CN106460035A - 用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物 - Google Patents

用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN106460035A
CN106460035A CN201580009696.7A CN201580009696A CN106460035A CN 106460035 A CN106460035 A CN 106460035A CN 201580009696 A CN201580009696 A CN 201580009696A CN 106460035 A CN106460035 A CN 106460035A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
compositionss
sequence
nucleic acid
iii
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580009696.7A
Other languages
English (en)
Inventor
吴梦楚
阿西尼·史密诺夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wei (shanghai) Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Bella Medical Singapore Pte Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bella Medical Singapore Pte Ltd filed Critical Bella Medical Singapore Pte Ltd
Publication of CN106460035A publication Critical patent/CN106460035A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及可以用作定量和/或半定量检测方法，具体地，数字PCR或下一代测序测定的对照和/或参考的组合物。本发明还描述了合成核酸构建体，具体地，存在于所述组合物中的质粒、试剂盒、它们的用途以及涉及根据本发明所述的组合物的用途的方法。此外，本文描述了用于提供根据本发明所述的组合物的方法。

Description

用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物
技术领域
本发明涉及可以用作定量和/或半定量突变检测方法，具体地，数字PCR或下一代测序方法的对照和/或参考的组合物。本发明还描述了合成核酸构建体，具体地，存在于所述组合物中的质粒、包含所述组合物的试剂盒、它们的用途以及涉及使用根据本发明所述的组合物的方法。此外，本文描述了用于提供根据本发明所述的组合物的方法。
背景技术
核酸序列的使用已成为现代医学的多种诊断领域中的必需工具。具体地，基于下一代测序(NGS)的基因测试正迅速在临床诊断学中获得认可。该领域的实例为肿瘤学，其中使用核酸测序来鉴定(例如)致癌突变是否存在于基因中或者引起和/或指明癌症的移位是否存在于基因组中。此外，使用核酸测序来检测病原微生物(如，例如，细菌或病毒)是否存在于来自人患者的临床样品，例如，组织样品或血液样品中。在后一种方法中，检测不存在于人受试者中，而仅存在于微生物中的核酸序列。因此，NGS方法可以导致靶标序列的鉴定和序列确定，其可以表明致癌突变的存在或不存在或者病原体-来源的核酸的存在或不存在。
因此，目前开发了用于诊断目的的基于NGS技术及其它定量和/或半定量突变检测方法的诊断试剂盒和/或方法。然而，由于管理性规定，在许多国家，在实际产品许可进入市场之前，必须显示这类诊断试剂盒和方法的准确度和有用性(例如，通过达到特定灵敏度阈值)。
在该背景下，通常需要显示所使用的方法适合检测稀有突变或稀有核酸，例如，以5％或以下的频率在临床样品中发生的突变或核酸。另外，为了确保已正确进行诊断方法，由此避免任何假阴性结果，还必须提供具有如通常在临床样品中处于类似的低频率的待检测的突变或核酸的阳性对照。
然而，对于稀有突变(如在某些类型癌症中存在的突变)或对于以低百分比存在于样品中的核酸(例如，来源于病原体的核酸)，很难获得可以用作测试材料的携带处于所需频率的待检测的突变和/或核酸的临床样品。因此，需要包含处于所需频率的待检测的稀有突变和/或核酸的参考组合物和/或对照组合物。
发明内容
因此，本发明的目标是提供这种参考和/或对照组合物。
在本发明的背景中，现已意外地发现组合物以限定的摩尔比包含(i)合成核酸构建体，具体地，包含至少一种插入的野生型核酸序列的质粒或(ii)基因组DNA和(iii)合成核酸构建体，具体地，包含至少一种插入的靶标核酸序列的质粒，所述组合物可以用作用于半定量和/或定量方法(如NGS或数字PCR)的这种参考和/或对照组合物。
通过使用本发明所述的组合物，不再需要使用可能难以获得并且其中所存在的待检测的突变或核酸的频率可能不同的临床样品。此外，本发明所述的组合物提供了以下优势：可以提供它们用于任何所需的待检测突变或核酸或待检测突变或核酸的组合以及用于任何所需百分比的待检测突变或核酸。
在以下说明中，提及了存在于根据本发明所述的组合物中的质粒(i)和(iii)。然而，应理解当然在本发明的背景中还可以使用能够包含野生型靶标序列或其突变体或者任何其它序列(如来源于病原体的序列)中任一种的任何其它合成核酸构建体。
因此，在一个方面，本发明涉及组合物，其包含：
(i)含有至少一种插入的野生型核酸序列的质粒，或
(ii)野生型基因组DNA序列，
与限定的摩尔比的
(iii)含有至少一个插入的靶标核酸序列的质粒。
一个实施方式涉及所述组合物，其中所述质粒(iii)包含1-50个插入的靶标核酸序列。在另一个实施方式中，质粒(iii)包含1-30个插入的靶标核酸序列。
在其它实施方式中，质粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个插入的靶标核酸序列。
在另一个实施方式中，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩尔比在1:10-1:30的范围内，任选地，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩尔比为1：15至1:25，例如，1:20、1:18，任选地，1:19。
