CN105606817A - 一种改良的蛋白印迹实验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药卫生领域，尤其涉及一种改良的蛋白凝胶、其制备方法及应用，所述蛋白凝胶包括分离胶和浓缩胶，所述分离胶通过A液和B液等体积混合后加入N,N,Nˊ,Nˊ-四甲基二乙胺和过硫酸铵制备得到；所述浓缩胶通过C液和D液等体积混合后加入N,N,Nˊ,Nˊ-四甲基二乙胺和过硫酸铵制备得到；其中，A液为Tris溶液，B液为丙烯酰胺和SDS的混合溶液，C液为Tris和SDS的混合溶液，D液为丙烯酰胺溶液。本发明的蛋白凝胶配制快速便捷，无需计算各组分的重量，减少因计算带来的实验上的误差和失误；同时制备的蛋白凝胶可以保存2个月以上，且还是使用原缓冲液，也无需额外设备，使得实验成本降低。

Description

一种改良的蛋白印迹实验方法
技术领域
本发明涉及医药卫生领域，尤其涉及一种改良的蛋白凝胶、其制备方法及应用。
背景技术
蛋白印迹实验是用来对各种来源的蛋白进行定性及半定量的检测方法，是用来对组织或细胞中的蛋白含量进行检测，该实验方法一直以来被医院检验科、高校生物专业研究生、科研学者等用来对动物、植物以及细胞内蛋白的含量进行测定，已广泛应用于蛋白的检测、抗体活性检测和疾病早期诊断等方面，被认为是鉴定特定蛋白的可靠方法，因此，快速精确的蛋白印迹实验方法就显得尤为重要。
传统的蛋白印迹试剂配方在实验过程中，需要计算每个试剂的用量和比例，致使实验耗时较长，而且可能在实验的过程中产生失误，费用也比较高。
CN102879581A公开了一种改良的蛋白印迹实验，该发明改良了蛋白印迹实验所需要的试剂和需要进行的实验步骤，使蛋白印迹实验所需要的试剂耗费减少，时间缩短，同时保证了实验的速度和高质量的实验结果。但是仍然精准度不够，还是需要计算试剂的用量和比例，容易导致失误。因此，快速精确的蛋白印迹实验方法就显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种改良的蛋白凝胶、其制备方法及应用，所述方法简单，无需计算试剂的用量，节省实验时间，且结果精准。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种改良的蛋白凝胶，所述蛋白凝胶包括分离胶和浓缩胶，所述分离胶通过A液和B液等体积混合后加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺和过硫酸铵制备得到；所述浓缩胶通过C液和D液等体积你混合后加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺和过硫酸铵制备得到；
其中，A液为Tris溶液，B液为丙烯酰胺和SDS的混合溶液，C液为Tris和SDS的混合溶液，D液为丙烯酰胺溶液。
优选地，所述A液中Tris溶液和H2O的体积比为25:24。
优选地，所述B液中丙烯酰胺的浓度为20-35％，例如可以是20％、21％、22％、23％、25％、26％、28％、30％、31％、32％、33％、34％或35％，优选为28-32％，进一步优选为30％。
优选地，所述B液中SDS的浓度为5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，选为8-12％，进一步优选为10％。
优选地，所述丙烯酰胺、SDS和H2O的体积比为33：1：150。
优选地，所述C液中SDS的浓度为5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，优选为8-12％，进一步优选为10％。
优选地，所述Tris、SDS和H2O的体积比为73：10：200。
优选地，所述D液中丙烯酰胺的浓度为20-35％，例如可以是20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％，优选为28-32％，进一步优选为30％。
优选地，所述30％丙烯酰胺和H2O的体积比为83:200。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将分离胶缓冲A液和B液等体积混匀；
(2)向步骤(1)得到的混合溶液加入10％的过硫酸铵溶液和TEMED，混匀，得到分离胶；
(3)将步骤(2)配好的分离胶注入制胶玻璃板中，用双蒸水或无水乙醇封盖在分离胶以上；
(4)待步骤(3)分离胶凝固后，倒去双蒸水或无水乙醇；
(5)将浓缩胶缓冲A液和B液等体积混匀；
(6)向步骤(5)得到的混合溶液加入10％的过硫酸铵溶液和TEMED，混匀，得到浓缩胶；
(7)将步骤(6)制成的浓缩胶注入制胶玻璃板中，插入梳子；
(8)待步骤(7)的浓缩胶凝固后，即可用于跑胶。
优选地，步骤(2)所述的10％的过硫酸铵溶液和TEMED的体积比为(10-30)：1，例如可以是10：1、11：1、12：1、13：1、15：1、16：1、18：1、20：1、21：1、22：1、23：1、25：1、26：1、28：1、29：1或30：1，优选为20:1。
优选地，步骤(6)所述的10％的过硫酸铵溶液和TEMED的体积比为(1-20)：1，例如可以是1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、15：1、16：1、18：1或20：1、优选为10:1。
第三方面，本发明提供一种蛋白凝胶试剂盒，包含第一方面所述的蛋白凝胶。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的蛋白凝胶配制快速便捷，无需计算各组分的重量，减少因计算带来的实验上的误差和失误；
(2)本发明的蛋白凝胶加入TEMED/APS后即可灌胶，并且分离胶和浓缩胶之间不需压胶，等待30min后即可跑胶，且跑胶时间短，3-20min即可完成，大大缩短了整个配胶跑胶的时间；
(3)本发明制备的蛋白凝胶可以保存2个月以上，且还是使用原缓冲液，也无需额外设备，使得实验成本降低。
