CN108060271A - 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法 - Google Patents

基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108060271A
CN108060271A CN201810124337.1A CN201810124337A CN108060271A CN 108060271 A CN108060271 A CN 108060271A CN 201810124337 A CN201810124337 A CN 201810124337A CN 108060271 A CN108060271 A CN 108060271A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primers
sequence
primer
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810124337.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108060271B (zh
Inventor
周红宁
周毅
姜进勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Institute Of Parasitic Diseases
Original Assignee
Yunnan Institute Of Parasitic Diseases
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Institute Of Parasitic Diseases filed Critical Yunnan Institute Of Parasitic Diseases
Priority to CN201810124337.1A priority Critical patent/CN108060271B/zh
Publication of CN108060271A publication Critical patent/CN108060271A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108060271B publication Critical patent/CN108060271B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于环介导的等温扩增(LAMP)引物和相关试剂盒以及利用该引物检测登革病毒(Denguevirus,DV)的方法。利用所述引物能够特异性的环介导等温扩增登革病毒的核酸。本发明方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单、方便快捷，可良好地应用于鉴定登革病毒，适用于临床和实验室检测。

Description

基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域，尤其是涉及基于环介导的等温扩增登革病毒检测方法及其试剂盒。
背景技术
登革热是由登革病毒(Denguevirus,DV)所致的一组虫媒性传染病,传播媒介主要是埃及伊蚊。病毒感染后可发生登革热、登革出血热、登革休克综合征。DV引起的感染广泛流行于全球热带和亚热带地区,特别是东南亚、西太平洋、中南美洲和非洲的100多个国家和地区。世界卫生组织估计,全世界25亿人受到登革热的威胁,每年约有500～1000万人感染登革热,25～50万人的登革出血热病例,2.4万人死亡,登革热已成为全球范围内严重的公共卫生问题, 此外,登革热病毒还是重要的生物战剂。登革热的临床症状与许多病毒性、细菌性和寄生虫感染疾病在临床上难以区别。
现有技术中，登革热的检测方法主要包括病毒培养分离，酶联免疫检测，荧光定量PCR检测技术。
病毒培养分离技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测“金色标准”，但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，灵敏度不足。而且操作程序复杂，对实验场地和设备有生物安全等级要求，检测过程长(至少要一周以上)，不能用于现场检测，对不同病毒的检测结果不同。
酶联免疫检测是基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗体之间的特异结合，通过偶联了显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗体检测由于没有信号放大的过程，灵敏性要比分子检测低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原漂变产生的新的病毒亚型的检测能力也值得怀疑。世界卫生组织(WHO)研究表明酶联免疫法很难区分登革病毒与寨卡病毒。
荧光定量PCR检测技术是病原的核酸分子检测通过聚合酶对病原的核酸分子进行扩增，然后利用荧光，电泳等方法对反应过程或产物进监测，根据反应是否进行或产物是否出现来判定病原是否出现。但基于PCR的方法都需要热循环仪等设备，对检测场地也有要求，定量PCR还需要专门训练，这些都限制了 PCR相关技术在快速检测中的应用。
因此，本领域迫切需要开发快速简便有效的登革病毒检测方法和试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法以及试剂盒。
本发明是通过如下技术手段来实现的：
基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，包括D1、D2、D3、D4共四套检测登革病毒不同亚型的引物集，其特征在于，所述每套引物集都采用能够特异性结合特定亚型的登革病毒基因，并用于扩增对应基因的特异性扩增产物；
其中，四套引物集分别针对不同登革亚型：
D1引物集：
D1-F3引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
D1-B3引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
D1-FIP引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
D1-BIP引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
D1-LB引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
D2引物集：
D2-F3引物：序列如SEQ ID NO:6所示；
D2-B3引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
D2-FIP引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
D2-BIP引物：序列如SEQ ID NO:9所示；
