CN1636058B - 新型丙氨酸转氨酶及其应用方法 - Google Patents

Abstract

一种新的丙氨酸转氨酶基因(ALT2)已从人类组织中分离出来，ALT2特异性核酸、蛋白质及其抗体已描述如上。ALT2主要在肝脏、肾脏、脑、肌肉和脂肪组织中表达。ALT2可用作产生ALT2的组织的损伤和疾病的诊断。

Description

新型丙氨酸转氨酶及其应用方法 

相关申请 

本发明由美国国立卫生院糖尿病、消化病及肾病研究院基金(R21DK57835-01)资助，美利坚合众国政府拥有该发明的一定权益。 

本申请要求2001年5月14日提交的美国专利申请60/290,829的优先权，后者可作为本申请的参考文件。 

技术领域

本发明是相关于人类丙氨酸转氨酶(ALT)的一种新型同功酶，ALT2，及其应用该酶作为预测和监测组织损伤和/或功能异常的标记。本发明与应用检测ALT2作为诊断包括各种病因引起的组织损伤和/或功能异常，这些病因包括，但不限于肝炎、非酒精性肝脂肪变性(NASH)、脂肪肝、肝硬化、药物性肝炎及肌肉、脑、肾及脂肪等组织的异常。

背景技术

丙氨酸转氨酶(ALT)[EC2.6.1.2.，也称谷氨酰丙酮酸氨基转移酶(GPT)或丙氨酸氨基转移酶]是可逆行催化丙氨酸与α酮戊二酸反应生成谷氨酸及丙酮酸的一种吡哆醛酶。很多组织包括肝、肌肉、肾、心脏和脑组织均有ALT活性。ALT通过调节以上四种主要中间代谢产物之间的相互转换在葡萄糖异生和氨基酸代谢中起重要作用。在肌肉及某些其它组织，当氨基酸分解作为能量来源时，谷氨酰作为氨基供体，ALT将谷氨酰的α氨基基团转移至丙酮酸生成丙氨酸，后者是饥饿时血液中的主要氨基酸。丙氨酸被肝脏摄取，通过ALT作用转化为丙酮酸，进而用于合成葡萄糖，形成所谓的丙氨酸葡萄糖循环(Felig，Theglucose-alanine cycle，Metabolism 22：179-207(1973))。该循环在骨骼肌 进行剧烈耗氧运动时亦非常重要，因为这一过程中不但有由蛋白质分解产生氨基，而且还通过糖酵解产生大量丙酮酸。此外，亦有发现丙氨酸转氨作用在脑神经递质谷氨酰胺的合成中起重要作用(Peng，et al.，Utilization of alpha-ketoglutarate as a precursor for transmitter glutaminein cultured cerebellar granule cells，Neurochem.Res.16：29-34(1991))。在培养的脑颗粒细胞中，α酮戊二酸与氨基供体(丙氨酸)相结合作为谷氨酰库的前体，在钾诱导细胞去极化时，释放谷氨酰。转氨抑制剂氨基乙醇酸可抑制谷氨酰的合成，提示ALT参与这一重要抑制性神经递质的合成。

ALT已被作为肝功能的血清学标记应用于临床医学。当药物毒性、感染(细菌、病毒、真菌、原虫或其它有核生物)、酒精或肝脂肪变性等原因引起肝损害时，血清ALT水平明显升高(Dufour，et al.，Diagnosisand monitoring of hepatic injury.II.Recommendations for use forlaboratory tests in screening，diagnosis，and monitoring，Clin.Chem.46：2050-2068(2000)；Sherman，K.E.，Alanine aminotransferase in clinicalpractice，Arch.Intern.Med.151：260-265(1991))。

由于细胞更新，正常周围血循环中存在很低ALT水平。普遍认为肝脏含有最高ALT水平(Pratt and Kaplan，supra)。肝脏中ALT水平与血循环中ALT水平相差约2000到3000倍(Lott，J.A.，Alanine andaspartate aminotransferase(ALT and AST)，Year Book Medical Publisher，Chicago，111-138(1986))。因此血清、血浆或全血中ALT水平升高被认为是肝脏损伤时肝细胞ALT“漏出”到血循环的一种标记。通常，不同性质肝脏损伤导致不同程度的血ALT升高(Dufour，et al.，Diagnosisand monitoring of hepatic injury.I.Performance characteristics oflaboratory tests，Clin.Chem.，46：2027-2049(2000)；Dufour，II，supra；andSherman，supra)。血转氨酶活性明显升高(高于正常8到10倍)提示有病毒性肝炎或药物引起的肝损害。血清ALT慢性轻度升高(高于正常2到8倍)提示由慢性肝炎、脂肪肝或肝脂肪变性。但是血清ALT 水平与肝脏损伤的原因之间相关的机制仍然不明。

尽管血清ALT已广泛应用于临床生化，但由于其在某些情况并不能正确地预示疾病，该检测仍然存在一系列不足。最新研究质疑血清ALT检测对诊断肝病的特异性。很多其它疾病如肥胖、肌肉疾病、心力衰竭、血色病、Wilson氏病、α1抗糜蛋白酶缺乏症等亦常有血清ALT活性升高(参见Asayama，et al.，Relationships between an index ofbody fat distribution(based on waist and hip circumferences)and stature，and biochemical complications in obese children，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.，22：1209-16(1998)；Strauss，et al.，Prevalence of abnormalserum aminotransferase values in overweight and obese adolescents[seecomments]，J.Pediatr.136：727-33(2000)；Rutledge，et al.，Persistenthypertransaminasemia as the presenting finding of childhood muscledisease，Clin.Pediatr.(Phila).，24：500-503(1985)；Lin，et al.，Persistenthypertransaminasemia as the presenting findings of muscular dystrophy inchildhood，Taiwan Erh Ko I Hsueh Hui Tsa Chih.40：424-429(1999)；Lottand Landesman，The enzymology of skeletal muscle disorders，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，20：153-190(1984)；Friedman，et al.，Evaluation of blooddonors with elevated serum alanine aminotransferase levels，Ann.Intern.Med.，107：137-44(1987)；Lozano，et al.，Study of serumalanine-aminotransferase levels in blood donors in Spain，Haematologica， 83：237-239(1998))。血清ALT活性受年龄、性别、饮食及药物的影响，其升高也见于无任何症状病人或“健康”者(Sherman，supra；Pratt andKaplan，Evaluation of abnormal liver-enzyme results in asymptomaticpatients，N.Engl.J.Med.，342：1266-1271(2000)；Blanc and Redlich，Elevated liver enzymes in asymptomatic patients，N.Engl.J.Med.， 343：662；discussion 663(2000))。

曾有推论存在ALT同功酶，但迄今未有人成功分离到该同功酶。既往研究应用层析法分离细胞浆与线粒体，提示存在两种ALT活性， 即细胞浆ALT和线粒体ALT(Ziegenbein，R.， Two different forms ofglutamic pyruvic transaminase in rat heart and their intracellularlocalizatio

有关ALT的检测和产品信息可参见美国专利第5,952,211号和第5,804,402号。但是这两项专利均未提及可能导致改进目前用于肝损害的诊断分析方法的自然存在的人类ALT同功酶。

发明内容

本发明目标之一是含有序列编号2的氨基酸序列的ALT2蛋白质。

本发明的另一目标是编码ALT2多肽链的聚核苷酸序列，即序列编号1之序列及其该序列的类似体。

本发明的另一目标是与ALT2特异性结合的抗体。该抗体特异性结合ALT2而不结合ALT1。进一步，该抗体结合于序列编号2中ALT2序列和ALT2特异性片段或类似体，或者序列编号1之DNA序列所编码的蛋白质或ALT2特异性片段。

本发明的另一目标是ALT2的表达载体。该表达载体可以是质粒、科氏体、或者将编码ALT2的DNA序列与表达序列如启动子有效结合的其它形式载体。该ALT2的DNA序列包括序列编号1之序列、编码序列编号2之中氨基酸的相应DNA序列或编码序列编号2之氨基酸的类似物的相应DNA序列。

本发明的另一目标是检测样本中存在ALT2和/或ALT1信使核糖核酸的方法，该样本指生物(包括但不限于人和其它哺乳动物)的组织或体液。本发明宗旨也包括应用于检测样本中存在ALT2和/或ALT1信使核糖核酸的聚核苷酸探针。

本发明的另一目标为检测样本中存在ALT2和/或ALT1蛋白质的方法，该样本指生物(包括但不限于人和其它哺乳动物)的组织或体液。本发明宗旨也包括应用与ALT2或ALT1特异性结合的单克隆或多克隆抗体检测样本中存在ALT2和/或ALT1蛋白质。该样本包括各种体液如血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、脑脊液、肠液、关节液、齿龈液、阴道液和胸腔液。该样本 也包括各种组织如肝、脑、肌肉、脂肪和肾组织等。

本发明的另一目标是诊断和检测含ALT2之组织的损伤或疾病的方法。该方法包括应用与ALT2特异性结合的单克隆或多克隆抗体检测生物体液中ALT2的含量，应用与ALT1特异性结合的单克隆或多克隆抗体检测生物体液中ALT1的含量以及比较ALT2与ALT1的相对含量。当检测样本ALT2水平高于ALT1水平达一定程度或ALT2水平升高达到某一特定范围时，可诊断该生物患有特定的疾病或损伤。该样本包括各种体液如血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、脑脊液、肠液、关节液、齿龈液、阴道液和胸腔液。该样本也包括各种组织如肝脏、脑、肌肉、脂肪、心脏和肾组织等。

本发明另一宗旨是一种用于诊断含ALT2组织损伤或疾病的试剂盒，该试剂盒含有检测体液中ALT2水平的检测剂及其判定所测定的ALT2水平是否与含ALT2组织损伤或特定的疾病相关的指引。该试剂盒也可能含有检测体液中ALT1水平的检测剂及其判定所测定的ALT1水平是否与含ALT2组织损伤或特定的疾病相关的指引。检测ALT2及ALT1的方法包括生物学分析法、基于抗体的分析方法、酶联免疫吸附分析、蛋白质免疫印迹法和放射免疫分析等方法。

本发明另一宗旨为一种用于诊断含ALT2和/或ALT1的组织损伤或疾病的试剂盒，该试剂盒包括与ALT2特异性、免疫试剂、阳性及阴性对照等。该试剂盒也可能包括与ALT1特异性结合的多克隆或单克隆抗体及判定所测定的ALT2和/或ALT1是否可诊断含ALT2和/或ALT1组织的损伤或疾病的指引。

本发明的另一目标是一种用于测定体液中ALT2水平改变(高于或低于正常)的试剂盒。该试剂盒包括体液中ALT2水平的检测剂及其判定所测的ALT2水平是否在与某一特定情形相关的范围的指引。本发明也可能包括一种测定体液中ALT1改变(高于或低于正常)的试剂盒，该试剂盒含有检测体液中ALT1水平的试剂及其判定所测得的ALT1水平在与某一特定情形相关的范围的指引。该试剂盒也可能比较ALT1和ALT2的水平以及判定该ALT1和ALT2水平是否在与某一特定情形相关的范围的指引。检测ALT1和ALT2的方法可能是以下方法的其中之一：生物学分析法、基于抗体的分析方法、酶联免疫吸附分析、蛋白质免疫印迹法、快速免疫分析法或放射免疫分析等。

本发明的另一宗旨是一种制备ALT2的方法，所生产的ALT2可以是与序列编号2之DNA序列所编码的氨基酸序列相同或相类似物、部分片段或衍生物。该方法包括克隆编码ALT2的DNA序列到表达载体、引导该表达载体进入宿主细胞而产生重组宿主细胞和将重组宿主细胞置于可表达ALT2的任何状态。该发明宗旨之一也包括分离和纯化表达的ALT2。重组质粒中的DNA序列包括序列编号1之序列及其任何编码ALT2片段、类似物或衍生物的DNA序列。

本发明的目标之一包括一种诊断生物(包括但不限于人类和哺乳类动物)与体液中ALT2和/或ALT1改变相关的状况的方法。该方法包括应用至少一种特异性结合ALT2的抗体与体液标本相结合，进而检测与ALT2结合的ALT2抗体的量，并与已知的无该特定状况的生物(包括但不限于人类和哺乳类动物)体液中ALT2抗体量比较，当待测体液样本结合的ALT2抗体含量与已知的无该特定状况的生物体液中ALT2抗体量有明显差异时，将提示该生物存在该特定状况。此外，该方法也包括应用至少一种特异性结合ALT1的抗体与体液标本相结合，进而检测与ALT1结合的ALT1抗体的量，并与已知的无该特定状况的生物体液中ALT1抗体量比较，当待测体液样本结合的ALT1抗体含量与已知并与已知的无该特定状况的生物体液中ALT1抗体量有明显差异时，将提示该生物存在该特定状况。该方法可进一步比较所检测到的ALT2抗体量与总抗体量和/或ALT1抗体量，和/或比较所测定的ALT1抗体量与总抗体量和/或与所测定的ALT2抗体量。当所测定的抗ALT2抗体量与ALT1抗体量或总抗体量的比值在某一特定范围时，提示该特定状况的存在。与此相似，当所测定的抗ALT1抗体量与ALT2抗体量或总抗体量的比值在某一特定范围时，提示该特定状况的存在。该方法中所指体液可以是以下其中之一：血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、脑脊液、肠液、关节液、齿龈液、阴道液和胸腔液。

附图说明

图1示出ALT2之cDNA序列(序列编号1)。

图2示出推论的ALT2氨基酸序列(序列编号2)与既往已发表的人类ALT(ALT1)的氨基酸序列(序列编号3)的比较。

具体实施方式

本发明包括ALT2的核酸及氨基酸序列、ALT2及ALT1的特异性抗体以及应用上述蛋白质、核酸和抗体来诊断含ALT2组织的不同疾病和状况如脂肪肝、代谢综合症X，以及用于鉴别诊断不同原因所致的肝损害，包括脂肪肝(肝脂变)、酒精、创伤、感染、中毒及其它原因所致的肝损害。

本发明也包括ALT2的类似物和功能片段及其含有ALT2核酸序列的表达载体和含有ALT2核酸序列表达载体的宿主细胞。

本申请中，应用序列分析软件如Wisconsin大学的GCG序列分析软件包或NCBI的BLAST等程序来衡量类似物类似程度。这类软件通过对不同替代、缺失和其它修饰的类似体之间的相似序列的匹配比较而判定其相似程度。

“功能片段”包括保持有ALT2功能、活性或生物免疫特征的序列编号2中的片段和与ALT2有相似氨基酸序列的其它蛋白质。这里描述的以全长的ALT2为例的有关筛选某一片段的功能的方法也可加以修饰使其同样适用于ALT2片段。

“本质相同的蛋白”指在不损害该蛋白的功能情况下的某些氨基酸序列改变，包括保守性氨基酸替代即同一类别的其它氨基酸(如颉氨酸替代甘氨酸、精氨酸替代赖氨酸等)或有一个或多个非保守性氨基酸被替代、缺失或插入某些氨基酸。通常指与序列编号2之序列的相似度在85％以上，特别是达从90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％到100％的相似度。

“纯蛋白质”指已从其自然存在的混合物中分离出来ALT2蛋白质。其重量比达到至少60％以上时可认为是纯化蛋白，较好者指ALT2重量达75％、80％、90％、95％，甚至99％以上。本质上纯化的ALT2蛋白质可通过从含ALT2的自然物质中提取，或通过表达重组编码ALT2的核酸而产生，或通过化学合成。其纯度可通过适当的方法来检测如柱层析、聚丙烯酰氨凝胶电泳或高效液相层析法。

当蛋白质从其自然存在的混合物中分离出来时，它实质上已游离于其自然相关的其它组分，因而，与从自然来源的蛋白质不同，应用化学合成或从细胞系统生产的蛋白质实质上也已经游离于其自然相关的其它组分。因此，实质上纯化的蛋白质也包括了那些来源于真核细胞但是在细菌或其它原核细胞中合成的蛋白质。

本描述中的核酸在有调节序列、载体时，可根据该领域中已知的方法在不同的原核和真核细胞中表达。

根据这些方法产生的ALT2可通过一系列成熟的方法进行纯化，例如应用抗ALT2抗体偶联的固相亲和层析。ALT2与抗原性标记蛋白的融合蛋白也可应用抗标记蛋白的抗体进行纯化，应用经典的纯化方法如液相层析、梯度离心、凝胶电泳等方法可得到进一步纯化。各种蛋白质的纯化方法均可用于重组ALT2蛋白质的纯化。以下将更具体描述ALT2蛋白质的纯化。

组建ALT2融合蛋白也是本发明的目标之一。融合蛋白包括将适当的融合伙伴蛋白的氨基酸加入、替代或和置换ALT2的一个或多个相邻的氨基酸。该融合蛋白可通过应用目前所知的DNA重组技术而获得。简言之，编码所要的ALT2杂交体蛋白的DNA分子可通过PCR 突变、点突变和/或限制性核酸内切酶消化和连接反应而获得，然后将此杂交体插入表达载体并引导入适当的宿主细胞中。

含全部或部分ALT2的重组表达载体可通过各种不同形式的已知方法来构建，常用表达载体为质粒和科氏体。表达载体包括一个或多个ALT2片段，典型表达载体包括序列编号1之ALT2核酸序列。

本文中，“可操作性编码”指一个或多个蛋白质编码区及其表达该编码序列所编码的蛋白质所需的调节序列，如启动子结合序列、增强子序列、核蛋白结合序列等类似序列。本文中有关目前可用于筛选调节序列并将其引入重组表达载体的现有基本技术将不再详述。例如，用于原核及真核系统的适当调节序列可参见1997年由纽约JohnWiley父子出版社出版Ausubel等编著的第三版“分子生物学简要方法”。

用于ALT2的表达载体通常含有与其表达宿主细胞种系相适应的调节序列，例如，在以大肠杆菌作为宿主细胞时，可用大肠杆菌来源的质粒pBR322转化宿主细胞(Bolivar等，Gene，2：95，1977)，pBR322含有氨卞青霉素(AMPR)和四环素抗性基因，从而提供一种简易的筛选转化细胞的方法。

适合于原核宿主细胞表达的启动子包括β半乳糖酶和半乳糖启动子系统(Chang等，Nature，275：615，1978；Goeddel等，Nature，281：544，1979)，硷性磷酸酶色氨酸启动子系统(Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057，1980)和像taq启动子的杂合启动子系统(de Boer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25，1983)。其它的功能性细菌启动子系统也可应用。通常目前技术已知这些启动子的核酸序列，因而，技术人员可通过应用某些提供所需核酸限制性内切酶序列的连接序列将其与编码所感兴趣蛋白质的核酸序列相连接(Siebenlist等，Cell，20：269，1980)。

除原核生物外，某些真核微生物如酵母菌也可以作为调节序列的来源，酿酒酵母是常用的真核宿主微生物之一，用于酵母宿主的适当 启动子序列包括3磷酸甘油激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073，1980)或其它糖原降解酶，如磷酸丙酮酸水合酶、3磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6磷酸葡萄糖异构酶、3磷酸甘油酯歧化酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶等(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7：149，1968；Holland，Biochemistry，17：4900，1978)。

其它一些在生长条件控制方面具有更优越性的可诱导的酵母启动子有酒精脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、氮代谢降解酶系、金属硫酶、3磷酸甘油醛脱氢酶、与麦芽糖及乳果糖利用相关的酶系等。酵母增强子常常可增强酵母启动子的活性。

另一方法是将重组病毒用作表达载体，例如腺病毒、腺病毒相关病毒、泡疹病毒、牛痘病毒、或RNA病毒如逆转录病毒或α病毒。较好的逆转录病毒包括从鼠类或鸟类来源的逆转录病毒，较好的α病毒载体为来源于Sindbis或Semliki森林病毒。所有这些载体均能转移或进入含有某一选定标记的基因，因而可构建可识别的转染细胞。

通过将一个或多个感兴趣的基因序列及另一编码某一特定靶细胞受体的配基的基因序列同时插入病毒载体中，则该载体将作用于该特定的靶细胞。例如，逆转录病毒载体可通过插入编码糖、糖脂、或糖蛋白的DNA序列而成为针对某一特定靶细胞的病毒载体。应用针对逆转录病毒的抗体如可完成较好的靶定作用，如针对其粘膜感应器周围部分，可应用MALT特异性抗体。该领域发展的新技术或已确认的方法也可能引用用于本发明中，可插入逆转录病毒基因组的特异性核酸序列将引导含有该核酸序列的逆转录病毒特异性作用于靶细胞。

标准的连接反应技术常用于构建包括所需的编码、非编码及控制序列的适当载体，纯化的质粒或DNA片段被酶切、末端补齐、再连接成所需的质粒结构。

以质粒载体为例，为了证实所构建质粒的序列正确性，可将连接反应混合物转化宿主细胞，通过适当的抗生素筛选被转化的细胞，从 被转化的细胞提取质粒，通过限制性核酸内切酶或序列测定加以分析(方法见Messing等，Nucleic Acids Res.，9：309，1981；Maxam等，Methods in Enzymology，65：499，1980)，也可用目前文献中已有的其它方法。酶切后的DNA片段通过经典的凝胶电泳分离(Maniatis等，1982版，分子克隆，第133-134页)。

上述表达载体可转化宿主细胞并在合适于诱导其启动子的传统营养培养基中培养以筛选转染细胞或扩增该基因，培养条件如温度、酸硷度等的与前述用于表达的宿主细胞培养一样，也可见于相关的文献中。

克隆ALT2

应用聚合酶链反应(PCR)及核酸测序方法从人类脂肪组织cDNA文库产生表达序列片段(ESTs)。用于产生ESTs的PCR和序列测定的引物来自于用于构建人类脂肪组织cDNA文库的载体TripEX。引物P922(5’-AATACGACTCACTATAGGGCGAATTGG-3’序列编号4)及引物P923(5’-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3’，序列编号5)用于PCR扩增反应，引物P927(5’-GTTGGTACCCGGGAATTC-3’，序列编号6)用于DNA序列测定。PCR反应条件为94℃2分钟后，94℃15秒，58℃30秒及68℃4分钟，共10个循环，以后接着20个循环中，每增加一个循环，增加延伸时间5秒，最后在72℃反应7分钟。ALT2 5’端部分通过应用一连接引物(AP1)及ALT2特异性引物P11065’-TAGGTGCATAGTGCCATCAC-3’[AY029173中核苷酸447-428，(序列编号7)]从BD生物科技公司人脂肪组织Marathon cDNA试剂盒之cDNA中采用5’cDNA快速扩增法而得，PCR反应条件为94℃30秒，56℃30秒及72℃1分钟，共30个循环。

应用BigDye序列测定试剂测定所得PCR产物的序列。测序反应条件为：总体积为20μl中含100ng PCR产物、5pmol引物、4μl BigDye序列测定混合物，反应条件为96℃15秒，50℃10秒及60℃4分钟， 共25个循环。将反应产物通过Sephdex-G50层析柱纯化，真空离心干燥后，在ABI PRISM 377测序仪进行序列测定。进而得到完整全长DNA序列，证实该cDNA编码一种新的ALT类似物，将其命名为ALT2。该3,957硷基对的cDNA含有一1,569硷基对的开放读码区，编码含459个氨基酸残基的蛋白质。ALT1及ALT2核糖核酸序列均有两个可能的起始编码ATG，在其编码的蛋白质中分别相隔51个氨基酸残基(ALT2)及24个氨基酸残基(ALT1)。在ALT2，其两个起始编码均无Kozak序列，因而，哪个起始编码作为的翻译起点更为有效或长氨基端的ALT2是否含有靶定信号有待进一步确定。第二个起始编码后的序列有明显的保守性，提示从第二个ATG后编码的蛋白质可能对其功能更为重要。

图1示出ALT2的cDNA序列(序列编号1)，该核酸及氨基酸序列已于2001年4月16日存于基因库中(基因库编号AY029173)，但文章直到2002年3月1日才发表。应用GCG10的序列最佳匹配程序检测发现所推论得到的人类ALT2的459个氨基酸序列与人ALT1氨基酸序列(序列编号3)相比较有69％的一致性和78％的相似性(图2)。在氨基端ALT2比ALT1长27个氨基酸残基，ALT2及ALT1的推算分子量分别为59kDa和55kDa，推算等电点分别为6.42和7.11。

保守性功能基团分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)显示ALT2含有完整的I类转氨酶(aminotrans_2，pfam00155)，结构(该结构包括天门冬氨酸转氨酶和酪氨酸转氨酶)和部分II类转氨酶(aminotrans_2，pfam00222)结构，不同的转氨酶包括天门冬氨酸、酪氨酸及磷酸组氨酰氨基转移酶中均含有这些结构。

用ALT2 cDNA作为探针去查询基因库高产出基因组序列(HighThroughput Genomic Sequences，HTGS)发现其与第16号染色体的3个(基因库序列编号AC007225、AC018845和AC007338)相互连接的尚未完成序列测定的人类基因组人工细菌克隆(BAC)有非常好的匹配。含有ALT2的BAC克隆由新墨西哥州的Los Alamos实验室提供。 通过比较ALT2 cDNA序列与基因库中基因组DNA序列，并应用PCR扩增在基因库中序列尚不清楚的部分和DNA序列测定，从而得出ALT2基因结构。包括外显子1到外显子4、外显子5到外显子1 2分别位于两部分连续的基因组DNA序列中，应用PCR进一步确定其正确性。外显子4到外显子5之间的缺失部分通过以BAC克隆BP11-169E6为模板，用来源于外显子4及外显子5的引物P1145：5’-CAGGTGATGGC ACTATGCACCT-3’[AY029173中核苷酸425-446，序列编号8]和P1090：5’-CTCCCGTCCTCAGGTAGATGTTGT-3’[AY029173中核苷酸653-630，序列编号9]进行PCR扩增反应。PCR反应条件已于上述。PCR产物通过序列测定加以证实。通过合并所有序列后，得到含有12个外显子、长度约50kb的ALT2基因序列，其剪接位点和外显子内含子交接部分序列见表一。除ALT1基因较短，仅约3kb，ALT2与ALT1之间的基因结构非常相似。

表一

外显子  编号	外显子大小  (bp)	5’-剪接部分	内含子大小(kb)	3’-剪接部分
					1	～72	CGACAGgcacgt (序列编号10)	0.2	tgccagGGTTTC(序列编号11)
2	265	CAGCGGgtgagc (序列编号12)	12.7	gcccagGGTATC(序列编号13)
					3	90	CGGCAGgtgagc (序列编号14)	2.9	ccccagGTGATG(序列编号15)
4	109	GCCTGGgtgagg (序列编号16)	6.1	ttacagGGTCCT(序列编号17)
					5	134	ATTTCTgtacgt (序列编号18)	2.7	ttgcagACGATC(序列编号19)

6

244

CCACAGgtctgc(序列编号20)

6.7

ttatagGCCAGG(序列编号21)

7	80	GATGAGgtaaga(序列编号22)	1.9	ccgcagGTGTAC(序列编号23)
					8	137	GGGCGAgtacgt(序列编号24)	3.5	ctccagGTGTGG(序列编号25)
9	1 75	AGCCGAgtgagt(序列编号26)	2.0	catcagGAGAAG(序列编号27)
					10	156	GCTCAGgtctgg(序列编号28)	2.4	ccatagGCCCAT(序列编号29)
11	113	CTTCAGgtatga(序列编号30)	1.9	tgccagGATGAC(序列编号31)
					12	2382

由于基因库中HTGS数据库并非最终确定序列，还可能存在错误，ALT2基因染色体定位也通过筛选人与地鼠放射性杂交方阵而确定。应用来源于ALT2 cDNA 3’非翻译部分序列的一对引物：5′-GGCAGGATGTTGCACTAGCTT-3’(序列编号32)以及5′-GGCTGCACTATGTGTCACTGA-3’(序列编号33)，采用StanfordGeneBridge 3放射性杂交基因芯片(Research Genetics，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行ALT2基因的染色体定位(Gong，et al.，Uncouplingprotein-3 is a mediator of thermogenesis regulated by thyroid hormone，beta3-adrenergic agonists，and leptin，J.Biol.Chem.，272：24129-24132(1997))。所用的PCR反应条件为94℃30秒，56℃30秒及72℃30秒，共30个循环。结果分析通过Stanford大学网址(http://www-shgc.Stanford.edu/RH/)(Stanford，CA))进行。

编码结果，

00000010000000001000001000000000001100001001000001000100000020011100000010000100000被定位于16号染色体(26 cRs，LOD值等于8.5)。该结果与前述应用人白细胞与中国地鼠纤维母细胞杂交体而将ALT活性定位于16号染色体相一致，但与ALT1不同，后者位于第8号染色体。

ALT2及ALT1的组织分布采用Northern方法测定，应用Trizol从人及恒河猴的脂肪组织中提取总核糖核酸(Gong，et al，Genomicstructure and promoter analysis of the human obese gene，J.Biol.Chem.， 271：3971-3974(1996)；Hotta，et al， Circulating concentrations of theadipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduce

可见约3.9kb的ALT2信使核糖核酸在肌肉、肾、脑及脂肪组织有高水平表达，在肝脏和乳房组织中有低水平表达。与此相反，约1.4kb的ALT1信使核糖核酸在肾、肝、脂肪和心脏中有中等水平的表达。猴脂肪组织中也有高水平的ALT2表达，但没有ALT1表达。ALT2与ALT1的大小与预计的大小相一致。两种ALT均只检测到一条带，提示该两种基因均无其它剪接形式。ALT2表现为主要的ALT，其信使 核糖核酸比ALT1表达分布更广泛。该结果与基因库中ALT转录程度相一致，在2百50万总的表达序列片断(EST)中，ALT2 EST有228个，但ALT1 EST仅有11个(GenBank Builder#130)。

在细菌中表达ALT1和ALT2

应用人肌肉cDNA作为模板，采用PCR扩增ALT2的编码序列部分，PCR反应条件为94℃ 30秒，56℃ 30秒及72℃ 1分30秒，28个循环后，72℃延伸7分钟，反应采用Roche公司的高保真PCR反应系统，引物为含有NdeI连接序列的引物P1266：5’-acctgaattcatATGCAGCGGGCGGCGGCGCT-3’(基因库编号AY029173中第95到114核苷酸序列，序列编号34)和含有HindIII连接序列的引物P1117：5’-ggctcagaagcttTCACGCGTACTTCTCCAGCAA-3’(基因库编号AY029173中第1666到1646核苷酸序列，序列编号35)。所得PCR产物应用NdeI和HindIII酶切后，亚克隆于质粒pPET28a的聚组氨酸标记后，构建成表达质粒pPET28_ALT2，通过DNA序列测定证实插入的ALT2序列无突变。

采用相同的方法构建ALT1的表达质粒pPET28_ALT1，其引物为P1118：5’-ctgggtagacatATGGCCTCGAGCACAGGTGAC-3’(基因库编号NM_005309中第268到288核苷酸序列，序列编号36)和P1119：5’ccccagctgaagcttTCAGGAGTACTCGAGGGTGAAC-3’(基因库编号NM_005309中第1158到1137核苷酸序列，序列编号37)，模板为含有ALT1的质粒(IMAGE克隆2129833)。

为了表达ALT2及ALT1蛋白质，将质粒pPET28_ALT2、pPET28_ALT1或pPET28a(作为阴性对照)分别转化大肠杆菌，分别挑取一个转化细菌菌落在50毫升含30微克/毫升卡那霉素的LB液中培养至OD₆₀₀为0.7时，加入IPTG至终浓度为1毫摩尔以诱导产生重组蛋白。分别收集来自20ml加入IPTG前及加入IPTG3小时后的培养液中的细菌，重新悬浮在5毫升磷酸缓冲液中，短暂超声波破碎三次， 每次10秒钟，将细胞裂解液在摄氏4℃10,000g离心15分钟，收集上清作SDS-PAGE电泳及酶活性测定。

ALT活性测定采用Sigma公司的GPT优化丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒。简述之，在摄氏25度将2.5毫升含有左旋丙氨酸、还原型辅酶I(NADH)、乳酸脱氢酶和酮戊二酸的试剂A与试剂B混合物与0.5毫升细胞裂解上清液混合，于340nm波长处测定混合后1、2、3分钟的吸光度，该吸光度降低的斜率与其ALT活性成比例。细胞裂解上清液蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝G250方法，标准品为牛血清白蛋白。1单位ALT活性定义为在摄氏25度时每分钟催化生成1微摩尔辅酶I(NAD)的酶量。

在非诱导条件下，转化了pPET28_ALT2和pPET28_ALT1质粒的大肠杆菌的细胞裂解液含有明显的ALT活性(转化pPET28_ALT2的细菌为121单位/毫克蛋白，转化pPET28_ALT1的细菌为86单位/毫克蛋白)，而转化质粒pPET28的细菌仅含有较低的ALT活性(16单位/毫克蛋白)，这可能是由于前二者在细菌中的“溢出”表达所致。IPTG诱导后，含pPET28_ALT2细菌ALT活性升高了2.8倍，含pPET28_ALT1的细菌ALT活性升高了2倍，而含阴性对照细菌ALT活性无明显增加。

如上所述，准备IPTG诱导前后分别转化了pPET28_ALT2、pPET28_ALT1或pPET28a的细菌裂解上清液，进行SDS_PAGE电泳分析，应用10％SDS_PAGE胶，采用考马斯亮蓝染色及应用抗组氨酸抗体进行免疫印迹检测，IPTG诱导后，可分别见约62kDa及58kDa大小蛋白质带，与ALT2(推算分子量为58kDa)及ALT1(推算分子量为54kDa)相一致。这些结果证实ALT2 cDNA编码功能性丙氨酸转氨酶。

脂肪肝中ALT2的表达

由于ALT2在脂肪组织中表达很高，我们检测了肥胖状态时脂肪肝的ALT2的表达水平。肥胖小鼠已被认为是非常好的非酒精性脂肪 肝的动物模型，非酒精性脂肪肝与肥胖及糖尿病有很强的相关性(Koteish and Diehl，Animal models of steatosis，Semin.Liver.Dis.， 21(1)：89-104(2001))。4个月大小的肥胖小鼠(ob/ob)或非肥胖小鼠(ob/+)被处死后，立即取出其肝组织，应用上述Trizol方法提取总RNA。每泳道加入15微克总RNA在琼脂糖胶中进行电泳并行RNA印迹分析，应用³²P-dCTP通过随机引物标记法标记鼠ALT1 cDNA探针(对应于氨基酸106至294，来源于EST，IMAGE克隆521920，基因库编号AA106294)，在Amersham Pharmacia生物科技公司的Rapid-hyb缓冲液中于65℃进行杂交，用0.5 X SSC及1％SDS缓冲液在摄氏65度洗膜两次，应用PhosphorImager进行杂交信号定量分析，统计学处理采用学生t检验。结果显示与非肥胖小鼠相比较，肥胖小鼠肝脏ALT2信使核糖核酸表达高1.9倍(p＜0.05)，而ALT1表达无改变。因而，脂肪肝时，ALT2特异性升高。

脂肪肝中转氨酶活性改变

为测定脂肪肝时肝组织之转氨酶活性，取50到60毫克经液氮速冻的肝组织，置于冰上解冻后，用刀片切碎，在含19倍体积的TrisEDTA缓冲液的Dounce匀浆器中匀浆约40次，再短暂超声波破碎细胞后，摄氏4度离心，10000转/分钟，15分钟，上清液用于测定ALT及AST活性。ALT及AST活性测定分别采用Wako化学试剂公司及Stanbio实验室的试剂盒，并根据其提供的方法进行。结果(图3)发现脂肪肝组织提取液中ALT活性较正常肝组织提取液中ALT水平明显升高(升高30％，p＜0.01)，与此相反，谷草转氨酶(AST)活性在二者无明显区别(5％，p＞0.05，)。一些临床观察也得到类似结果，即脂肪肝的病人有中ALT轻度升高，而AST保持正常(Guzzaloni G，Grugni G，MinocciA，Moro D，Morabito F.Liver steatosis in juvenileobesity：correlationswith lipid profile，hepatic biochemical parameters and glycemicandinsulinemic responses to an oral glucose tolerance test.Int J Obes Relat Metab Disord2000，24：772-776；Angelico F，Del Ben M，Conti R，Francioso S，Feole K，Maccioni D，Antonini TM，et al.Non-alcoholic fattyliver syndrome：a hepatic consequence o f commonmetabolic diseases.JGastroenterol Hepatol 200，318：588-594；Fishbein MH，Miner M，MogrenC，Chalekson J.The spectrum of fatty liver in obese children and therelationshipof serum aminotransferases to severity of steatosis.J PediatrGastroenterol Nutr 2003；36：54-61。结合前述ALT1与ALT2信使核糖核酸在脂肪肝组织中的表达结果，提示ALT2可能是诊断脂肪肝的一种特异性的酶学指标。

ALT2作为产生ALT2组织的疾病或损伤的标志

如前所述，目前ALT活性测定不能区分ALT1与ALT2。由此，其用于检测肝损害的准确性受到很大的限制。肝脏含有两种ALT，在脂肪肝的动武模型中只有ALT2信使核糖核酸表达升高，而ALT1信使核糖核酸的表达无改变。分别检测ALT1及ALT2的不同改变对鉴别由于脂肪肝或其它原因如酒精、药物、化学毒物、创伤、感染或其它类型的肝损害将十分有用。

进一步而言，脂肪组织之ALT2比ALT1高，检测ALT2或同时测定ALT2与ALT1将可用于代谢紊乱综合症和其它脂肪组织异常的诊断。

最后，建立能区别血液或组织中ALT1与ALT2的检测方法可能用于诊断产生或含有ALT2之组织的损伤或疾病。

可用针对ALT的抗体测定血液及体液中ALT蛋白质的总量来诊断某一生物(人、哺乳动物或其它)肝脏损伤或疾病(见下文)，ALT活性等于或超过40国际单位/升时提示有肝脏损伤或疾病。另一方面，当某一生物的血液或其它体液中总ALT蛋白质量超过无肝损伤或肝疾病生物的ALT总量的最高限的1.5到2倍以上时，提示该生物有肝脏损伤或肝脏疾病。

为了确定肝脏损害的原因，应该应用ALT1及ALT2特异性抗体测定血液或其它体液中ALT2与ALT1蛋白质的相对含量(见下文)。ALT2及ALT1的相对量也可用酶学分析法或已知可区分ALT1与ALT2活性的其它方法。当血液或其它体液中ALT2的量超过ALT1量的1.5倍以上时，其肝脏损害很可能由肝脂肪变所致，当血液或其它体液中ALT2的量低于ALT1量的1.5倍时，其肝脏损害常由感染、中毒或创伤所致。

对那些除肝脏以外的产生ALT2的组织的疾病或状况来说，也可采取相似的策略。当某一生物的血液或其它体液中ALT2蛋白质量超过无损伤或疾病的生物之ALT2的最高限的1.5到2倍以上时，则可诊断该组织有损伤或疾病。ALT2特异性抗体可用于检测血液或其它体液中ALT2的量(见下文)。

当某一生物血液或其它体液的ALT2蛋白质量比ALT1蛋白质量高出0.5倍，如同时有高低密度脂蛋白血症、高甘油三酯、高血压及超体重时，该生物就很可能患有代谢紊乱综合症。

与此相似，应用组织作为诊断标本时，如组织中ALT2信使核糖核酸水平比ALT1信使核糖核酸水平高出1.5倍，其肝脏损害常常由于脂肪肝所致。同样，如果脂肪组织中ALT2信使核糖核酸水平为ALT1信使核糖核酸水平3倍以上，支持代谢紊乱综合症的诊断，当然，对诊断代谢紊乱综合症还需要结合其它指标如低密度脂蛋白、甘油三酯、血压水平及其是否肥胖等。对其它产生ALT2的组织，当某一组织ALT2信使核糖核酸水平超过已知无疾病或损伤的组织之ALT2信使核糖核酸水平的1.5至2倍以上时，则可诊断该生物存在该产生ALT2组织的疾病或损伤。

有关ALT1和/或ALT2的检测可以是检测某一组织中ALT1和/或ALT2的信使核糖核酸水平，也可以是组织和体液中ALT1和/或ALT蛋白质的量，这些体液包括血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、脑脊液、肠液、关节液、齿龈液、阴道液和胸腔液等。采用检测体液中的ALT蛋白质或其片断的方法优于采用检测组织中ALT蛋白质或其片断或信使核糖核酸的方法。

信使核糖核酸分析

ALT1和/或ALT2信使核糖核酸的方法需要从组织和/或体液标本中分离信使核糖核酸，一些液态的生物标本如血浆、血清、组织切片或提取液、淋巴细胞、组织培养细胞、组织培养细胞的培养液可不需要纯化而直接用于该检测，也可先纯化、或部分纯化后进行分析。纯化步骤包括分离、提取、破坏细胞或匀浆组织或体液。纯化时也可加入一些与探针不起反应的载体核酸以减少非特异性的核酸结合。

其次，标本可用去污剂或蛋白酶处理以利所检测的核酸的释放和稳定，加入部分蛋白酶是较理想的方法，因为该处理可使核酸更稳定的可容状态。在一系列蛋白酶中，可用于本方法的有蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、硷性蛋白酶、溶菌酶和枯草杆菌蛋白酶。分离和纯化信使核糖核酸时另一种很有用的酶是DNA酶。常采用加热法使信使核糖核酸变性以破坏其形成的二级结构。

破坏信使核糖核酸的二级结构后，在适合探针结合到特异性目的信使核糖核酸的条件下应用标记探针进行杂交反应，杂交反应和探针合成的常规方法可参见冷泉港实验室T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook于1982年编著的“分子克隆”一书。杂交反应可在不同的酸硷度、盐浓度和不同的温度条件下进行。pH可在6到9范围，较适pH范围为6.8到8.5；盐浓度可从0.15M钠盐到0.9M钠盐不等。也可使用与以上钠盐离子强度相当的其它阳离子。杂交温度可从摄氏30度到摄氏80度不等，较好的温度范围为摄氏45度到摄氏70度。也可加入一些其它化合物以促进在较低的温度如接近室温下进行特异性杂交，在这些添加的化合物中，甲酰胺可降低温度的需求。

检测ALT2信使核糖核酸的探针实例之一是能与ALT2信使核糖核酸互补并特异性结合的聚核苷酸，聚核苷酸的长度可从10硷基到4,000个硷基以上，较好长度为20到3,500个硷基。用于ALT2信使核糖核 酸印迹杂交的一个较好的探针为对应于基因库中编号AY029173之615到3,957硷基对的约3300硷基的聚核苷酸。

检测ALT1信使核糖核酸的探针实例之一是能与ALT1信使核糖核酸互补并特异性结合的聚核苷酸，其长度可从10硷基到4,000个硷基以上，较好者长度为20到3,500个硷基。

检测核糖核酸的常用方法为RNA印迹杂交、RNA酶保护反应和逆转录PCR(RT-PCR)，所有这些方法已为人们熟知。

值得指出的另一点是聚核苷酸探针的标记是用一些可与核酸探针共价结合或紧密相连的以致可进行检测和定量分析探针的物质，这些物质中包括放射性同位素如³H、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³³P、¹⁴C和³⁵S；化学发光分子如丫啶类物质或发光胺、荧光物质如萤光素、藻色蛋白、稀土元素螯合剂、若丹明等；酶底物和抑制剂如辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶、6磷酸果糖脱氢酶、β半乳糖苷酶、丙酮酸激酶、硷性磷酸酶、乙先胆硷酯酶等；金属颗粒或其它辐射不穿透分子如胶体金、磁性粒子；含有以上任何一种物质的脂质体；抗原如蛋白质、碳水化合物或半抗原分子及其与这些抗原特异性结合的抗体；和作为成对结合单位的糖脂或糖蛋白。

杂交后，将结合到ALT2的信使核糖核酸，标记探针与未结合的探针分离，检测结合的杂交探针的量，从而得知样本中ALT信使核糖核酸的含量。非杂交的探针与杂交的探针的分离可用凝胶分子筛或亲和层析方法。与ALT2相似，杂交后，将ALT1信使核糖核酸结合的标记探针与非杂交上的标记探针分离后，检测杂交后标记抗体的量，从而测定样本中ALT1信使核糖核酸的量。同样，凝胶分子筛或亲和层析方法可用于非杂交的探针与杂交的探针的分离。凝胶分子筛层析法常作为该分离的优选的方法，分离的基本条件在分离过程中目的基因核酸与探针保持于相互结合。分离的试剂中可含有核酸酶抑制剂和添加与探针无反应的载体核酸。

在分离杂交与未杂交的标记探针的方法中，较好者为采用以聚丙 烯酰氨、葡聚糖、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖及其类似材料为基质的凝胶分子筛层析法。适宜于该方法的产品有Pharmacia公司的Sephadex系列G50、G100和G200及Sepharose系列CL2B，4B，6B，S-200，S-400和S-1000。其它适用产品有BioRad公司的P-20，P-60，P-100，P-200，A-0.5m和A-1.5m等。

将杂交上的探针与未杂交的探针分离后，需要检测杂交探针的存在或对其进行定量，该测定方法取决于探针的标记种类，用放射性同位素标记时，可用γ计数器或液体闪烁计数器或其它检测方法如放射性自显影或其它显像技术。当探针用分别用抗体或其中部分片段或抗原、受体或配基、酶或酶底物、或与某一物质相结合的另一物质来标记时，则可分别用抗体或其中部分片段或抗原、受体或配基、酶或酶底物、或与某一物质相结合的另一物质来进行检测和定量。进一步，结合于与探针相连分子的物质本身可含有可检测的标志如某种酶或同位素。如果用某种酶或酶抑制剂标记探针，可用测定是否存在该酶活性来检测探针的存在与否，较好者为那些可产生用分光光度计可测定的光能量变化的酶反应。其它标记包括辐射透不过的物质应用电磁辐射测定、磁粒子用磁场检测、用于检测抗体与特异性抗原的免疫学方法、荧光及化学发光标记法和其它任何检测特异性成对结合物质如糖脂或糖蛋白等。

为了精确测定未知样本中ALT2或ALT1信使核糖核酸的量，可同时应用含已知量的目的核酸序列的样本作为阳性或阴性对照来标准化检测结果。

通过比较未知样本与已知量的正常健康组织中信使核糖核酸的量，通常在相同的组织之间比较如肝组织与肝组织、脂肪组织与脂肪组织比较。如果所测得的未知样本中的信使核糖核酸量在某一预先设定的范围，可判断该个体患有特定的疾病、损伤或一些可影响样本组织的其它情况。

制备ALT1及ALT2特异性抗体

应用上述pPET28-ALT1和pPET28-ALT2质粒及IPTG诱导转化细菌产生ALT1及ALT2蛋白质，如上所述，制备细菌裂解物及其无细胞上清液，将此上清液通过用含有足以使蛋白质变性的尿素的缓冲液平衡好的镍亲和层析柱，搜集流出的各组分，通过凝胶电泳，应用抗组氨酸标记肽的抗体证实纯化的蛋白质。

含纯化的蛋白质的洗出组分在适当缓冲液中透析后，将纯化蛋白质注入兔体内以诱导产生多克隆抗体，注射纯化蛋白质前及注射后30天取血样储存于摄氏负20度。应用纯化的蛋白质通过ELISA或蛋白质免疫印迹方法检测血样中是否存在多克隆抗体，并检测ALT1多克隆抗体是否与ALT2蛋白质有交叉反应，以及ALT2多克隆抗体是否与ALT1蛋白质有交叉反应。选择那些含有仅对一种ALT特异性结合的多克隆抗体的动物，分离其脾脏细胞。将该脾脏细胞悬浮液与HGPRT阴性骨髓瘤细胞混合，加入35％甘油，将细胞于含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养液中生长10到14天后，将存活的杂交瘤细胞种植于96孔培养板中培养。

另一种生产ALT1或ALT2特异性抗体的方法是将编码ALT2的cDNA(序列编号1)连接到pGEX-4T-1表达质粒中，从而ALT2与GST(谷光甘肽-S-转移酶)相融合。应用0.8mM IPTG诱导BL21(DE3)大肠杆菌产生重组融合蛋白，收集细胞后，用B-Per试剂裂解细胞，在摄氏4度时，将裂解液与谷光甘肽琼脂糖载体混合，2小时后于3000转/分钟离心10分钟，用磷酸缓冲液将其洗两次后，用含10 mM还原型谷光甘肽的50mM Tris盐酸缓冲液洗出蛋白质。

得到的纯化ALT2-GST可用Amersham Pharmacia生物科技公司ECL蛋白质生物素化试剂盒将其与生物素连接。简而言之，将1mg蛋白质溶解在1ml pH 8.6的碳酸氢盐缓冲液中，与每毫克蛋白30μL生物素反应试剂孵育30分钟后，应用Sephadex G25层析柱纯化，用5ml磷酸缓冲液(pH 7.4)将蛋白质洗出，搜集含ALT2-GST的组分。

生物素化后的ALT2-GST蛋白谱可用1 2％SDS-PAGE和银染色进行分析。用1∶1000稀释的抗GST抗体及含1∶12,000稀释的HRP标记抗羊IgG检测ALT2-GST蛋白。ALT2-GST蛋白可被1∶6,000稀释在PBST的链球菌抗生物素蛋白偶联的辣根过氧化酶检测到，该免疫检测应用ECL蛋白质免疫印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia生物科技公司)。

将纯化的ALT2-GST注射到豚鼠、兔、大鼠、小鼠或其它合适的动物，从而产生ALT2抗体。经过多次注射后，分离动物的脾脏，如前述方法制备脾脏细胞及杂交瘤细胞。

然后，检测杂交瘤细胞培养液中抗ALT2抗体。将生物素化的ALT2-GST加入链球菌抗生物素蛋白包被的96孔板中，然后加入杂交瘤细胞培养液，通过洗板去除未结合的抗体及生物素标记的ALT2-GST后，加入针对第一抗体的辣根过氧化酶标记的特异性第二抗体，然后，洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化酶的底物试剂，在摄氏25度下反应15分钟，加入0.5mM硫酸终止反应，测定其在波长为450纳米的吸光度，从而知道哪些孔含有ALT2抗体。然后将该抗ALT2的抗体用于检测含有纯化ALT2的SDS-PAGE胶以再次证实该抗体结合ALT2，最后将抗ALT2的抗体加入含有纯化ALT1的SDS-PAGE胶以筛选只特异性结合ALT2的抗体。

除采用ALT1代替ALT2外，采用相同的策略产生抗ALT1特异性抗体。

如果需要，将用目前熟知的方法制备针对多克隆抗体的单克隆抗体。

合成的ALT2片段或ALT1片段也可作为免疫原用于制备抗体。

值得指出的是ALT2核酸序列也可用于构建重组细胞株、重组微生物、表达载体等类似重组体，这些重组体可用于表达ALT2蛋白。另一方面，这些重组体可用于筛选抑制或增加ALT2活性的试剂。

当用ALT2的编码序列构建表达载体或其它载体时，ALT2的编码 序列将被插入载体之编码序列后，并在可被诱导、阻滞，或组织特异性表达的启动子的控制下。此外，也可能含有一些其它组分如适用于不同分子生物学技术的载体中的调节序列。

在另一具体方法中，提供含有编码ALT2蛋白质的DNA的载体，优先考虑将序列编号2中的DNA分子插入适当的表达载体，从而用其来转染或转化适当的宿主细胞。例行的表达载体包括能够引导插入宿主细胞中的核酸序列转录的启动子，表达载体的代表包括质粒和/或病毒载体序列。适当的载体包括逆转录病毒载体，牛痘病毒载体、CMV病毒载体、BLUESCRIPT载体、杆状病毒载体等。另一方面能够引导克隆的基因或cDNA转录的启动子可以是能被诱导和阻滞的启动子，包括病毒或细胞的启动子。

在某些具体方法中，趋于采用可选择性标志来筛选含有克隆基因的细胞，选择性标志通常与要克隆的目的基因DNA分子同时引入细胞，通常包括编码对氨卞青霉素、新酶素、潮酶素和氨甲喋呤等药物产生抵抗性的蛋白的基因。其它一些选择性标记可提供可检测的信号，如β半乳糖苷酶可用于鉴定含有插入目的基因DNA分子的细胞。

抗体分析

有关ALT1的抗体分析法包括将分装的样本(体液或组织)与ALT1特异性抗体结合，然后用目前熟知的相关技术测定与抗体结合的ALT1的量，通过与已知的健康生物标准样本相比较，如果测定的ALT1的量在一特定的范围，则可诊断该生物患有某一疾病、损伤或某一特定状况。

有关ALT2的抗体分析法包括将分装的样本(体液或组织)与ALT2特异性抗体混合，然后用已知的相关技术测定与抗体结合的ALT2的量，通过与已知的健康生物标准样本相比较，如果测定的ALT2的量在一特定的范围，则可诊断该生物患有某一疾病、损伤或某一特定状况。由于ALT2主要在肝脏、肌肉、肾脏、脑及脂肪组织表达，其检 测可用于诊断肝脏损伤、肝脏疾病或有肝脏、肌肉、肾脏、脑及脂肪组织相关的疾病或特定状况。

以测定血液样本为例，从生物个体(人、哺乳动物或其它动物)取出血液后，于摄氏4度离心20分钟以分离血清，将血清储存于摄氏负20度直至进行检测。

将上述血浆与ALT1或ALT2特异性抗体于室温下孵育1.5小时或于摄氏4度下孵育过夜，然后于摄氏4度离心20分钟，将所得沉淀悬浮于缓冲液中，在10％的SDS-PAGE胶中电泳后，将胶在含有种系特异性的ALT1和ALT2抗体的缓冲液中孵育并检测。应用蛋白质免疫印迹分析的优点是其利用ALT1与ALT2的分子量不同来区分二者，以得到特异性的检测。

本发明中的抗体或其片段非常适用于不同的免疫分析，可用于快速免疫分析、蛋白质免疫印迹分析、放射免疫分析、酶联免疫吸附分析、免疫荧光显微镜、免疫电镜或其它类型的免疫分析。该抗体或其片段可用于液相或结合于固相载体。

抗体或其片段可被任何标记物及采用任何标记方法进行标记。可用于本发明的标记物包括但不限于酶标记物、放射性同位素标记物、非放射性同位素标记物、荧光标记物及化学发光标记物等。

适用的标记酶包括，但不限于马来酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、硷性磷酸酶、天冬酰氨酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖甘酶、核糖核酸酶、尿激酶、过氧化氢酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶、淀粉酶和乙先胆硷酯酶等。

适合的放射性同位素标记物包括，但不限于³H、¹¹¹In、¹²⁵I、³²P、 ³³P、³⁵S、¹⁴C、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹Ci、²¹¹At、 ²¹²Pb、⁴⁷Sc和¹⁰⁹Pd。

适合的非放射性同位素标记物包括，但不限于¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、 ⁵²Tr和⁴⁶Fe。

适合的荧光标记物包括，但不限于¹⁵²Eu标记物、荧光素标记物、异硫氰酸标记物、硷性蕊香红标记物、藻红蛋白标记物、异藻青蛋白标记物和荧光氨标记物等。

适合的化学发光标记物包括，但不限于芳香丫啶酯标记物、咪唑标记物、丫啶盐标记物、草酸酯标记物、虫荧光素标记物及虫荧光素酶标记物等。

本发明亦可能采用适用于本发明的其它的相关的新标记物，可用文献中常规的标准方法将这些标记物与抗体或其片段相连接。典型的方法可参见有关蛋白与蛋白质偶联反应及偶联蛋白的应用及酶免疫分析文献(Kennedy，J.H.，et al.，Protein-protein coupling reactions and theapplications of protein conjugates，Clin.Chim Acta，70：1-31(1976)；Schuurs and Van Weemen，Enzyme-immunoassay，Clin.Chim Acta， 81：1-40(1977))。在后者提到的偶联方法如戊二醛法、过碘酸盐法、二马来酸氨法等其它方法均可能用作本申请的参考。

本发明中抗体或其片段的检测可通过应用载体而得以改进，熟知的载体有玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、自然或合成纤维素、聚丙烯酰氨、琼脂糖和磁铁。本发明中的载体属性可为可溶性，也可为不溶性物质，这些支持材料可有任何可能的结构构象，只要其能与ALT2或ALT1相结合，因而，支持材料可以是像连珠样的球形、像试管内面或木竿外表面一样的圆柱形，也可能其表面平展如纸张和试剂条。相关技术领域中被确认可用于常规实验的其它适合于结合单克隆抗体的新载体也可能用于该发明中。

ALT2或ALT1抗体或其片段可能用于ALT2或ALT1的定性或定量分析，该类分析可通过应用任何目前在相关领域采用的免疫分析法来完成，这些方法包括放射免疫分析、免疫测定法、免疫PCR法和蛋白质免疫印迹检测等。采用已知的标准方法学技术，可将ALT2或ALT1特异性抗体包被于如微滴定板或膜(如硝酸纤维膜)的载体物质(固相载体)表面，将其与体液标本如可疑有产生ALT2的组织的损伤或疾病的动物血清相接触，通过任何已知的测定方法如荧光抗体光谱测 定或比色法等检测血中ALT2与ALT2抗体形成的复合物。也可用1978年纽约NorthHolland出版社出版、由Work等编著的“分子生物学中实验室技术和生物化学”一书中描述的放射免疫分析及Wide发表在1970年由爱丁堡Kirkham和Hunter编辑的“放射免疫分析方法学”第199到206页。

ALT1和ALT2抗体也将用于对肝脏疾病或状况的进展追踪，即在病程不同时间进行ALT1或ALT2测定，通过比较不同时间之ALT水平来量化该疾病或状况的好转或加重的程度。

试剂盒(Kits)

上述方法可能用于本发明中应用上述ALT1和/或ALT2特异性抗体检测生物标本中ALT1和/或ALT2的试剂盒。该检测ALT1和/或ALT2的试剂盒可能包括上述分别特异性结合ALT1或ALT2的单克隆或多克隆抗体或其片段(这些抗体可能偶联于荧光素、磷光体、酶、放射性标记物等)、适当的酶联抗体的底物如过氧化物酶的底物过氧化氢、封闭试剂如正常羊或兔血清或溶于生理盐水中的3％牛血清白蛋白等和其它试剂诸如如Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、EDTA等或两种或以上的混合缓冲液等。试剂盒可能包括有一个或多个试剂容器。趋向于将ALT1特异性抗体放于一个试剂瓶，而ALT2特异性抗体放于另一试剂瓶，但并非一定需要如此。其它试剂容器可包括用于检测与抗体结合的ALT1或ALT2的必需试剂。应用该试剂盒时，需将含有ALT1和/或ALT2的样本加入含有抗体的容器使其与ALT1特异性抗体或ALT2特异性抗体接触适当时间后，洗涤并加入特异性针对ALT1或ALT2的标记抗体，再次洗涤以除去未结合的标记抗体，检测结合的标记抗体而完成检测。该试剂盒中可能包括如何判定样本中ALT1和/或ALT2的量以及该测定的量所提示的相关诊断的指引。该试剂盒也可能包括有阴性和阳性对照品。

此处提供的样本仅作说明之用，并不意味限制本发明的范围。有 关本申请的方法学的详细描述中提及的参考文献方法，在实际应用时将有可能在不改变其基本精神前提下作不同的变化或修饰。

Claims (9)

1.一种分离和纯化的ALT2蛋白质，由序列编号1所示的核酸序列所编码。

2.一种与权利要求1所述的分离和纯化的ALT2蛋白特异性结合的抗体蛋白。

3.一种ALT2表达载体，其中，含有编码权利要求1所述的分离和纯化的ALT2蛋白质的核酸序列。

4.一种用于诊断含ALT2的组织的损伤和疾病的试剂盒，包括：

检测体液中ALT2蛋白质的测定剂；所述ALT2蛋白质的测定剂为编码权利要求1所述的ALT2蛋白质的核酸探针或者能与ALT2蛋白质相结合的抗体。

5.如权利要求4所述的诊断试剂盒，其中，进一步包括：

检测体液中ALT1蛋白质的测定剂；所述ALT1蛋白质的测定剂为编码ALT1蛋白质的核酸探针或者能与ALT1蛋白质相结合的抗体，所述ALT1蛋白质指如序列编号3所示的氨基酸序列。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，所述试剂盒中的测定剂检测被测体液时，采用生物学分析法、基于抗体的分析法、酶联免疫吸附分析法、蛋白质免疫印迹分析法、快速免疫分析法或放射免疫分析法。

7.如权利要求4或5所述的试剂盒，所述体液样本包括血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、脑脊液、肠液、关节液、齿龈液、阴道液和胸腔液中的一种或几种。

8.如权利要求4或5所述的试剂盒，所述组织包括肝、脑、肌肉、心脏、脂肪和肾脏。

9.一种制备权利要求1所述的ALT2蛋白质的方法，包括：

(1)将编码所述ALT2蛋白质的核酸序列引入到一种表达载体中；

(2)将该表达载体引导进入宿主细胞中而形成重组宿主细胞；

(3)将该重组宿主细胞置于可表达ALT2蛋白质的条件下。

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