基肌氨酸钠0.5～20g，加入容量瓶中，搅拌使其溶解；
2）量取聚乙二醇辛基苯基醚1～20mL、3－巯基－1,2－丙二醇4.32～86.4mL，加入容量瓶中，搅拌使其溶解；
3）在PH检测下，缓慢加入氢氧化钠，调节PH至7～7.5；
4）以纯水定容至1000mL，搅拌混匀；
琼脂糖包被的载玻片制作方法：
1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解；
2）取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解；
3）趁热将2）中溶液至载玻片表面平铺，烤干；
低熔点琼脂糖的制作方法：
1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解；
2）取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解；
3）趁热将2）中溶液分装至1.5mL样品管中，每管0.12mL。
4.一种权利要求1或2所述精子DNA碎片检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将低熔点琼脂糖加热充分溶解后，以60μL／管分装到1.5mL EP管内，4℃保存；
2）以生理盐水或PBS溶液将新鲜精液样本稀释至10～20×106个/mL；
3）取60μL低熔点琼脂糖溶化，在37℃孵育3分钟；
4）步骤2）稀释后样本溶液30μL与步骤3）低熔点琼脂糖60μL混匀,37℃孵育2分钟；
5）取20μL步骤4）混合液滴于包被载玻片，并迅速盖上盖玻片，于4℃条件下静置5～7分钟，使其凝固；
6）取出步骤5）的玻片后小心移去盖玻片，立即将载玻片垂直浸入Ⅰ液反应池内7分钟；拭去载玻片背面多余液体后，将载玻片垂直浸入Ⅱ液反应池25分钟；拭去玻片背面多余液体后，置超纯水浸泡2～3分钟；
7）从步骤6）所述超纯水中取出后将载玻片分别依次置于50%乙醇溶液中2分钟,70%乙醇溶液中2分钟，95%乙醇溶液中2分钟，取出后自然晾干；
8）染片，每张载玻片以瑞氏染液4～6滴覆盖,稍等片刻再缓慢加入瑞氏缓冲液8～12滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液,室温放置15分钟后用流水轻轻冲洗染片；
9）晾干后，普通光学显微镜下观察，镜下观察100～500个精子，计算存在DNA碎片的精子数量；
上述“%”表示重量百分比浓度；
精子DNA碎片率由下式得到：
精子DNA碎片率(%)=存在DNA碎片精子数／被观察精子总数×100%。
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