D2-LB引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
D3引物集：
D3-F3引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
D3-B3引物：序列如SEQ ID NO:12所示；
D3-FIP引物：序列如SEQ ID NO:13所示；
D3-BIP引物：序列如SEQ ID NO:14所示；
D3-LF引物：序列如SEQ ID NO:15所示；
D3-LB引物：序列如SEQ ID NO:16所示；
D4引物集：
D4-F3引物：序列如SEQ ID NO:17所示；
D4-B3引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
D4-FIP引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
D4-BIP引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
D4-LF引物：序列如SEQ ID NO:21所示；
D4-LB引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
对登革病毒的检测步骤为：
(a)利用所述的D1、D2、D3、D4引物集，对检测样品进行扩增；
(b)检测扩增情况，从而判断所述检测样品中登革病毒的存在与否；
其中，在步骤(b)中，如果有特异性扩增产物产生，判定检测样品中存在登革病毒；如果没有特异性扩增产物产生，则判定检测样品中不存在登革病毒；本检测方法是非诊断性的方法：本检测方法是采用体外检测方法；所述的检测样品为核酸提取物，较佳地为RNA提取物；
所述引物集依序排列放置于试剂盒中，并分别采用独立的容器：即第一容器、第二容器、第三容器和第四容器；
第一套引物集D1位于所述第一套容器中；
第二套引物集D2位于所述第二套容器中；
第三套引物集D3位于所述第三套容器中；
第四套引物集D4位于所述第四套容器中；
在所述的试剂盒中还包括登革病毒的检测标准品。
所述的扩增是对引物集用于登革病毒的环介导的等温扩增(LAMP)，从而获得包含扩增产物的反应混合物；所述扩增采用一种PCR扩增体系，该扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的D1、D2、D3、D4引物集；
所述的用于扩增的缓冲体系包含：缓冲液、扩增酶、dNTP、和RNA酶抑制剂，并包含用于检测的染料。
在检测登革病毒1型的扩增体系中D1-F3与D1-B3引物对、D1-FIP与D1-BIP引物对和D1-LF与D1-LB引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)： (4-6)，较佳地为1：(7-9)：(3-5)，优选为1:8:4；检测登革病毒2型的扩增体系中D2-F3与D2-B3引物对、D2-FIP与D2-BIP引物对和D2-LF与D2-LB 引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)，较佳地为1：(7-9)：(3-5)，优选为1:8:4；检测登革病毒3型的扩增体系中D3-F3与D3-B3引物对、D3-FIP 与D3-BIP引物对和D3-LF与D3-LB引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)： (4-6)，较佳地为1：(7-9)：(3-5)，优选为为1:8:4；检测登革病毒4型的扩增体系中D4-F3与D4-B3引物对、D4-FIP与D4-BIP引物对和D4-LF与D4-LB 引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)，较佳地为1：(7-9)：(3-5)，优选为1:8:4。
第一容器引物混合物中D1-F3、D1-B3的浓度为0.1-0.3μM，较佳地为0.2 μM；第二容器引物混合物中D2-F3、D2-B3的浓度为0.1-0.3μM，较佳地为0.2 μM第二容器引物混合物中D2-F3、D2-B3的浓度为0.1-0.3μM，较佳地为0.2 μM；第三容器引物混合物中D3-F3、D3-B3的浓度为0.1-0.3μM，较佳地为0.2 μM；第四容器引物混合物中D4-F3、D4-B3的浓度为0.1-0.3μM，较佳地为0.2 μM；
第一容器引物混合物中D1-FIP、D1-BIP的浓度为1.4-1.8μM，较佳地为 1.5-1.6μM；第二容器引物混合物中D2-FIP、D2-BIP的浓度为1.4-1.8μM，较佳地为1.5-1.6μM；第三容器引物混合物中D3-FIP、D3-BIP的浓度为1.4-1.8 μM，较佳地为1.5-1.6μM；第四容器引物混合物中D4-FIP、D4-BIP的浓度为 1.4-1.8μM，较佳地为1.5-1.6μM；
第一容器引物混合物中D1-LF、D1-LB的浓度为0.6-1.0μM，较佳地为 0.7-0.9μM；第二容器引物混合物中D2-LF、D2-LB的浓度为0.6-1.0μM，较佳地为0.7-0.9μM；第三容器引物混合物中D3-LF、D3-LB的浓度为0.6-1.0 μM，较佳地为0.7-0.9μM；第四容器引物混合物中D4-LF、D4-LB的浓度为 0.6-1.0μM，较佳地为0.7-0.9μM。
所述的扩增酶包括Bst2.0DNA聚合酶和热启动反转录酶。
其中，所述的缓冲液包括：Thermolpol RB(Isothermal Amplification Buffer)、硫酸镁和甜菜碱(Betaine)；所述的用于检测的染料选自绿色荧光核酸染料SYTO 9(SYTO9Green Fluorescent Nucleic Acid Stain)。
所述的环介导等温扩增的反应温度为60-65℃，较佳地为61-63℃；步骤 (a)中的环介导等温扩增包括50-70个循环，较佳地为50-60个循环；在步骤(b) 中，所述的检测通过实时定量PCR仪进行；
所述的循环包括步骤：
(i)60-65℃保温20-40秒，较佳地为30秒；
(ii)60-65℃采集荧光20-40秒，较佳地为30秒；
所述的环介导等温扩增在进行循环之前还包括60-65℃恒温反应1-3min，较佳地为1-2min的步骤。
所述的检测通过实时定量PCR仪进行，并且所述扩增体系中含有绿色荧光核酸染料SYTO 9。
在环介导等温扩增反应结束后，如果有扩增曲线，则表明扩增阳性，检测样品中存在登革病毒；如果没有扩增曲线，则表明扩增阴性，检测样品中不存在登革病毒。
以待检测样品的RNA为模板、以特异性扩增引物进行扩增对登革病毒进行鉴定，其鉴定过程为：
若发生特异性扩增，则表明检测样品中包含登革病毒；
其中，所述的特异性扩增引物包括：
D1引物集：
D1-F3引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
D1-B3引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
D1-FIP引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
D1-BIP引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
D1-LB引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
D2引物集：
D2-F3引物：序列如SEQ ID NO:6所示；
D2-B3引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
D2-FIP引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
D2-BIP引物：序列如SEQ ID NO:9所示；
D2-LB引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
D3引物集：
D3-F3引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
D3-B3引物：序列如SEQ ID NO:12所示；
D3-FIP引物：序列如SEQ ID NO:13所示；
D3-BIP引物：序列如SEQ ID NO:14所示；
D3-LF引物：序列如SEQ ID NO:15所示；
D3-LB引物：序列如SEQ ID NO:16所示；
D4引物集：
D4-F3引物：序列如SEQ ID NO:17所示；
D4-B3引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
D4-FIP引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
D4-BIP引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
D4-LF引物：序列如SEQ ID NO:21所示；
D4-LB引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
在另一优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增。
在另一优选例中，所述的环介导等温扩增条件是：
(1)62±2℃(较佳地62±1℃)恒温反应2±1min(较佳地1±1min)；
(2)①62±2℃(较佳地62±1℃)30秒，②62℃±2℃(较佳地62±1℃)30 秒采集荧光；步骤①-②重复进行60±10次(较佳地55±5次)；
所述的环介导等温扩增的体系中包括：每套引物集，环介导等温扩增反应缓冲液，Bst2.0DNA聚合酶(Bst2.0DNA polymerase，Bst2.0)，热启动反转录酶(WarmStart RTxReverse Transcriptase，WSRTx)，绿色荧光核酸染料SYTO 9(SYTO 9Green FluorescentNucleic Acid Stain)；
其中，所述的环介导等温扩增反应缓冲液包括：dNTP，Thermolpol RB(Isothermal Ampl ification Buffer)，硫酸镁；
或者，所述环介导等温扩增反应缓冲液包括：dNTP,Thermolpol RB (IsothermalAmpl ification Buffer)，硫酸镁，甜菜碱，该环介导等温扩增反应缓冲液中各试剂在反应体系的最终浓度分别为：dNTP(1.0-1.6mM)， Thermolpol RB(1X)，硫酸镁(6-10mM)，甜菜碱(0-0.8M)；
Real-time实时定量监测使用绿色荧光核酸染料SYTO 9作为染料；在环介导等温扩增反应结束后，有扩增曲线，则表明扩增阳性；没有扩增曲线，则表明扩增阴性。
本发明的有益效果是：
(1)首次揭示一种可特异性鉴定登革病毒四种亚型的引物，所述的引物特异性良好，对于登革病毒能够实现特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。
(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测登革病毒，从检测样品中快速准确地区分登革病毒，并且所需样品量少，操作简单。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Real-time实时定量检测登革1型LAMP的灵敏度。
图2显示了Real-time实时定量检测登革2型LAMP的灵敏度。
图3显示了Real-time实时定量检测登革3型LAMP的灵敏度。
图4显示了Real-time实时定量检测登革4型LAMP的灵敏度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究和试验，揭示一种登革病毒 (Denguevirus,DV)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法。经过比较筛选，找到了四套分别针对登革病毒四种亚型的特异性引物。本发明的方法可良好地应用于鉴定登革病毒成分，并且具有良好的灵敏度。
本发明人通过对每一登革病毒亚型进行大量的病毒基因组序列的分析，找到了在很多登革病毒基因组中相对保守的序列区段，基于此进行引物的筛选，针对每一种登革病毒亚型分别设计了一套可特异性鉴定登革病毒的引物，其对于登革病毒的RNA发生特异性扩增。
LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导的等温扩增)是于2000年首次报道并在其后经过不断改进形成的一种等温，连续，快速，高特异和可视化检测的核酸扩增方法。
与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场、战时野外或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP 技术以其快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、病原微生物鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)快速检测技术，针对每一种登革病毒的亚型设计三对针对目的序列的八段区域的引物，利用链置换聚合酶和扩增产物自身形成的可与引物结合的颈环结构实现目的片段的循环扩增，最终产物为一系列不同长度的目的序列的串联长链。同时反应的副产物焦磷酸根会大量积累，可以通过焦磷酸根和反应体系内的镁离子形成的白色沉淀的量来监测反应的进行程度并可用来判定结果的阳性及阴性。
因此，本发明提供四套引物，所述的引物是LAMP扩增引物，第一套引物包括：SEQID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO:5；第二套引物包括：SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；第三套引物包括：SEQ ID NO:11和 SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；第四套引物包括：SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19 和SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
