KR20230071480A - 표적 핵산의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)은 핵산을 간단하게 증폭시키는 기술로써 매우 유용하고, 다양한 생물학적 연구 및 진단에서 널리 사용되는 유전자 분석 기술 방법이다(Florencia et al. 2006). 전통적인 PCR 기술은 주형 DNA의 분리 및 정제가 요구된다. 이러한 DNA 주형의 분리 및 정제 공정은 많은 노동력, 시간 및 비용이 요구되기 때문에 이러한 공정은 많은 샘플을 처리할 때, 다양한 세포 타입 및 조직에서 조건이 복잡함을 보여준다. 반면, DNA 분리 정제 공정 없이 동물, 미생물 또는 식물 조직을 직접 PCR 하는 Direct-PCR 기술이 개발되었다(Pierre and Christian 1991; Victor et al. 1993;Yang et al. 2007; Dirk et al. 2010). Direct-PCR 기술은 동일시간 동안에 기존의 PCR 방법보다 시간, 비용이 절감된 효율적이고 빠르며 편리한 방법이다.
최근 바이러스에 의한 질병 문제의 심각성이 부각되면서, 바이러스의 질병을 조기에 진단하기 위한 개발이 진행되어 왔으며, 현재까지 개발된 여러 기술 중에서 RNA 바이러스 검출에 사용되는 가장 대표적인 진단 기술은 역전사 PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 기술과, PCR 기술의 단점을 해결할 수 있는 RNA 검출 기술로서 nucleic acid sequence-based amplification (이하, NASBA이라함) 기술이 개발되었다 (Kievits et al., Journal of Virological Methods, 35:273, 1991). 그러나, NASBA 기술은 표적 RNA로부터 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA가 생성되고, 이후, T7 RNA 중합효소의 전사 반응에 의해 anti-sense RNA가 대량으로 생성되는 반응을 기반으로 하므로, anti-sense RNA 증폭 반응이 오직 T7 RNA 중합효소의 전사 반응에만 의존한다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 기술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 기존 NASBA 기술에 Direct PCR 버퍼를 이용하여 Direct-PCR 기술을 이용함으로써, 기존 NASBA 기술을 바이러스 자체에도 적용하여 높은 증폭 효율을 가지는 신개념 등온 핵산 증폭 반응을 구현할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 핵산의 절단, Direct PCR 버퍼 및 중합연쇄반응 시스템을 기반으로 한 등온 핵산증폭 반응을 통해 RNA/DNA의 추출과정 없이 기존 NASBA 기술의 핵산증폭 반응 효율을 증대시킴으로써, 표적 핵산의 검출 민감도를 증대시키는 방법을 제공하는데 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) 표적 핵산을 DNA 절단효소(Nicking enzyme) 및 Direct PCR 버퍼와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 핵산을 NASBA를 이용하여 증폭하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)" RNA 증폭 및 검출하는 PCR 방법 중 하나이다. NASBA 기술은 등온 조건 (41 
에서 표적 RNA의 증폭 및 검출 반응이 구현되기 때문에, 기존 역전사 PCR 기술의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 등온 핵산 증폭 기술로서 사용되어 왔다. NASBA 기술은 표적 RNA로부터 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA가 생성되고, 이후, T7 RNA 중합효소의 전사 반응에 의해 anti-sense RNA가 대량으로 생성되는 반응을 기반으로 한다. 또한, 상기 생성된 anti-sense RNA를 다시 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA 생성 반응의 기질로 사용함으로써, 높은 효율의 증폭 반응을 구현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 하지만, NASBA 기술의 경우 anti-sense RNA 증폭 반응이 오직 T7 RNA 중합효소의 전사 반응에만 의존한다는 단점이 있다. 따라서, 표적 RNA로부터 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA가 생성되는 반응의 효율이 낮을 경우에는 T7 RNA 중합효소의 전사 반응을 기반으로 한 anti-sense RNA 증폭 반응의 효율에도 문제가 발생할 수 있으며, 이는 착오 신호 (false signal)를 발생시키는 요인으로 작용할 수 있다.