在另一个实施方式中，所述组合物为用于定量和/或半定量突变检测方法的阳性对照组合物或参考组合物。
在一个实施方式中，所述定量和/或半定量突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。
本发明的另一个方面涉及在定量和/或半定量突变检测方法中如本文所述的组合物作为对照组合物和/或参考组合物的使用。在一个实施方式中，将所述组合物用作阳性对照组合物。
在另一个方面，将所述组合物用于测试定量和/或半定量突变检测方法的灵敏度。
在另一个实施方式中，将确认对于平均以10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％存在于样品中的一个或多个靶标序列的灵敏度。
在其它实施方式中，所述突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。
在另一个实施方式中，所述定量和/或半定量突变检测方法用于来源于病原体或致癌基因的序列的存在与否的检测。
本发明的其它方面涉及确认半定量和/或定量检测方法对于一个或多个靶标序列的灵敏度的方法，其包括以下步骤：
(i)提供如本文所述的组合物，
(ii)使用所述组合物实施所述半定量和/或定量检测方法，和
(iii)评价所述检测方法的灵敏度。
本发明的另一个方面涉及制备如本文所述的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将野生型序列引入到质粒中或提供野生型基因组DNA(gDNA)，
(ii)将至少一个靶标序列引入到单独的质粒中，
(iii)所述质粒和/或gDNA的绝对定量
(iv)以限定的摩尔比制备(i)和(ii)的组合物。
在用于制备如本文所述的组合物的方法的一个实施方式中，通过数字PCR(dPCR)，任选地通过数字微滴式PCR(ddPCR)进行所述质粒或gDNA的绝对定量。
本发明的另一个方面涉及包含如本文所述的组合物的试剂盒。
附图说明
图1显示了制备作为如以下所述的实施例中所使用的NGS测定的测试材料的质粒组合物的列表。
定义
除非上下文中明确规定，否则如本说明书和权利要求中所使用的，单数形式的“一个”也包括相应的复数形式。反之亦然，当使用名词的复数形式时，除非上下文明确表明，否则它还表示单数形式。例如，当提及复数的突变时，还理解为涉及单个突变。
需要理解术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由…组成”应认为是术语“包括”的优选实施方式。如果在下文中将组定义为包括至少某些实施方式，则这还意味着涵盖了优选地仅由这些实施方式组成的组。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三或(i)、(ii)、(iii)等用于区别类似的元素并且不必须用于描述顺序或依时间次序。应理解在适当的情况下，如此使用的术语是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方式能够以本文所述或所示的顺序以外的顺序进行。然而，在本发明的具体实施方式中，依时间次序进行方法步骤(i)、(ii)和(iii)，其任选地包括本文定义的任何中间步骤。
在本发明的背景中，所表示的任何数值通常与本领域技术人员将理解的仍确保所讨论的特征的技术效果的准确度间隔有关。如本文所使用的，与所示数值的偏差在±10％的范围内，并且优选地，±5％的范围内。还通过本文所使用的术语“约”和“大约”相对于数值表明了上述与所示±10％，并且优选地±5％的数值间隔的偏差。
在本发明的背景中，术语“核酸”是指处于单链或双链形式的天然存在的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物。所述核酸可以具体地为双链DNA和单链RNA。
如本文所使用的术语“序列”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中碱基的顺序出现，其中脱氧核糖核苷酸聚合物中存在的碱基选自A、T、G和C，核糖核苷酸聚合物中存在的碱基选自A、U、G和C。因此，脱氧核糖核苷酸聚合物中碱基序列可以是(例如)GGAAGCAAGCCT，而核糖核苷酸聚合物中碱基序列可以是(例如)GGAAUCGAU。
如本文所使用的“野生型序列”或“野生型核酸序列”涉及通常在群体，例如人中存在的核酸序列。在本发明的背景中，“野生型序列”表示所述序列不指示对于通过所使用的诊断方法检测的病症(例如，特定类型癌症)或病原生物。这也适用于如本文所使用的“野生型基因组DNA”，其还涉及通常在群体(例如人)中存在的所述DNA序列，或者如在本发明的背景中所使用的，所述DNA序列不指示通过所使用的诊断方法检测的病症或病原生物。
如本文所提及的“靶标序列”或“靶标核酸序列”是这样的核酸序列，在根据本发明所述的方法中检测所述核酸序列的存在与否并且所述核酸序列指示通过所使用的诊断方法检测的病症或病原生物。一个或多个靶标序列的存在可以指示癌症(例如，致癌基因)，或者微生物(具体地，病原微生物)的存在，或者涉及任何其它疾病(例如，代谢疾病、遗传病症、自身免疫病等)的发展、严重性、恢复的核酸序列。
靶标核酸包括(但不限于)DNA，如(但不限于)基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等，和RNA，如(但不限于)mRNA、miRNA等。靶标核酸可以来源于任何来源，包括天然存在的来源或合成来源。所述核酸可以是PCR产物、粘粒、质粒、天然存在或合成的文库成员或种类等。本发明不意欲限制于该方面。所述核酸可以来自动物或病原体来源，其包括但不限于哺乳动物，如人，和微生物，如细菌、病毒、真菌、寄生虫和分枝杆菌属。在一些实施方式中，所述核酸不是病毒核酸。靶标核酸可以得自任何体液或组织，其包括(但不限于)血液、唾液、脑脊髓液(“CSF”)、皮肤、毛发、尿液、大便和粘液。靶标核酸还可以来源于但不限于环境样品(如水样)、食物样品、或森林样品，所述样品可以是新鲜样品(例如，直接进行核酸提取的活组织检查材料)，或已处理使得能够储存的样品，例如，福尔马林-固定和/或石蜡包埋的样品(FFPE样品)。
具体地，所述靶标序列可以是携带先前插入到质粒的野生型序列(i)或野生型基因组DNA(ii)的突变的序列，所述序列应通过如本文所述的诊断方法检测(即靶标突变)。具有靶标突变的这些靶标序列可以指示致病状况，如癌症(即所谓的致癌基因)。此外，靶标序列可以是指示病原体的存在，如病原微生物的存在的序列。
如本文所使用的“稀有突变”或“稀有核酸序列”表示以平均小于10％，具体地，平均小于5％存在于得自患者的临床样品中的核酸的任何突变或序列。“以平均x％存在于样品中的靶标序列”表示相对于存在于样品中的野生型序列的量以百分比x存在于样品中的靶标序列。因此，如本文所使用的靶标序列的百分比始终涉及存在于组合物和/或样品中的野生型序列的量和靶标序列的量的比值。
如本文所使用的，术语“样品”是指来自任何人或兽医受试者的可以测试包含靶标序列的核酸的存在的任何生物样品。所述样品可以包括得自任何器官的组织，如(例如)肺组织，和得自任何器官的液体，如(例如)血液、血浆、血清、淋巴液、关节液、脑脊髓液、羊膜水、羊膜脐血、泪、唾液和鼻咽清洗液。如上所列，样品还可以来源于身体的特定区域，例如，呼吸道；来自呼吸道的样品包括喉拭子、喉清洗液、鼻拭子和来自下呼吸道的样品。如本文所使用的样品还包括包含肿瘤组织的实体组织样品。这些样品可以包括肿瘤组织和周围组织或者仅肿瘤组织。
所述样品可以来源于人或兽医受试者。因此，“患者”可以是人或兽医受试者。如果提及“临床样品”，则这表示该样品来自于怀疑带有包含靶标序列的核酸的患者。
术语“致癌基因”分别以其在分子生物学和肿瘤学中的常规含义在本文中使用。因此，存在(例如)在基因中已知的突变，其使得“正常或野生型”基因具有致癌性，即引起癌症；这方面的实例为使得激酶具有组成型活性从而持续传递特定信号(例如，诱导生长的信号)并起始相应过程的突变。如本文所使用的“致癌基因”还可以涉及也会导致引起癌症情况的染色体内或染色体间易位。如本文所使用的术语“微生物”以其最广泛的含义使用。因此，微生物可以是任何类型的细菌、古菌、原生动物(protozoum)、真菌和病毒。明确提及病毒在如本文所使用的“微生物”的定义内。如本文所使用的术语“病原体”或“病原微生物”涉及具有在患者中导致疾病的能力的任何类型的微生物。
如本文所使用的术语“检测存在”应理解为“检测存在或不存在”。
如本文所使用的“诊断方法”表示可以用于诊断目的，例如，用于检测存在于得自患者的样品中的靶标序列的任何定量或半定量突变检测方法。具体地，诊断方法表示下一代测序方法和微滴式PCR(dPCR)，任选地，数字微滴式PCR(ddPCR)。
“定量检测方法”或“定量突变检测方法”表示可以用于确定靶标序列的量的任何检测方法，如下一代测序、qPCR或数字PCR。如本文所使用的“半定量检测方法”或“半定量突变检测方法”涉及允许近似确定靶标序列的量的任何方法，如PCR或RT-PCR。
如本文所使用的“数字PCR”涉及其中将样品分配到大量小的子样品中，并随后对每个子样品进行PCR扩增反应的任何PCR方法。PCR扩增之后，考虑泊松分布可以通过对包含PCR最终产物的子样品(阳性反应)和不包含PCR最终产物的子样品(阴性反应)计数来定量核酸。与常规PCR相反，数字PCR(dPCR)不依赖于为了确定初始样品的量所实施的扩增循环的数目，因此消除了对定量靶标核酸的不确定指数数据的依赖性并且提供了绝对定量。如本文所使用的“数字微滴式PCR”涉及数字PCR方法，其中将初始样品细分成构成子样品的一些微滴。
如本文所使用的，术语“下一代测序”或“下一代测序方法”是指与常规基于桑格和毛细管电泳的方法相比，通量提高(例如，具有每次产生数十万相对小的序列读数的能力)的任何测序技术。下一代测序技术的一些实例包括(但不限于)通过合成测序、通过连接测序和通过杂交测序。
如本文所使用的，术语“扩增”是指酶介导的程序，其能够产生数十亿的核酸靶标的拷贝。本领域中已知的酶介导的靶标扩增程序的实例包括PCR。
“提取核酸”是指从任何细胞背景中分离存在于小瓶中的任何核酸，具体地，从完整细胞或组织分离。优选地，在所述方法期间还清洗核酸并任选地浓缩。提取后，除去与核酸无关的所有细胞或组织碎片。典型的提取方法可以包括低渗裂解缓冲液、热和/或去污剂的使用，并且所述提取方法是技术人员已知的。
在本文中以分子生物学中的常规含义使用术语“测序”。因此，确定了核酸序列中准确的碱基顺序出现。
具体实施方式
如以上所讨论的，需要可以用作包含在半定量或定量核酸突变检测方法中检测的稀有突变或稀有核酸的对照或参考组合物的组合物。
在本发明的背景中，现已发现包含含有插入的野生型核酸序列或野生型基因组DNA的质粒与限定的摩尔比的含有至少一种插入的靶标序列的质粒的组合物可以用于这些目的。
因此，本发明的一个方面涉及组合物，其包含：
(i)含有至少一种插入的野生型核酸序列的质粒，或
(ii)野生型基因组DNA序列，
与限定的摩尔比的
(iii)含有至少一个插入的靶标核酸序列的质粒。
所述插入的靶标核酸序列可以是携带野生型序列的突变或指示通过如本文所述诊断方法检测的病原体存在的序列的任何序列。通过如本文所述的诊断方法检测的突变可以是指示疾病或病症，如癌症的任何突变。
在一个实施方式中，质粒(iii)可以包含指示癌症的任何靶标序列或靶标序列的组合。例如，所述靶标序列或靶标序列的组合可以指示肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、白血病、黑素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、淋巴瘤或卵巢癌。在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌和/或白血病。在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示黑素瘤。在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示非小细胞肺癌。在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示结肠直肠癌。在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示甲状腺癌。在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示白血病。
在一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合指示致癌基因，任选地，人致癌基因。待检测的人致癌基因可以是基因中的突变，所述基因选自BRAF、NRAS、CDKN2A、MAP2K1、MAP2K2、FGFR3、FGFR4、AKT3、KIT、PIK3CA、GNA11和GNAQ。在一个实施方式中，待检测的靶标序列或靶标序列的组合是一个或多个突变，其选自如下表1所示的组：