附图说明
图1是本发明改良的蛋白印迹实验的marker电泳结果图；
图2是本发明改良的蛋白印迹实验第一次的电泳结果图；
图3是本发明改良的蛋白印迹实验一个月后第二次的电泳结果图；
图4是本发明改良的蛋白印迹实验两个月后第三次的电泳结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1蛋白胶的制备
蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将分离胶缓冲A液2.5mL和B液2.5mL等体积混匀；
(2)向步骤(1)得到的混合溶液加入60μL10％的过硫酸铵溶液和3μLTEMED，混匀，得到分离胶；
(3)将步骤(2)配好的分离胶注入制胶玻璃板中，用双蒸水或无水乙醇封盖在分离胶以上；
(4)待步骤(3)分离胶凝固后，倒去双蒸水或无水乙醇；
(5)将浓缩胶缓冲A液2mL和B液2mL等体积混匀；
(6)向步骤(5)得到的混合溶液加入20μL10％的过硫酸铵溶液和2μLTEMED，混匀，得到浓缩胶；
(7)将步骤(6)制成的浓缩胶注入制胶玻璃板中，插入梳子；
(8)待步骤(7)的浓缩胶凝固后，即可用于跑胶。
实施例2跑胶实验
将marker放入配制好的胶板中，300V20min后观察结果，结果如图1所示；
将得到的蛋白样品放入配制好的胶板中，300V20min后观察结果，结果如图2所示；
将得到的蛋白样品过一个月后放入配制好的胶板中，300V20min后观察结果，结果如图3所示；
将得到的蛋白样品过两个月后放入配制好的胶板中，300V20min后观察结果，结果如图4所示；
(a)电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热；
(b)随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟；
(c)倒出染色液(染色液可以回收重复使用至少2-3次)；
(d)加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶；
(e)微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热；
(f)随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟，可以观察到比较清楚的蛋白条带。
从图1-4可以看出，本发明蛋白胶跑出的结果清晰可见，制备的蛋白凝胶可以保存2个月以上，且还是使用原缓冲液，跑胶时间只需20min，节约成本，省时省力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种改良的蛋白凝胶，所述蛋白凝胶包括分离胶和浓缩胶，其特征在于，所述分离胶通过A液和B液等体积混合后加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺和过硫酸铵制备得到；所述浓缩胶通过C液和D液等体积混合后加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺和过硫酸铵制备得到；
其中，A液为Tris溶液，B液为丙烯酰胺和SDS的混合溶液，C液为Tris和SDS的混合溶液，D液为丙烯酰胺溶液。
2.根据权利要求1所述的蛋白凝胶，其特征在于，所述A液中Tris溶液和H2O的体积比为25:24。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白凝胶，其特征在于，所述B液中丙烯酰胺的浓度为20-35％，优选为28-32％，进一步优选为30％；
优选地，所述B液中SDS的浓度为5-15％，优选为8-12％，进一步优选为10％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白凝胶，其特征在于，所述丙烯酰胺、SDS和H2O的体积比为33：1：150。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白凝胶，其特征在于，所述C液中SDS的浓度为5-15％，优选为8-12％，进一步优选为10％；
优选地，所述Tris、SDS和H2O的体积比为73：10：200。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白凝胶，其特征在于，所述D液中丙烯酰胺的浓度为20-35％，优选为28-32％，进一步优选为30％；
优选地，所述30％丙烯酰胺和H2O的体积比为83:200。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将分离胶缓冲A液和B液等体积混匀；
(2)向步骤(1)得到的混合溶液加入10％的过硫酸铵溶液和TEMED，混匀，得到分离胶；
(3)将步骤(2)配好的分离胶注入制胶玻璃板中，用双蒸水或无水乙醇封盖在分离胶以上；
(4)待步骤(3)分离胶凝固后，倒去双蒸水或无水乙醇；
(5)将浓缩胶缓冲A液和B液等体积混匀；
(6)向步骤(5)得到的混合溶液加入10％的过硫酸铵溶液和TEMED，混匀，得到浓缩胶；
(7)将步骤(6)制成的浓缩胶注入制胶玻璃板中，插入梳子；
(8)待步骤(7)的浓缩胶凝固后，即可用于跑胶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的10％的过硫酸铵溶液和TEMED的体积比为(10-30)：1，优选为20:1。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的10％的过硫酸铵溶液和TEMED的体积比为(1-20)：1，优选为10:1。
10.一种蛋白胶试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的蛋白凝胶。
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