본 발명에서는 기존의 NSABA의 문제점을 해결하고자, Direct PCR 버퍼를 이용하여 Direct-PCR 기술을 융합하고자 하였으며, 이를 통해 기존 NASBA 기술을 바이러스 자체에도 적용하여 높은 증폭 효율을 가지는 신개념 등온 핵산 증폭 반응을 구현할 수 있다는 것을 최초로 규명하였다는데 의의가 있다.
본 발명의 용어, "표적 핵산"은 본 발명의 방법으로 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 표적 핵산은 시료로부터 분리할 필요가 없을 수 있으며, 시료 내에 존재하는 자체로 (a) 단계를 수행할 수 있다. 상기 (a) 단계의 표적 핵산은 DNA 추출을 추가로 필요로 하지 않는 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
또한, 상기 용어 "시료"는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 화학 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이러지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로, 전혈(whole blood), 백혈구, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells), 혈장, 혈청, 가래(sputum), 입김(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물, 대변(stool), 조직 추출물, 조직 생검, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "DNA 절단효소(Nicking enzyme)"는 DNA 염기서열의 특정 인식부위를 인식하여 절단하는 효소라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 Nicking endonuclease일 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 DNA 절단 효소가 포함되는 경우 DNA 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 프라이머를 사용하여, T7 프로모터 및 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 이중가닥 DNA가 생성된다. 상기 절단효소 인식 염기서열은 시료 내 존재하는 절단효소의 활성에 의해 이중가닥 DNA의 단일가닥이 절단된다. 상기 절단 반응에 의해 생성된 짧은 DNA 가닥은 새로운 DNA 합성을 위한 프라이머로서 사용되어, 시료 내 존재하는 DNA 중합효소의 활성에 의해 새로운 DNA 합성 반응이 진행된다. 이 반응에서 사용되는 DNA 중합효소는 DNA 합성반응 중 주형과 결합된 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지고 있다. 따라서, 상기 생성된 짧은 DNA 가닥을 프라이머로서 사용하여 새로운 DNA를 합성하게 될 경우, 주형과 결합되어있는 DNA가 떨어져 나오게 되며, 이와 같이 주형으로부터 떨어져 나온 DNA는 반응에 참여하지 않은 프라이머가 결합 가능한 주형으로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기의 절단효소 및 DNA 중합효소의 활성을 통해 핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응을 구현함으로써, T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA가 지수함수적으로 증폭되고, 이는 기존 NASBA 반응에 비해 증폭 효율을 증대시킬 수 있는 핵심적인 요인이라고 할 수 있다.
본 발명의 용어 "Direct PCR 버퍼"는 일반적으로 Direct PCR에 사용되는 버퍼를 의미한다. Direct PCR은 핵산의 추출과정 없이 시료에서 바로 PCR을 하는 기술이다. PCR을 하기 위해 반드시 거쳐야 하는 핵산 추출과정은 각 시료에 맞는 키트로 여러 단계를 거치는 동안 샘플의 오염이 발생할 수 있으며, 시료의 양이 적을 때는 손실이 많은 어려움이 있었는바, Direct PCR 버퍼를 첨가하여 핵산 추출과정을 PCR 과정에서 진행되도록 하는 것이다.
본 발명의 목적상 기존에 Direct PCR에 사용되는 버퍼인 Direct PCR 버퍼를 본 발명의 방법에 적용하여 핵산의 추출과정 없이 시료에서 바로 PCR을 할 수 있는 장점을 이용하고자 하였다. 상기 Direct PCR 버퍼는 시중에서 구입할 수 있는 것이거나 제조하여 사용하는 것이든 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 Direct PCR 버퍼의 함량은 중합 반응 용액의 총 중량을 기준으로 약 5중량% 내지 20중량%의 함량으로 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로 약 7중량% 내지 15중량%, 8중량% 내지 13중량%, 또는 9중량% 내지 12중량% 일 수 있으며, 더욱 구체적으로 9.5%중량 내지 11.5중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "약(about)"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로. ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, Direct PCR buffer의 유무에 따른 NASBA 반응에 미치는 영향을 평가한 결과, 표적 RNA (betacorona virus OC43 RNA), nicking enzyme 및 Direct PCR buffer가 모두 포함된 실험예 1에서 형광 신호가 증폭함을 확인하였으나, 표적 RNA가 없거나 Direct PCR buffer가 없는 실험예 2 및 3에서는 신호 증폭이 없거나 거의 미미함을 확인하였다(도 3).
본 발명에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계는 등온에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 40℃ 내지 42℃에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적상 RNA 분해효소 및/또는 DNA 중합효소를 추가로 사용할 수 있다.
상기 RNA 분해효소는 DNA/RNA 중합체 (hybrid)에서 RNA만을 선택적으로 분해하는 효소라면 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 RNase H 등을 사용할 수 있다. DNA 중합효소는 주형과 결합된 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지는 DNA 중합효소라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 클레노우 단편 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 핵산의 절단, Direct PCR 버퍼 및 중합연쇄반응 시스템을 기반으로 한 등온 핵산증폭 반응을 통해 RNA/DNA의 추출과정 없이 기존 NASBA 기술의 핵산증폭 반응 효율을 증대시킴으로써, 표적 핵산의 검출 민감도를 증대시키는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 Nicking enzyme 첨가에 따른 NASBA 증폭 효율을 나타낸 것이다.
도 2는 NASBA 반응에 대한 Direct PCR buffer의 농도 영향 평가를 나타낸 것이다.
도 3은 NASBA 반응에 대한 Direct PCR buffer의 유무 영향 평가를 나타낸 것이다.
도 2는 NASBA 반응에 대한 Direct PCR buffer의 농도 영향 평가를 나타낸 것이다.
도 3은 NASBA 반응에 대한 Direct PCR buffer의 유무 영향 평가를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Nicking enzyme 첨가에 따른 NASBA 증폭 효율 확인
Nicking enzyme 첨가에 따라 기존 NASBA의 증폭 효율이 증가되는지 확인하고자 하였다.
실시예 1에서 사용한 NESBA 반응 용액은 하기 표 1과 같다. 본 발명에서 사용된 모든 DNA 올리고뉴클레오티드는 Bioneer®(대전, 한국)를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 합성 및 정제되었다.
| 실험예 1 | 실험예 2 | 실험예 3 | 실험예 4 | |
| 3x NASBA buffer | 6.7 | 6.7 | 6.7 | 6.7 |
| NEB 2.1 buffer | 1 | 1 | 1 | 1 |
| rNTP (25mM each) | 2.8 | 2.8 | 2.8 | 2.8 |
| dNTP (25 mM each) | 0.56 | 0.56 | 0.56 | 0.56 |
| Primer 1 (100 uM) | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| Primer 2 (100 uM) | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| DW | 2.66 | 3.66 | 2.16 | 3.16 |
| target | 1 | 0 | 1 | 0 |
| NASBA enzyme cocktail | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Nt. AlwI | 0 | 0 | 0.5 | 0.5 |
0.2ml PCR 튜브에 상기 표 1의 조성대로 넣고, 부드럽게 섞어준 뒤, spin dowm하였다. 구체적으로, 3x NASBA buffer 6.7 μl, NEB 2.1 buffer 1 μl, rNTPs (25 mM each) 2.8 μl, dNTPs (25 mM each) 0.56 μl, 제1프라이머 (100 μM) 0.14μl, 제2프라이머 (100 μM) 0.14 μl, 증류수를 첨가하였다. 표적 RNA (betacorona virus OC43 RNA) 실험예 1 내지 4까지 각각 1μl, 0μl, 1μl 또는 0μl 을 첨가하였다.
상기 반응 용액을 65 ℃ 에서 5 분 동안 가열한 후, 상기 반응 용액에 NASBA enzyme cocktail (AMV-RT, RNase H, T7 RNA 중합효소) 5 μl를 첨가하고, Nt.AlwI (10 unit/μl)는 실험예 1 내지 4까지 각각 0μl, 0μl, 0.5μl 또는 0.5μl를 첨가하고 65 ℃ 에서 1 시간 동안 반응을 진행시킨 후, 다시 90 ℃ 에서 5분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 아가로스 겔 전기영동 반응 시켰다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 표적 RNA (betacorona virus OC43 RNA)가 포함된 실험예 1, 3이 표적 RNA가 포함되지 않은 실험예 2, 4에 비하여 밴드가 더 진함을 확인하였으며, 특히 nicking enzyme을 첨가한 실험예 3이 nicking enzyme을 첨가하지 않은 실험예 1에 비하여 밴드가 더 진하게 나타남을 확인하였다.
이를 통해, 표적 RNA가 포함되더라도 nicking enzyme이 첨가됨에 따라 기존NASBA의 증폭 효율이 증가됨을 알 수 있다.
실시예 2. NASBA 반응에 대한 Direct PCR buffer의 농도 영향 평가
Direct PCR buffer(EzWay Direct PCR Buffer (5x), KOMA BIOTECH)가 NASBA 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 NASBA 반응 mixture에 Direct PCR buffer를 혼합하여 NASBA를 진행하였다.
실시예 2에서 사용한 NESBA 반응 용액은 하기 표 2와 같다.
| 실험예 1 | 실험예 2 | 실험예 3 | 실험예 4 | 실험예 5 | |
| 3x NASBA buffer | 6.3 | 6.3 | 6.3 | 6.3 | 6.3 |
| NEB 2.1 buffer | 0.9 | 0.9 | 0.9 | 0.9 | 0.9 |
| Direct PCR buffer | 0 | 1 | 2 | 3 | 3.66 |
| rNTP (25mM each) | 2.8 | 2.8 | 2.8 | 2.8 | 2.8 |
| dNTP (25 mM each) | 0.56 | 0.56 | 0.56 | 0.56 | 0.56 |
| Primer 3 (100 uM) | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| Primer 4 (100 uM) | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| DW | 3.66 | 2.66 | 1.66 | 0.66 | 0 |
| target | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| NASBA enzyme cocktail | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Nt. AlwI | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
0.2ml PCR 튜브에 상기 표 2의 조성대로 넣고, 부드럽게 섞어준 뒤, spin dowm하였다. 구체적으로, 3x NASBA buffer 6.3 μl, NEB 2.1 buffer 0.9 μl, rNTPs (25 mM each) 2.8 μl, dNTPs (25 mM each) 0.56 μl, 제3프라이머 (100 μM) 0.14μl, 제4프라이머 (100 μM) 0.14 μl, 증류수 및 표적 RNA (betacorona virus OC43 RNA) 0μl 또는 1μl를 첨가하였다. Direct PCR buffer는 실험예 1 내지 5까지 각각 0 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 3.66 μl을 첨가하였다.
상기 반응 용액을 65 ℃ 에서 5 분 동안 가열한 후, 상기 반응 용액에 NASBA enzyme cocktail (AMV-RT, RNase H, T7 RNA 중합효소) 5 μl, 및 Nt.AlwI (10 unit/μl) 0.0μl, 또는 0.5μl를 첨가하고 65 ℃ 에서 1 시간 동안 반응을 진행시킨 후, 다시 90 ℃ 에서 5분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 아가로스 겔 전기영동 반응 시켰다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Direct PCR buffer가 첨가되더라도 NASBA 반응을 저해하지 않고, 오히려 Direct PCR buffer 2 μl 첨가된 실험예 3에서 밴드의 강도가 가장 높음을 확인함으로써, 반응 효율이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3. NASBA 반응에 대한 Direct PCR buffer의 유무 영향 평가
Direct PCR buffer의 유무에 따른 NASBA 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 NASBA 반응 mixture에 Direct PCR buffer를 혼합하여 NASBA를 진행하였다. 또한, Direct PCR buffer의 영향을 평가하기 위해, Virus 유전자가 아닌 Virus 자체를 이용하여 다양한 반응 성분 조합 하에서 NESBA 반응을 수행하고 실시간 형광을 모니터링하였다.
실시예 3에서 사용한 NESBA 반응 용액은 하기 표 3과 같다.
| 실험예 1 | 실험예 2 | 실험예 3 | |
| 3x NASBA buffer | 6.7 | 6.7 | 6.7 |
| NEB 2.1 buffer | 1 | 1 | 1 |
| Direct PCR buffer | 2 | 0 | 2 |
| rNTP (25mM each) | 2.8 | 2.8 | 2.8 |
| dNTP (25 mM each) | 0.56 | 0.56 | 0.56 |
| Primer 3 (100 uM) | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| Primer 4 (100 uM) | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| Molecular Beacon (30 uM) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| DW | 0 | 2 | 0.46 |
| target | 0.46 | 0.46 | 0 |
| NASBA enzyme cocktail | 5 | 5 | 5 |
| Nt. AlwI | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
0.2ml PCR 튜브에 상기 표 3의 조성대로 넣고, 부드럽게 섞어준 뒤, spin dowm하였다. 구체적으로, 3x NASBA buffer 6.7 μl, NEB 2.1 buffer 1 μl, rNTPs (25 mM each) 2.8 μl, dNTPs (25 mM each) 0.56 μl, 제3프라이머 (100 μM) 0.14μl, 제4프라이머 (100 μM) 0.14 μl, 및 증류수 첨가하였다. Direct PCR buffer는 실험예 1 내지 3까지 각각 2 μl, 0 μl, 2 μl를 첨가하였으며, 표적 RNA (betacorona virus OC43 RNA) 각각 0.46μl, 0.46μl, 또는 0μl을 첨가하였다.
상기 반응 용액을 65 ℃ 에서 5 분 동안 가열한 후, 상기 반응 용액에 NASBA enzyme cocktail (AMV-RT, RNase H, T7 RNA 중합효소) 5 μl, 및 Nt.AlwI (10 unit/μl) 0.0μl, 또는 0.5μl를 첨가하고 65 ℃ 에서 1 시간 동안 반응을 진행시킨 후, 다시 90 ℃ 에서 5분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 형광 신호를 모니터링 하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 표적 RNA (betacorona virus OC43 RNA), nicking enzyme 및 Direct PCR buffer가 모두 포함된 실험예 1에서 형광 신호가 증폭함을 확인하였으나, 표적 RNA가 없거나 Direct PCR buffer가 없는 실험예 2 및 3에서는 신호 증폭이 없거나 거의 미미함을 확인하였다.
이를 통해, 표적 RNA가 포함되더라도 nicking enzyme 및 Direct PCR buffer가 모두 포함되는 경우 기존 NASBA의 증폭 효율이 현저히 증가됨을 알 수 있으며, 바이러스의 유전자가 아닌 바이러스 자체를 이용하더라도 표적 핵산이 검출됨을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY
<120> Methods for detecting target nucleic acids
<130> KPA211138-KR
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 1
<400> 1
tgataagtcg gtgccctctc 20
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 2
<400> 2
taatacgact cactataggg accttcctgc cattgggtat 40
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 3
<400> 3
aaaaaaagga tcggggtgat aagtcggtgc cctctc 36
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 4
<400> 4
aaaaaaagga tcggggaatt ctaatacgac tcactatagg gaccttcctg ccattgggta 60
t 61
Claims (8)
- (a) 표적 핵산을 DNA 절단효소(Nicking enzyme) 및 Direct PCR 버퍼와 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 핵산을 NASBA를 이용하여 증폭하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 핵산은 DNA 추출을 추가로 필요로 하지 않는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 Direct PCR 버퍼는 중합 반응 용액의 총 중량을 기준으로 5 중량% 내지 20중량%의 함량으로 포함되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 절단효소는 nicking endonuclease인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계는 등온에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 등온은 40℃ 내지 42℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 표적 핵산은 분리된 시료 내에 존재하는 것으로, 상기 표적 핵산의 검출 방법은 시료 내의 표적 핵산을 검출하는 것인, 표적 핵산의 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 시료는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 화학 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 표적 핵산의 검출 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020210157725A KR20230071480A (ko) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 표적 핵산의 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020210157725A KR20230071480A (ko) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 표적 핵산의 검출 방법 |
Publications (1)
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|---|---|
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Family Applications (1)
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| KR1020210157725A KR20230071480A (ko) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 표적 핵산의 검출 방법 |
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-
2021
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