然而，在另一个实施方式中，所述靶标序列或靶标序列的组合还可以指示微生物的存在，具体地，病原微生物的存在。因此，所述靶标序列或靶标序列的组合还可以指示病毒的存在，例如，丙型肝炎病毒(HCV)或人类免疫缺陷性病毒(HIV)。
在另一个实施方式中，指示致癌基因和微生物的存在的所述靶标序列或靶标序列的组合存在于质粒(iii)上。
在本发明的一个实施方式中，各个质粒(iii)包含超过一个插入的靶标序列，例如，1-50个靶标序列。在另一个实施方式中，质粒(iii)包含1-40个靶标序列。在又另一个实施方式中，质粒(iii)包含1-30个靶标序列。在进一步的实施方式中，质粒(iii)包含1-20个靶标序列。在进一步的实施方式中，质粒(iii)包含1-10个靶标序列。在进一步的实施方式中，质粒(iii)包含1-5个靶标序列。
在本发明的其它实施方式中，质粒(iii)可以包含图1中所示的靶标序列的任意组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1中质粒混合物No.1的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.2的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.3的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.4的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.5的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.6的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.7的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.8的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.9的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.10的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.11的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.12的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.13的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.14的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.15的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.16的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.17的靶标序列的组合。在一个实施方式中，质粒(iii)包含图1质粒混合物No.18的靶标序列的组合。当然，还可能根据需要合并以上提及的一个或多个混合物。
应理解质粒(i)可以包含对应于质粒(iii)的靶标序列的野生型序列，并因此还包含相同量的作为插入质粒(iii)中的靶标序列的野生型序列。例如，如果质粒(iii)包含5个在BRAF基因中具有突变的靶标序列，则质粒(i)还可以包含BRAF基因的相应5个野生型序列。一般地，质粒(i)和(iii)可以在一个或多个不同的单个质粒或子混合物(sub-pool)上携带所有所需的序列(野生型或突变序列)。例如，包含约30个插入序列的质粒混合物可以在构成所述质粒混合物的单个质粒上携带所有这些。可选地，还考虑质粒混合物包含超过一种类型的携带几个，例如，3、4、5或更多个插入序列的质粒，例如，2、3、4、5或更多种质粒。这些单个质粒构成了可以在一起形成质粒混合物的亚组。本发明的优势在于质粒亚组可以用于验证不同的测定，例如，当可以在不同的测定(例如，癌症测定1和癌症测定2)中使用靶标基因时，不需要重新设计整个质粒混合物(i)和(iii)。
如果将超过一个靶标序列或超过一个野生型序列插入质粒(i)或(iii)时，可以以特定距离在质粒中引入野生型或靶标序列。野生型或靶标序列之间的距离可以是本领域技术人员认为适合的任何距离。应理解质粒(iii)上存在的不同的野生型或靶标序列之间的距离可以在每个野生型或靶标序列之间是相同或者可以在不同的野生型或靶标序列之间改变。质粒(iii)上存在的野生型或靶标序列之间的距离可以为至少10bp、至少30bp、至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少350bp或至少400bp。
存在于所述组合物中的质粒可以是本领域技术人员出于该目的认为适合的任何质粒。本领域技术人员已知出于该目的适合的质粒，并且所述质粒可以包括pBR322、pBR327、pUC-8、pUC-19、pUC-57、pGEM3Z、M13mpl、M13mp2和M13mp7。
如果本发明的组合物包含(i)含有至少一种插入的野生型序列的质粒和(iii)包含至少一种插入的靶标序列的质粒，则质粒(i)和(iii)可以基于相同类型的质粒或不同类型的质粒。在一个实施方式中，质粒(i)和(iii)基于相同类型的质粒。在另一个实施方式中，质粒(i)和(iii)两者均基于pUC-57。
质粒(i)或gDNA(ii)可以与质粒(iii)以本领域技术人员认为适合的任何摩尔比存在，以实现和/或确认诊断方法所需的灵敏度。所需的灵敏度可以是例如出于上市许可的目的所述诊断方法必须实现的任何灵敏度。如本文所使用的“灵敏度”表示通过所述诊断方法实际正确鉴定为靶标序列的比例，即它涉及诊断方法正确鉴定靶标序列的能力。
(iii)与(i)或(ii)的摩尔比可以是任何摩尔比，其使得能够实现通常在样品，具体地，临床样品中存在的通过诊断测试应检测的靶标序列的平均百分比。(iii)与(i)或(ii)的摩尔比可以是靶标序列以约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％存在于根据本发明所述的组合物中的任何摩尔比。在一个实施方式中，(iii)与(i)或(ii)的摩尔比是靶标序列以约5％存在于根据本发明所述的组合物中的摩尔比。
因此，(iii)与(i)或(ii)的摩尔比可以在1:10-1:30的范围内。在一个实施方式中，(iii)与(i)或(ii)的摩尔比选自1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30。在本发明的一个实施方式中，(iii)与(i)或(ii)的摩尔比为1:19。在本发明的背景中，已发现当(iii)与(i)或(ii)的摩尔比为1:19时，所述组合物中靶标核酸的百分比为约5％。
如本文所述的组合物还可以引入到细胞或细胞系中，随后对所述细胞或细胞系进行福尔马林-固定和石蜡-包埋。因此，可以提供福尔马林-固定和石蜡-包埋(FFPE)的参考组合物和/或对照组合物。当将通过所述诊断方法测试的样品为通常的FFPE样品时，因为FFPE参考和/或对照组合物可以更好地反映存在于得自人或兽医受试者的样品中的背景，因此这种FFPE组合物可以是特别适合的。因此，本发明的另一个方面涉及已引入细胞(所述细胞随后进行福尔马林-固定和石蜡-包埋)的如本文所述的组合物。
本文所述的组合物可以用作用于任何定量或半定量法的参考或对照组合物。然而，在本发明的一个方面，在NGS方法或数字PCR中将如本文所述的组合物用作参考或对照组合物。在具体的实施方式中，其中将本文所述的组合物用作参考或对照组合物的检测方法是NGS方法。在另一个实施方式中，其中本文所述的组合物用作参考或对照组合物的检测方法是数字PCR，任选地，数字微滴式PCR。
通常使用参考组合物以确认和/或测试诊断方法(例如，定量和/或半定量突变检测方法)的灵敏度，而使用对照组合物以确保诊断方法(例如，定量和/或半定量法)正确进行。本文所述的组合物可以用于这两个目的。
在本发明的背景中，“参考组合物”(或“标准品”)是以预定量包含一个或多个靶标序列(如包含稀有突变的序列或对某些病原体具有特异性的序列)的组合物，其可以用于测试所述诊断方法是否能够检测和/或测定所述靶标序列。如在本发明的背景中使用的“对照组合物”表示用作对照，具体地，阳性对照的任何组合物，以确保所述诊断方法已正确进行。通常，对照组合物以预定的量包含通过所述诊断方法应检测的一种或多种靶标序列。因此，在本发明的一个实施方式中，所述对照组合物是阳性对照组合物。其中所述靶标序列存在于参考组合物或对照组合物中的预定的量通常反映了靶标序列存在于待测试是否存在所述靶标序列的样品中的平均百分比。然而，具体地，相对于参考组合物，预定的量还可以是存在于样品中的靶标核酸的任何百分比，例如，出于上市许可的目的，所述诊断方法应能检测所述靶标核酸。以上描述了靶标序列的不同百分比和相应摩尔比。因此，在参考组合物的一个实施方式中，它包含约5％的靶标序列。
在本发明的另一个方面，如本文所述的组合物可以用于确认诊断方法(例如，定量和/或半定量突变检测方法)的灵敏度。
具体地，可以使用如本文所述的组合物以确认所述诊断方法对于平均以约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％存在于来源于人或兽医受试者的样品中的一种或多种靶标序列的灵敏度。在本发明的一个实施方式中，如本文所述的组合物用于确认诊断方法对于平均以约10％存在于来源于人或兽医受试者的样品中的一种或多种靶标序列的灵敏度。在本发明的另一个实施方式中，如本文所述的组合物用于确认诊断方法对于平均以约5％存在于来源于人或兽医受试者的样品中的一种或多种靶标序列的灵敏度。
在本发明的一个实施方式中，如本文所述的组合物可以用于确认数字PCR和/或下一代测序方法的灵敏度。在一个实施方式中，所述组合物用于确认数字PCR，具体地，数字微滴式PCR的灵敏度。在另一个实施方式中，所述组合物用于确认下一代测序方法的灵敏度。
在进一步的实施方式中，将对其确认灵敏度的所述诊断方法是用于检测靶标序列(如指示如本文所述的致癌基因或病原生物的靶标序列)是否存在的定量和/或半定量突变检测方法。
本发明的另一个方面涉及确认诊断方法(如半定量和/或定量突变检测方法)的灵敏度的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)提供如本文所述的组合物，
(ii)使用所述组合物实施所述检测方法，和
(iii)评价所述方法的灵敏度。
所述方法的步骤(i)可以包括用于制备本文所述的组合物的方法的任何步骤。应理解出于其预期使用的目的，可以调整所述组合物。如果(例如)应确认所述诊断方法对于平均以5％存在于样品中的一种或多种靶标序列的灵敏度，则必须使用以5％包含所述靶标序列的参考组合物。因此，在一个实施方式中，在确认诊断方法灵敏度的方法中使用以1:19的摩尔比包含质粒(iii)和质粒(i)或gDNA(ii)的组合物。
在步骤(ii)中，通过使用如本文所述的组合物作为参考组合物，可以实施应确认灵敏度的检测方法(例如，半定量和/或定量检测方法)。例如，在步骤(ii)中，使用如本文所述的组合物作为参考组合物，实施下一代测序方法或数字PCR。在所述方法的一个实施方式中，在步骤(ii)中，实施下一代测序方法。在所述方法的另一个实施方式中，在步骤(ii)中，实施数字PCR，具体地，数字微滴式PCR。
在确认如本文所述的诊断方法的灵敏度的方法的步骤(iii)中，评价了所述诊断方法用于检测靶标序列的灵敏度。由于已知存在于所使用的参考组合物中的靶标序列的百分比，因此这可以通过将通过所实施的检测方法实现的结果与存在于参考组合物中的靶标序列已知的百分比相比较来进行。
应理解可以在几个平行的试验中进行步骤(i)-(ii)，并随后在步骤(iii)中，将在试验中获得的值的平均百分比与存在于参考组合物中的靶标核酸已知的百分比相比较。
因此，在一个实施方式中，可以在至少2、至少3、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少50或至少100个平行试验中进行步骤(i)-(ii)，并且随后将在所述试验中检测的靶标核酸的平均百分比与存在于参考组合物中的靶标核酸的已知百分比相比较。在另一个实施方式中，可以在2-100个平行试验中进行步骤(i)-(ii)，任选地，在10-50个平行试验中进行，并随后将在所述试验中检测的靶标核酸的平均百分比与存在于参考组合物中的靶标核酸已知的百分比相比较。在另一个实施方式中，在2、3、5、10、15、20、25、30、50或100个平行试验中进行步骤(i)-(ii)，并随后将在所述试验中检测的靶标核酸的平均百分比与存在于参考组合物中的靶标核酸的已知百分比相比较。。
如果在步骤(iii)中发现通过待测试的诊断方法确定的靶标序列的百分比对应于存在于参考组合物中的靶标核酸已知的百分比，则确认所述测试对于参考组合物的灵敏度。应理解如在本发明的背景中使用的，“对应于存在于参考组合物中的靶标核酸已知的百分比”不必须表示通过待测试的诊断方法确定的靶标序列的百分比和存在于参考组合物中的百分比确实必须是完全相同的值。本领域技术人员应理解这些值之间的某些偏差是可以接受的，具体地，如果确定了已实施的平行试验的平均值。不同的值之间的偏差量可以取决于测试所需的灵敏度。然而，在一个实施方式中，通过待测试诊断方法确定的靶标序列的值和存在于参考组合物中的靶标序列已知的值之间0.1％-10％的偏差，任选地，0.1-5％的偏差可以认为是可接受的。在一个实施方式中，通过待测试诊断方法确定的靶标序列的值和存在于参考组合物中的靶标序列已知的值之间0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5％的偏差可以认为是可接受的，以确认所述诊断方法的灵敏度。
在它的另一个方面，本发明涉及用于制备如本文所述的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将野生型序列引入到质粒中或提供野生型基因组DNA(gDNA)，
(ii)将靶标序列引入到单独的质粒中，
(iii)质粒和/或gDNA的绝对定量
(iv)以限定的摩尔比制备(i)和(ii)的组合物。
可以通过本领域技术人员已知用于将序列引入到质粒中或用于提供基因组DNA的任何方法实施所述方法的步骤(i)和(ii)。步骤(iii)包括包含至少一种野生型序列的质粒、gDNA和/或携带靶标序列的质粒的绝对定量。在一个实施方式中，步骤(iii)包括包含至少一种野生型序列的质粒和携带靶标序列的质粒的绝对定量。在另一个实施方式中，步骤(iii)包括gDNA和携带靶标序列的质粒的绝对定量。
可以通过使用本领域中已知的任何定量检测方法，如qPCR、dPCR或NGS进行在步骤(iii)中实施的绝对定量。在本发明的一个实施方式中，通过dPCR，具体地，通过ddPCR进行绝对定量。
基于步骤(iii)中获得的结果，可以通过这种方式混合(i)和(ii)的组合物以在本文所述的方法的进一步的步骤(iv)中实现(ii)与(i)所需的摩尔比。在本发明的一个实施方式中，以这种方式混合(i)和(ii)的组合物从而获得1:19的摩尔比的包含靶标序列的质粒和包含至少一种野生型序列或gDNA的质粒。
通过上述方法获得的组合物可以是如本文所述的任何组合物，并因此可以用于如本文所述的任何目的。
在本发明的进一步的方面，提供了包含如本文所述的组合物的试剂盒。这些试剂盒可以是包含如本文所述的组合物作为参考组合物的试剂盒。可选地，这些试剂盒可以是包含如本文所述的组合物作为阳性对照的试剂盒。
在一个实施方式中，所述试剂盒还包含用于要实施的诊断方法，例如，用于半定量和/或定量突变检测方法的其它试剂。在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于下一代测序方法和/或数字PCR的其它试剂。其它试剂可以包括化学试剂。此外，根据本发明所述的试剂盒还可以包含说明书插页等。
应理解如本文所定义和使用的所有定义优先于词典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的常规含义。本文提及的所有专利和专利公开以其全部内容通过引用并入。
应理解尽管已结合本文所述的实施方式描述了本发明，但是上述描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。本发明的范围内的其它方面、优势和修饰对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。
提供以下实施例，从而为本领域的技术人员提供如何制备和使用本发明的组合物的完整公开和描述。所述实施例旨在作为本发明的非限制性实施例。尽管已尽力确保变量，如量、温度等的准确度，但是应考虑实验误差和偏差。除非另外说明，否则分数是重量份数，温度以℃为单位，并且压力为或接近大气压。除非另外说明，否则所有组分是商业获得的。
实施例
方法：
简而言之，将野生型基因扩增子序列引入到质粒pUC-57。将突变基因序列(即特定靶标序列)引入到单独的质粒。将相距特定距离的几个靶标序列引入到相同的基因扩增子序列和包含靶标序列不同组合的一个质粒，所述质粒可以来源于描述各个质粒混合物的图1中所示的表。由于包含野生型序列(WT质粒)的质粒和具有靶标序列的质粒(Mut质粒)共有相同主链序列，因此设计引物以使用QX200 EvaGreen ddPCR Supermix进行微滴式数字PCR(dd-PCR)来定量每个质粒的绝对拷贝数。可以将相同的ddPCR方法应用于定量可商购的正常人基因组DNA(gDNA)，例如，Promega，Cat#g1521的拷贝数。在测量质粒和/或正常人gDNA的绝对拷贝数之后，将Mut质粒与WT质粒或正常人gDNA混合为任何限定的摩尔比。然后，通过Vela Diagnostics的肿瘤学下一代测序(NGS)测定法测试这些质粒组合物。
总结：
已发现通过上述方法制备的质粒组合物可以用作定量和半定量突变检测方法(如数字PCR或下一代测序(NGS))的阳性对照或参考材料以确认所述技术对于在临床样品中难以发现的任何类型的靶标序列，包括稀有序列可以实现特定灵敏度(例如5％)。
结果：
通过上述方法产生了18个质粒混合物。如图1所示的表中所述，质粒混合物含有1-30个靶标序列范围内的不同数目的特定靶标序列。将总计131个突变引入到这18个质粒混合物中。通过NGS测定对所有18个质粒混合物测试3-5次，并且报告所有靶标序列的频率。下表2中总结了结果。这些结果显示当按照以上规程制备的质粒组合物以1:19的摩尔比含有Mut质粒和WT质粒时，对于质粒中大部分靶标序列，通过NGS测定检测的靶标序列频率为平均5％。结果还显示可以将在一个基因扩增子序列中相隔特定距离的多个突变引入相同质粒并且通过NGS测定检测的靶标序列的频率是非常类似的，参见，例如，质粒1，其在一个BRAF基因扩增子序列中携带5个突变。另外，结果表明可以将具有野生型和突变型两者的不同的基因扩增子序列的各种数目的质粒混合到相同的混合物中以同时评价对于不同基因突变的灵敏度，例如，如混合物1所示的具有9个不同靶标序列的质粒。
表2.使用以5％的限定的摩尔比混合的质粒混合物进行的NGS测定所测量的靶标序列频率

Claims (15)

1.组合物，其包含：
(i)包含至少一种插入的野生型核酸序列的合成核酸构建体，任选是质粒，其，或
(ii)野生型基因组DNA序列
与限定的摩尔比的
(iii)包含至少一种插入的靶标核酸序列的合成核酸构建体，任选地，质粒。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述合成核酸构建体，任选地质粒(iii)包含1-50个插入的靶标序列，任选地合成核酸构建体，任选地质粒(iii)包含1-30个插入的靶标序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述合成核酸构建体，任选地质粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个插入的靶标序列。
4.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中(iii)与(i)或(ii)限定的摩尔比在1:10-1:30的范围内，任选地(iii)与(i)或(ii)的摩尔比为1:19。
5.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物为用于定量和/或半定量突变检测方法的阳性对照组合物或参考组合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述定量和/或半定量突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。
7.根据以上权利要求中任一项所述的组合物在定量和/或半定量突变检测方法中作为对照组合物和/或作为参考组合物的用途，任选地，所述组合物用作阳性对照组合物。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物测试定量和/或半定量突变检测方法的灵敏度的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中将确认对于平均以10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％存在于样品中的一个或多个靶标序列的灵敏度。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。
11.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述定量和/或半定量突变检测方法用于检测来源于病原体或致癌基因的序列是否存在。
12.确认半定量和/或定量检测方法对于一个或多个靶标序列的灵敏度的方法，其包括以下步骤：
(i)提供根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，
(ii)使用所述组合物实施所述半定量和/或定量检测方法，和
(iii)评价所述方法的灵敏度。
13.用于制备根据权利要求1-6中任一项所述的组合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将野生型序列引入到合成核酸构建体，任选是质粒，或提供野生型基因组DNA(gDNA)，
(ii)将至少一种靶标核酸序列引入到单独的合成核酸构建体，任选是质粒，
(iii)合成核酸构建体，任选是质粒和/或所述gDNA的绝对定量
(iv)以限定的摩尔比制备(i)和(ii)的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述质粒或gDNA的绝对定量通过数字PCR(dPCR)进行，任选地，通过数字微滴式PCR进行。
15.包含根据权利要求1-6中任一项所述的组合物的试剂盒。
CN201580009696.7A 2014-06-30 2015-06-30 用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物 Pending CN106460035A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1411603.2A GB201411603D0 (en) 2014-06-30 2014-06-30 Compositions for quantitative and/or semiquantitative mutation detection methods
GB1411603.2 2014-06-30
PCT/IB2015/001085 WO2016001736A1 (en) 2014-06-30 2015-06-30 Compositions for quantitative and/or semi-quantitative mutation detection methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106460035A true CN106460035A (zh) 2017-02-22

Family

ID=51410356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580009696.7A Pending CN106460035A (zh) 2014-06-30 2015-06-30 用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20170107564A1 (zh)
EP (1) EP3161156A1 (zh)
JP (1) JP2017522856A (zh)
CN (1) CN106460035A (zh)
AU (1) AU2015282387A1 (zh)
GB (1) GB201411603D0 (zh)
WO (1) WO2016001736A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3978627A1 (en) * 2016-03-25 2022-04-06 Karius, Inc. Methods using synthetic nucleic acid spike-ins
CN109477087B (zh) 2016-07-01 2022-06-24 嘉士伯有限公司 通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法
EP3354746B1 (en) * 2017-01-30 2019-05-29 Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology GmbH Novel spike-in oligonucleotides for normalization of sequence data
US20220002781A1 (en) * 2018-10-04 2022-01-06 Arc Bio, Llc Normalization controls for managing low sample inputs in next generation sequencing

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002063043A1 (en) * 2001-02-07 2002-08-15 Krzysztof Kucharczyk Multitemperature single strand conformation polymorphism (msscp)
WO2005086938A2 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Artificial mutation controls for diagnostic testing
CN101403009A (zh) * 2008-11-13 2009-04-08 北京大学人民医院 一种用于检测骨髓增殖性疾病mplw515l突变的试剂盒及其专用引物与探针
CN101434985A (zh) * 2007-11-15 2009-05-20 上海长海医院 K-ras基因突变的定量检测方法
WO2010071147A1 (ja) * 2008-12-16 2010-06-24 アークレイ株式会社 核酸増幅のコントロールの検出方法およびその用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1157131A2 (en) * 1999-02-22 2001-11-28 Lynx Therapeutics, Inc. Polymorphic dna fragments and uses thereof
EP3363901B1 (en) * 2012-02-17 2020-12-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
CA2949622C (en) * 2012-11-26 2019-07-02 The University Of Toledo Methods for standardized sequencing of nucleic acids and uses thereof
US20140162266A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for polymerase chain reaction copy number variation assays
WO2014127484A1 (en) * 2013-02-21 2014-08-28 British Columbia Cancer Agency Branch Spike-in control nucleic acids for sample tracking
US10364465B2 (en) * 2013-11-12 2019-07-30 Life Technologies Corporation Reagents and methods for sequencing
GB201402249D0 (en) * 2014-02-10 2014-03-26 Vela Operations Pte Ltd NGS systems control and methods involving the same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002063043A1 (en) * 2001-02-07 2002-08-15 Krzysztof Kucharczyk Multitemperature single strand conformation polymorphism (msscp)
WO2005086938A2 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Artificial mutation controls for diagnostic testing
CN101434985A (zh) * 2007-11-15 2009-05-20 上海长海医院 K-ras基因突变的定量检测方法
CN101403009A (zh) * 2008-11-13 2009-04-08 北京大学人民医院 一种用于检测骨髓增殖性疾病mplw515l突变的试剂盒及其专用引物与探针
WO2010071147A1 (ja) * 2008-12-16 2010-06-24 アークレイ株式会社 核酸増幅のコントロールの検出方法およびその用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016001736A1 (en) 2016-01-07
JP2017522856A (ja) 2017-08-17
GB201411603D0 (en) 2014-08-13
US20170107564A1 (en) 2017-04-20
EP3161156A1 (en) 2017-05-03
AU2015282387A1 (en) 2016-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200299759A1 (en) Methods of whole transcriptome amplification
CN108796036A (zh) 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
CN111073961A (zh) 一种基因稀有突变的高通量检测方法
CN108513660A (zh) 免疫组库正常性评估方法及其应用
CN106460035A (zh) 用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物
CN106536735A (zh) 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法
CN111321202A (zh) 基因融合变异文库构建方法、检测方法、装置、设备及存储介质
CN107475403A (zh) 从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的方法、试剂盒及其测序结果的分析方法
CN108595918A (zh) 循环肿瘤dna重复序列的处理方法及装置
CN107922966A (zh) 用于核酸扩增的样品制备
CN107937618A (zh) A型塞内卡病毒的微滴数字rt‑pcr检测引物和探针及其应用
CN114592064A (zh) 一种检测多种白血病融合基因的数字pcr试剂盒
CN110863054A (zh) 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法
CN110592215A (zh) 检测核酸序列的组合物及检测方法
CN106011313B (zh) 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
EP2013366B1 (en) Sequencing of the L10 codon of the HIV gag gene
CN113736863A (zh) 诊断方法和组合物
US20210310063A1 (en) Use of droplet single cell epigenome profiling for patient stratification
CN114875118B (zh) 确定细胞谱系的方法、试剂盒和装置
BRPI0609568A2 (pt) detecção de ácido nucléico
CN108949911B (zh) 鉴定和定量低频体细胞突变的方法
CN114085926A (zh) Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN103276107A (zh) 一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法
JP7152599B2 (ja) 塩基配列決定のためのモジュール式およびコンビナトリアル核酸試料調製のためのシステムおよび方法
US20220362771A1 (en) Use of droplet single cell epigenome profiling for patient stratification

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170717

Address after: Taigu road Shanghai Free Trade Zone No. 78 three floor room 333

Applicant after: Wei (Shanghai) Biological Technology Co. Ltd.

Address before: Singapore, Singapore

Applicant before: Bella medical Singapore Pte Ltd

TA01 Transfer of patent application right
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170222

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication