CN117248043A - 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒 - Google Patents
一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物检测技术领域，公开了一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒。所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明基于PCR技术，设计一套引物和特异性荧光标记的探针进行检测。当荧光探针与扩增产物匹配时，荧光信号即可被检测到，从而判断是否存在病原体核酸。并且本发明设计的引物和探针可以提高目前检测方法准确性、灵敏度、特异性，降低漏检率，减少检测的时间。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌(tubercle bacillus)，是引起结核病的病原体。该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核最多见。结核病是一种古老的疾病，全球广泛分布，是细菌感染性疾病致死的首位原因。
目前结核分枝杆菌鉴定检验手段很多，涂片镜检是实验室最常开展的基础方法，仍然提供着筛查作用和细菌性证据。涂片抗酸染色镜检快速简便低廉，准确性较高，在我国非典型分枝杆菌尚属少见，故抗酸杆菌阳性，肺结核诊断基本即可成立，在临床上被广泛应用的方法，但该方法的缺点是无法区分死活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(NTM)，而且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低，涂片中分枝杆菌要达到103-104CFU/mL才可检测出阳性结果，所以该方法仅能检出50％-75％的活动性结核患者，漏检率很高。
结核培养是诊断TB金标准，但同时存在检测时限较长的局限性。通过痰结核菌培养，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。结果可信度高，并能做结核菌药敏试验。它虽然是诊断肺结核的"金指标"，但阳性率低是美中不足之处。培养法虽然灵敏度增加不少，但检测周期太长(2-8周)，不但贻误治疗，也大大增加了患者传播给别人的机会。
分子生物学是WHO推荐方法之一，目前常用实时荧光定量PCR、Gene Xpert MTB/RIF、线性探针分析、恒温扩增方法、mNGS等。体外药敏是药物敏感性的金标准，结核用药、耐药筛查的重要依据。其中，实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，简称qPCR)是在常规PCR技术的基础上结合荧光发光技术的一种新的诊断方法。聚合酶链式反应(PCR)技术可将标本中微量的结核菌DNA加以扩增，但仍有假阳性的情况发生，这是由于DNA样本提取过程中遭受污染等技术原因。
因此，有必要开发一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒，并通过对核酸扩增主要原料的筛选及扩增体系性能试验，设计出一套既可准确检出又有高灵敏度的引物探针，有效解决目前结核分枝杆菌漏检、灵敏度低的问题，为临床结核分枝杆菌复合群检测提供了更加可靠的检验方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒，提高检测方法的准确性和灵敏度。
本发明的第一方面提供一种检测结核分枝杆菌复合群的引物和探针。
具体的，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述探针的5’端标记有荧光基团。
优选的，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
优选的，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3、JOE中的任意一种。
优选的，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB、Eclipse中的任意一种。
本发明的第二方面提供一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒。
具体的，包括第一方面所述的引物和探针。
优选的，所述试剂盒还包括镁离子缓冲液、UNG酶和Taq DNA聚合酶。
本发明的第三方面提供一种检测结核分枝杆菌复合群的方法。
具体的，包括以下步骤：
提取样品DNA，在PCR管中加入所述样品DNA和使用第二方面所述的试剂盒，通过PCR检测设备进行检测。
优选的，所述试剂盒中的镁离子缓冲液在扩增体系中的终浓度为4mM-8mM。
优选的，所述PCR检测设备的扩增程序为50℃2min；95℃10min；95℃15s，65℃40s，40个循环。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明基于PCR技术，设计一套引物和特异性荧光标记的探针进行检测。当荧光探针与扩增产物匹配时，荧光信号即可被检测到，从而判断是否存在病原体核酸。并且本发明设计的引物和探针可以提高目前检测方法准确性、灵敏度、特异性，降低漏检率，减少检测的时间。
附图说明
图1为不同浓度梯度的Mg离子测试结果图；
图2为不同退火延伸温度测试结果图；
图3为灵敏度实验扩增曲线图；
图4为阳性样本测试实验扩增曲线图；
图5为交叉性能实验结果图；
图6为实施例1和对比例1中引物和探针的扩增曲线图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种检测结核分枝杆菌复合群的引物和探针。
表1引物探针序列
| 引物和探针名称 | 序列(5’to3’) |
| PCR-F5(正向引物) | AACAAGAAGGCGTACTCGACCTG |
| PCR-R5(反向引物) | AGTGCATTGTCATAGGAGCTTCCG |
| Probe 5(探针) | FAM-CCGAGGCAGGCATCCAACCGT-BHQ-1 |
实施例2
一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒。
包括：实施例1中的引物和探针，还包括MgSO4、UNG酶和Taq DNA聚合酶、10×buffer、dUTP、dNTP。
所需试剂配制方法：
取超纯水121℃灭菌30min备用；
250mM MgSO4试剂的配制方法：使用灭菌超纯水按相应摩尔浓度配制(或用超纯水配制完成后灭菌)；
10×buffer I配制方法：称取2.42g Tris，3.73g KCl，1.32g(NH4)2SO4，0.24gMgSO4溶于100mL超纯水，量取1mL Tween-20加入上述溶液中，调节pH至8.8后121℃灭菌30min。
实施例3
一种检测结核分枝杆菌复合群的方法。
提取样品DNA，在PCR管中加入样品DNA和使用实施例2的试剂盒，通过PCR检测设备进行检测，扩增体系配方如表2。
表2扩增体系配方
| 试剂 | 25μL体系 |
| 10×buffer | 2.5μL |
| MgSO4(250mM) | 0.15μL |
| dUTP(10mM) | 1.5μL |
| dNTP(10mM) | 0.5μL |
| UNG酶(1U/μl) | 0.5μL |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 0.25μL |
| PCR-F5、PCR-R5混合(5μM) | 0.5μL |
| Probe 5(5μM) | 5μL |
| 样品DNA(Template) | 2μL |
| ddH2O | 补足25μL |
PCR缓冲液中重要的二价阳离子(Mg2+)对整个体系有较大影响。Mg2+作为Taq DNA聚合酶的激活剂，浓度越高，扩增酶活性越强，所以对扩增体系中的Mg2+浓度进行试验。采用控制单一变量的方法设计试验，实验结果如图1所示试剂MgSO4(250mM)加入体系配置时，Mg2 +浓度为6mM时同浓度模板Ct值最大，终浓度控制在4mM-8mM，在此范围内，相同模板条件下，Mg2+浓度越高，Ct值越低，扩增效率越高。
PCR检测设备的扩增程序为50℃2min；95℃10min；95℃15s，65℃40s，40个循环。如图2所示，(a)为60℃退火延伸，(b)为65℃退火延伸，根据实验的扩增曲线和Ct值观察，退火延伸温度为65℃时，灵敏度更高。
1.灵敏度实验和阳性样本测试
将市售H37Ra基因进行梯度稀释，用作qPCR反应的模板。使用实施例3的检测结核分枝杆菌复合群的方法进行测试。结果如图3所示，随着模板浓度的降低，可以观察到荧光信号积累的Ct值增加。稀释至千万倍时，未观察到荧光信号积累。表明该方法可检测到的最低浓度在稀释1/千万-1/百万。
使用10个阳性样本作为qPCR反应的模板，稀释至1/10，qPCR检测均为阳性(如图4所示)。
2.交叉性能实验
为完成染料法扩增体系，并与圣湘生物科技有限公司的产品结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对比，自配体系检测无假阳，其扩增曲线呈“S”型。如图5所示，对金黄色葡萄球菌和疑似污染的耻垢分枝杆菌菌检检测结果与圣湘一致，对大肠杆菌基因组的检测结果也为阴性。
对比例1
一种检测结核分枝杆菌复合群的引物和探针。
表3引物探针序列
| 引物和探针名称 | 序列(5’to 3’) |
| PCR-F4(正向引物) | GCAAAGCCCGCAGGACCAC |
| PCR-R4(反向引物) | TCTGCTACCCACAGCCGGTT |
| Probe 4(探针) | FAM-ACAGCCCGTCCCGCCGAT-BHQ-1 |
PCR-F4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；PCR-R4的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；Probe 4的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
1.扩增效率检测。
将市售H37Ra基因进行梯度稀释，用作qPCR反应的模板。使用实施例1和对比例1中检测结核分枝杆菌复合群的引物和探针进行扩增，扩增体系参照实施例3，结果如图6所示，(a)为对比例1中引物PCR-F4、PCR-R4以及探针Probe4扩增曲线，(b)为实施例1中引物PCR-F5、PCR-R5以及探针Probe5扩增曲线，使用实施例1的引物和探针进行扩增，其扩增曲线“S”较对比例1中的引物和探针更明显，扩增效率更高，对应Ct值也是实施例1更优，因此实施例1中的引物和探针扩增效率更优。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验所作的任何修改、等同替换、改进等得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测结核分枝杆菌复合群的引物和探针，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3、JOE中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的引物和探针，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB、Eclipse中的任意一种。
6.一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至5中任一项所述的引物和探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括镁离子缓冲液、UNG酶和Taq DNA聚合酶。
8.一种检测结核分枝杆菌复合群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取样品DNA，在PCR管中加入所述样品DNA和使用权利要求6至7中任一项所述的试剂盒，通过PCR检测设备进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述试剂盒中的镁离子缓冲液在扩增体系中的终浓度为4mM-8mM。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR检测设备的扩增程序为50℃2min；95℃10min；95℃15s，65℃40s，40个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311170657.8A CN117248043A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物、探针、试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
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2023
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