利用本发明的引物，进行LAMP反应，优选地，Real-time实时定量监测可使用SYTO9作为染料，在环介导等温扩增反应结束后，有扩增曲线，则表明扩增阳性；没有扩增曲线，则表明扩增阴性。
本发明还提供了一种鉴定登革病毒的方法，所述方法包括：以检测样品的 RNA为模板，以特异性扩增登革病毒的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明检测样品中包含登革病毒。更优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定登革病毒的特异性引物，所述方法包括：以检测样品的RNA为模板，以引物对A、B、C的混合引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明检测样品中包含登革病毒。
获取检测样品的RNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的RNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。
本发明还涉及一种用于鉴定登革病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有针对登革病毒的LAMP扩增引物。
此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定登革病毒的试剂，如(但不限于)：含有登革病毒的检测标准品；用于环介导等温扩增的缓冲液；含有登革病毒的检测标准品；RNA提取试剂；Bs2.0聚合酶；WarmStart RTx反转录酶；SYTO 9染料；说明鉴定登革病毒方法的使用说明书。
此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定登革病毒的使用说明书和标准操作程序。
本发明所述的试剂盒能够实现快速检测、批量检测登革病毒的目的。
登革病毒
登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，分为4个不同但密切相关的血清(登革 -1、登革-2、登革-3和登革-4)。登革-1和登革-2于1952年被分离出来，登革-3和登革-4分离于1956年。人一旦被某血清型的登革热病毒感染后，就能对该型病毒产生终生免疫，并对其他血清型别的病毒感染有2～3个月的交叉免疫保护作用，但是感染一种血清型病毒后再感染另一血清型的登革病毒就容易出现重症登革热。
据WHO资料统计，近几十年来，登革热的发生有以下特点：①全球呈急剧上升势态，发生人数不断增加，全球有近40％人口处于登革热发生的风险区，目前已为全球主要的公共卫生问题之一。据WHO近期估计，全球登革热的病例数逐年增加，近年来每年约有5000万到1亿例。20世纪70年代，仅有9个登革热流行较重的国家，而目前登革热流行国家已经超过100个，分布在非洲、美洲、东地中海地区、东南亚和西太平洋地区等区域，美洲、东南亚和西太区是发生最严重的地区。2008年，美洲、东南亚和西太区的登革热病例超过120 万例，2010年超过230万例，2013年仅美洲就有235万例，其中有37687例为重症。②登革热的发生区域在扩大，2010年法国和克罗地亚首次报告有登革热本地病例；2012年在葡萄牙的马德拉岛暴发登革热，有2000例病例；2013年我国云南、河南省和美国佛罗里达州暴发登革热；2014年在东京代代木公园暴发登革热本地疫情，报告病例超过140例，这是日本继二战期间登革热大暴发后的首次本地暴发。
I.通用材料和方法
病毒核酸提取方法
实施例中用到的四种亚型的登革病毒RNA片段由中科院上海巴斯德研究所体外反转录合成。
LAMP反应缓冲液
取1μL 100mM MgSO4，3.5μL 10mM dNTPs，2.5μL 10×Thermolpol RB， 7μL无RNA酶的水。
其中10×Thermolpol RB是NEB公司的Bst 2.0DNA聚合酶缓冲液，由200 mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-20 组成，pH8.8(25℃)。
反应用酶
每次反应加入1μL 8U/μL的Bst2.0聚合酶，0.5μL 15U/μL的热启动反转录酶(WarmStart RTx Reverse Transcriptase)。
RT-LAMP反应
RT-LAMP反应基本体系如表1。
表1登革RT-LAMP反应基本体系
反应步骤如下：
(a)Real-time实时荧光定量检测为：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
染料为SYTO 9，采集荧光的通道设定为SYBR Green I通道。
II.实施例
实施例1
引物设计与筛选
获得GenBank所有登革病毒的全基因组序列，分亚型进行多重序列比对以及序列分析，针对不同亚型，寻找保守区域。登革病毒1型10359bp-10578bp 区段的保守性较高，适于作为引物设计区域；登革病毒2型3343bp-3553bp区段的保守性较高，适于作为引物设计区域；登革病毒3型3311bp-3509bp区段的保守性较高，适于作为引物设计区域；登革病毒4型2316bp-2565bp区段的保守性较高，适于作为引物设计区域。将上述区域从比对结果中截取出来，经重新比对后，进行引物设计。
对设计出的引物用所建立的RT-LAMP检测体系进行筛选，得到符合要求的引物，筛选得到6条引物如表2，把这6条引物按照表3所示配成A、B、C 3 种不同终浓度的引物对组合。
表2登革病毒RT-LAMP特异性引物序列
表3登革病毒12对引物组合
实施例2
RNA体外转录
体外转录的实施例中，选取四种亚型的登革病毒实验室培养毒株，用特异性引物分别对四种亚型的登革病毒核酸提取液进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，确定大小正确后对目的条带切胶回收，纯化的DNA产物就可作为体外转录的模板。
体外转录使用Promega的“RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7”试剂盒，反应过程采用试剂制造商提供的方法。体外转录RNA产物使用Nanodrop进行浓度和纯度测量，将单位换算成copies/μL(拷贝/μL)。为避免RNA反复冻融，取适量稀释至1×104copies/μL进行分装，并置-80℃保存。
实施例3
体系建立及优化
以登革1型病毒RNA片段为模板，以表1中的体系为基础体系，通过优化反应体系中Tween(0％，10％，30％)，dNTP(1.0，1.4，1.6mM)，甜菜碱(0，0. 4，0.8M)和镁离子(6，8，10mM)的最终浓度，四个因素设置三个水平记性正交试验，设计了9个条件组合如表4。Real-time荧光定量检测体系使用SYTO 9作为染料，采集荧光的通道设定为SYBR Green I。
反应方法与步骤如下：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。
表4登革病毒体系优化条件组合
对反应过程中的荧光扩增曲线变化过程进行分析，反应进行速度最快，CycleTime值(CT值)最小的条件组合作为最优组合。
实施例4
灵敏度评估
使用无RNase的H2O分别对登革病毒体外转录得到的RNA模板进行梯度稀释。检测反应步骤如下：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。
灵敏度结果如图1-4所示，出现的“对数曲线”表示不同亚型的登革病毒在该浓度下有扩增。其中：图1的扩增曲线从左至右依次为5×103copies/μL， 5×103copies/μL，5×101copies/μL；图2的扩增曲线从左至右依次为2× 103copies/μL，2×102copies/μL；图3的扩增曲线从左至右依次为2× 103copies/μL，2×102copies/μL；图4的扩增曲线从左至右依次为2× 103copies/μL，2×102copies/μL；浓度为2×101copies/μL的RNA模板和阴性对照均没有扩增曲线，由于上样量为5μL，表明本方法LAMP体系针对登革病毒1型最低可检测到2.5×102copies/reaction；登革病毒1型最低可检测到 2.5×102copies/reaction；登革病毒2型最低可检测到1× 103copies/reaction；登革病毒3型最低可检测到1×103copies/reaction；登革病毒4型最低可检测到1×103copies/reaction。
实施例5
反应过程的实时监测
分别以5μL浓度为5×103copies/μL，5×102copies/μL，5×101copies/ μL，2×101copies/μL登革病毒1型RNA和水(阴性对照)作为模板，用下述反应体系分别在PCR仪及荧光定量PCR仪上反应确定引物组的有效性；分别以 5μL浓度为2×103copies/μL，2×102copies/μL，2×101copies/μL登革病毒2型RNA和水(阴性对照)作为模板，用下述反应体系分别在PCR仪及荧光定量PCR仪上反应确定引物组的有效性；分别以5μL浓度为2×103copies/μL， 2×102copies/μL，2×101copies/μL登革病毒3型RNA和水(阴性对照)作为模板，用下述反应体系分别在PCR仪及荧光定量PCR仪上反应确定引物组的有效性；分别以5μL浓度为2×103copies/μL，2×102copies/μL，2×101copies/ μL登革病毒4型RNA和水(阴性对照)作为模板，用下述反应体系分别在PCR 仪及荧光定量PCR仪上反应确定引物组的有效性。
使用实施例3中的最佳体系，实时监测反应的检测方法如下：
荧光定量实时检测反应步骤如下：
62℃，120s，1次循环，
62℃，60s，60次循环，采集荧光
采集荧光的通道设定为SYBR Green I，使用SYTO 9染料。
目视检测结果和荧光定量实时检测结果如图1——图4所示，浓度为2×101copies/μL的RNA模板和阴性对照均没有扩增曲线，由于上样量为5μL，表明本方法：
登革病毒1型最低可检测到2.5×102copies/reaction；
登革病毒2型最低可检测到1×103copies/reaction；
登革病毒3型最低可检测到1×103copies/reaction；
登革病毒4型最低可检测到1×103copies/reaction。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> OrganizationName : 中国科学院上海巴斯德研究所
<120> Title : 基于环介导的等温扩增登革病毒检测试剂盒
<141> 2018-02-06
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
ctatgctgcc tgtgagcc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
acagcttccc ctggtgtt 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
acgcatgggg tagcagact 19
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tccccacgat ggagccacag ttttatgaag tcaggccgaa agc 43
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
gctgcaaccc atggaagctg tttttgctgc tgcgttgtgt ctt 43
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
cactgcctct ggaaaactca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gggtcctaag catttcctcc 20
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
ccagcaccca tcctcacctc ttttcagaat ggtgctgccg atc 43
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
ggtcaactcc ttggtcacag ctttttgcca ttcccaagac tcctag 46
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
ggacatgggc aggtcga 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
aacaacaacg gtgtcagg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
caagacaccc attgtgaag 19
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
cgtcttctcc catgtatcgt aggtttttga tacacgaatg gtgctg 46
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
tggcatggaa atcagaccca ttatttttgt ccacctttcc actcc 45
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
aggaagtgtg cacgagcgg 19
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
tggtaaagtc tctagcctca gcag 24
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
gggttcttag tgttgtgga 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
tcactattgc agacgctag 19
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
acccagaaac agagtgattc ctttttacaa gaaacacttc aatggc 46
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
gagtgggaaa gaatcgaaat gtggttttga aatttgtact gttctgtcca 50
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
ccaacagcta tgcacgtcac 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 22
tttttgtgat tgacaacgtg cacac 25

Claims (10)

1.基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，包括D1、D2、D3、D4共四套检测登革病毒不同亚型的引物集，其特征在于，所述每套引物集都采用能够特异性结合特定亚型的登革病毒基因，并用于扩增对应基因的特异性扩增产物；
其中，四套引物集分别针对不同登革亚型：
D1引物集：
D1-F3引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
D1-B3引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
D1-FIP引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
D1-BIP引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
D1-LB引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
D2引物集：
D2-F3引物：序列如SEQ ID NO:6所示；
D2-B3引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
D2-FIP引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
D2-BIP引物：序列如SEQ ID NO:9所示；
D2-LB引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
D3引物集：
D3-F3引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
D3-B3引物：序列如SEQ ID NO:12所示；
D3-FIP引物：序列如SEQ ID NO:13所示；
D3-BIP引物：序列如SEQ ID NO:14所示；
D3-LF引物：序列如SEQ ID NO:15所示；
D3-LB引物：序列如SEQ ID NO:16所示；
D4引物集：
D4-F3引物：序列如SEQ ID NO:17所示；
D4-B3引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
D4-FIP引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
D4-BIP引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
D4-LF引物：序列如SEQ ID NO:21所示；
D4-LB引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
对登革病毒的检测步骤为：
(a)利用所述的D1、D2、D3、D4引物集，对检测样品进行扩增；
(b)检测扩增情况，从而判断所述检测样品中登革病毒的存在与否；
其中，在步骤(b)中，如果有特异性扩增产物产生，判定检测样品中存在登革病毒；如果没有特异性扩增产物产生，则判定检测样品中不存在登革病毒；本检测方法是非诊断性的方法：本检测方法是采用体外检测方法；所述的检测样品为核酸提取物，较佳地为RNA提取物；
所述引物集依序排列放置于试剂盒中，并分别采用独立的容器：即第一容器、第二容器、第三容器和第四容器；
第一套引物集D1位于所述第一套容器中；
第二套引物集D2位于所述第二套容器中；
第三套引物集D3位于所述第三套容器中；
第四套引物集D4位于所述第四套容器中；
在所述的试剂盒中还包括登革病毒的检测标准品。
2.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，所述的扩增是对引物集用于登革病毒的环介导的等温扩增，从而获得包含扩增产物的反应混合物；所述扩增采用一种PCR扩增体系，该扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的D1、D2、D3、D4引物集。
3.根据权利要求1或2所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，所述的用于扩增的缓冲体系包含：缓冲液、扩增酶、dNTP、和RNA酶抑制剂，并包含用于检测的染料。
4.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，在检测登革病毒1型的扩增体系中D1-F3与D1-B3引物对、D1-FIP与D1-BIP引物对和D1-LF与D1-LB引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)；检测登革病毒2型的扩增体系中D2-F3与D2-B3引物对、D2-FIP与D2-BIP引物对和D2-LF与D2-LB引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)；检测登革病毒3型的扩增体系中D3-F3与D3-B3引物对、D3-FIP与D3-BIP引物对和D3-LF与D3-LB引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)；检测登革病毒4型的扩增体系中D4-F3与D4-B3引物对、D4-FIP与D4-BIP引物对和D4-LF与D4-LB引物对的摩尔量之比为(0.8-1.2)：(6-10)：(4-6)。
5.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，
第一容器引物混合物中D1-F3、D1-B3的浓度为0.1-0.3μM；第二容器引物混合物中D2-F3、D2-B3的浓度为0.1-0.3μM；第三容器引物混合物中D3-F3、D3-B3的浓度为0.1-0.3μM；第四容器引物混合物中D4-F3、D4-B3的浓度为0.1-0.3μM；
第一容器引物混合物中D1-FIP、D1-BIP的浓度为1.4-1.8μM；第二容器引物混合物中D2-FIP、D2-BIP的浓度为1.4-1.8μM；第三容器引物混合物中D3-FIP、D3-BIP的浓度为1.4-1.8μM；第四容器引物混合物中D4-FIP、D4-BIP的浓度为1.4-1.8μM；
第一容器引物混合物中D1-LF、D1-LB的浓度为0.6-1.0μM；第二容器引物混合物中D2-LF、D2-LB的浓度为0.6-1.0μM；第三容器引物混合物中D3-LF、D3-LB的浓度为0.6-1.0μM；第四容器引物混合物中D4-LF、D4-LB的浓度为0.6-1.0μM。
6.根据权利要求3所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，所述的扩增酶包括Bst2.0DNA聚合酶和热启动反转录酶；
其中，所述的缓冲液包括：Thermolpol RB、硫酸镁和甜菜碱；所述的用于检测的染料选自绿色荧光核酸染料SYTO 9。
7.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的反应温度为60-65℃；步骤(a)中的环介导等温扩增包括50-70个循环；在步骤(b)中，所述的检测通过实时定量PCR仪进行；
所述的循环包括步骤：
(i)60-65℃保温20-40秒；
(i i)60-65℃采集荧光20-40秒；
所述的环介导等温扩增在进行循环之前还包括60-65℃恒温反应1-3min。
8.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，所述的检测通过实时定量PCR仪进行，并且所述扩增体系中含有绿色荧光核酸染料SYTO 9。
9.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，在环介导等温扩增反应结束后，如果有扩增曲线，则表明扩增阳性，检测样品中存在登革病毒；如果没有扩增曲线，则表明扩增阴性，检测样品中不存在登革病毒。
10.根据权利要求1所述的基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法，其特征在于，以待检测样品的RNA为模板、以特异性扩增引物进行扩增对登革病毒进行鉴定，其鉴定过程为：
若发生特异性扩增，则表明检测样品中包含登革病毒；
其中，所述的特异性扩增引物包括：
D1引物集：
D1-F3引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
D1-B3引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
D1-FIP引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
D1-BIP引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
D1-LB引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
D2引物集：
D2-F3引物：序列如SEQ ID NO:6所示；
D2-B3引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
D2-FIP引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
D2-BIP引物：序列如SEQ ID NO:9所示；
D2-LB引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
D3引物集：
D3-F3引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
D3-B3引物：序列如SEQ ID NO:12所示；
D3-FIP引物：序列如SEQ ID NO:13所示；
D3-BIP引物：序列如SEQ ID NO:14所示；
D3-LF引物：序列如SEQ ID NO:15所示；
D3-LB引物：序列如SEQ ID NO:16所示；
D4引物集：
D4-F3引物：序列如SEQ ID NO:17所示；
D4-B3引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
D4-FIP引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
D4-BIP引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
D4-LF引物：序列如SEQ ID NO:21所示；
D4-LB引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
所述的扩增是环介导等温扩增；
所述的环介导等温扩增条件是：
(1)62±2℃恒温反应2±1min；
(2)①62±2℃30秒，②62℃±2℃30秒采集荧光；步骤①-②重复进行60±10次；
所述的环介导等温扩增的体系中包括：每套引物集，环介导等温扩增反应缓冲液，Bst2.0DNA聚合酶，热启动反转录酶，绿色荧光核酸染料SYTO 9；
其中，所述的环介导等温扩增反应缓冲液包括：dNTP，Thermolpol RB，硫酸镁；
或者，所述环介导等温扩增反应缓冲液包括：dNTP,Thermolpol RB，硫酸镁，甜菜碱，该环介导等温扩增反应缓冲液中各试剂在反应体系的最终浓度分别为，dNTP：1.0-1.6mM，Thermolpol RB：1X，硫酸镁：6-10mM，甜菜碱：0-0.8M；
Real-time实时定量监测使用绿色荧光核酸染料SYTO 9作为染料；在环介导等温扩增反应结束后，有扩增曲线，则表明扩增阳性；没有扩增曲线，则表明扩增阴性。
CN201810124337.1A 2018-02-07 2018-02-07 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法 Active CN108060271B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810124337.1A CN108060271B (zh) 2018-02-07 2018-02-07 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810124337.1A CN108060271B (zh) 2018-02-07 2018-02-07 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108060271A true CN108060271A (zh) 2018-05-22
CN108060271B CN108060271B (zh) 2021-09-21

Family

ID=62134659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810124337.1A Active CN108060271B (zh) 2018-02-07 2018-02-07 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108060271B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063762A (zh) * 2020-10-18 2020-12-11 宁波市疾病预防控制中心 一种登革病毒快速检测方法
WO2024023510A1 (en) * 2022-07-26 2024-02-01 Mast Group Limited Method and kit for detecting single nucleotide polymorphisms (snp) by loop-mediated isothermal amplification (lamp)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. NEERAJA等: ""Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by NS1 specific reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay in patients presenting to a tertiary care hospital in Hyderabad, India"", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
MANMOHAN PARIDA等: "（"Rapid Detection and Differentiation of Dengue Virus Serotypes by a Real-Time Reverse Transcription–Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay"", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
王佃鹏等: ""登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究"", 《热带医学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063762A (zh) * 2020-10-18 2020-12-11 宁波市疾病预防控制中心 一种登革病毒快速检测方法
WO2024023510A1 (en) * 2022-07-26 2024-02-01 Mast Group Limited Method and kit for detecting single nucleotide polymorphisms (snp) by loop-mediated isothermal amplification (lamp)

Also Published As

Publication number Publication date
CN108060271B (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112831598B (zh) 用于非洲猪瘟病毒鉴别检验的实时荧光pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒
CN103074449A (zh) 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN116024208B (zh) 一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒
CN113025726A (zh) Lfd-rpa可视化快速检测日本血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法
CN113604612A (zh) 阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
CN108060271A (zh) 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法
CN114540526A (zh) 对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法
CN103074428B (zh) 一种结核分枝杆菌tb检测试剂盒
CN110157837B (zh) 一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法
CN109777861A (zh) 错配耐受的环介导等温扩增方法及应用
CN101724714A (zh) 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN108707697A (zh) 塞尼卡谷病毒的lamp检测引物对及检测方法
CN110804677A (zh) 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒
Chukwudi et al. Comparison of colorimetric loop-mediated isothermal amplification kit and reverse transcription-polymerase chain reaction in the diagnosis of peste des petits ruminants in sheep and goats in Southeast Nigeria
CN107236827B (zh) 猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法
CN107400734B (zh) 基于环介导的等温扩增寨卡病毒检测试剂盒
CN106521038B (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN112048573B (zh) 用于检测棉花曲叶病毒的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
CN105219879B (zh) 用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN114410835A (zh) 一种用于快速检测新型冠状病毒的rpa-lfd试剂盒
CN116622872B (zh) 一种鸡沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法
CN105648111B (zh) 诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
Zou et al. Development and evaluation of an isothermal recombinase polymerase amplification–lateral flow assay for rapid detection of strawberry vein banding virus in the field
CN116814848B (zh) 基于荧光raa检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant