CN101705293A - 大豆疫霉pcr检测特异引物对 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了两对用于检测大豆病菌的PCR扩增用核酸引物，本发明的根据扩增产物是否产生特异条带(引物对A产生单一谱带大小为250bp，引物对B产生单一谱带大小为760bp)，即可判断样品中是否含有大豆疫霉，本发明的特异引物对具有特异性强、灵敏度高，检测过程操作简便，可以满足植物保护部门、检验检疫机构对大豆疫霉检测的需要。

Description

大豆疫霉PCR检测特异引物对
技术领域
本发明涉植物保护领域，提供了利用PCR扩增技术对大豆疫霉的检测，适用于植物保护、口岸检验检疫机构应用。
背景技术
由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann)侵染大豆引起的大豆疫霉病(Soybean Phytophthora Root Rot)是大豆生产上的毁灭性病害之一。在美国、加拿大、巴西、阿根廷、日本、澳大利亚、英国、匈牙利、尼日利亚、印度、埃及、以色列、南非、德国、瑞士、新西兰等国家相继报道了该病害的发生。目前大豆疫霉病在我国的局部地区也有发生，在黑龙江省部分地区大豆疫霉病的发生报道，在北京，山东，安徽，蒙城，内蒙古也随后相继分离到了病原菌。近年来，随着大豆种植面积的不断扩大和引种，大豆疫霉病在我国的发生也日趋严重，而且发病面积有加大的趋势。大豆疫霉病已经成为我国大豆生产上主要的威胁之一。1986年大豆疫霉被我国确定为I类进境植物检疫对象，目前全世界每年因为大豆疫霉病造成的经济损失大约为10亿美元。
PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、无放射性污染、易推广等等突出特点，在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术，在检验检疫领域也获得了广泛应用，建立了多种检疫性有害生物的PCR检测方法，如柑桔黄龙病菌、柑桔溃疡病菌、梨火疫病菌、小麦印度腥黑穗病菌、大豆疫霉、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等等。
目前大豆疫霉的分子检测方面，南京农业大学注册了“大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法(专利号：03131531.3)”、东北农业大学注册了“大豆疫霉菌的检测方法及专用引物(专利：200610089105.4)”、福建省农业科学院植物保护研究所注册了“一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒”等等三个专利，以上这些专利都是以核糖体转录间隔区(ITS)序列差异设计，本发明设计的A引物为基于微观蛋白基因(β-tublin)序列差异设计的引物，本专利的发明的引物序列与前几个专利的引物序列都不相同。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供用于检测大豆疫霉的PCR特异引物。
本发明用于检测大豆疫霉的PCR引物序列为：
上游引物(F)：5’-GGTAACAACTGGGCCAAG-3’
下游引物(R)：5’-CAAGAAAGCCTTACGACG-3’
用引物对待测样品进行DNA扩增，如果结果产生一条250bp大小的特异谱带，则该样品含有大豆疫霉，如果结果没有出现单一特异大小谱带，则样品中不含有大豆疫霉。
附图说明
图1.大豆疫霉特异引物检测结果
泳道为苜蓿疫霉根腐病菌，均能扩增出梯状DNA条带，泳道为对照，而未出现条带。
具体实施方式
引物设计：
根据大豆疫霉特异β-tublin序列，用Oligo 6.0软件设计大豆疫霉的特异引物对。
001    AACTTCGTGT TCGGCCAGAC GGGCGCCGGT AACAACTGGG CCAAGGGACA CTACACGGAG
061    GGTGCCGAGC TTATCGACTC GGTTCTCGAC GTCGTCCGCA AGGAGGCTGA GAGCTGTGAC
                上游引物(F)
121    TGCCTTCAGG GTTTCCAGAT CACGCACTCG CTGGGTGGCG GTACCGGTTC CGGTATGGGT
181    ACGCTTCTTA TCTCCAAGAT TCGTGAGGAG TACCCGGACC GTATCATGTG CACGTACTCG
241    GTCTGCCCGT CGCCTAAGGT GTCGGACACG GTCGTCGAGC CCTACAACGC TACGCTGTCC
301    GTCCACCAGC TCGTTGAGAA CGCCGATGAG GTCATGTGCC TGGATAACGA GGCCCTGTAC
            下游引物(R)
361    GACATTTGCT TCC
试剂和设备
扩增仪器为Biometra，引物由上海英俊生物技术有限公司合成，DNA聚合酶、DNTPs购自大连宝生物公司。
标本来源
本发明说采用的苜蓿疫霉根腐病菌3个株系、大豆疫霉、马铃薯绯腐疫霉等购自ATCC，恶疫霉、烟草疫霉、苎麻疫霉见下表：
Figure G2009102289621D0000021
Figure G2009102289621D0000031
实施例1、大豆疫霉特异引物检测方法
DNA提取：50mg左右菌丝，用Qiagen Dneasy Plant Mini Kit试剂盒提取DNA。
反应体系：每反应的混合液总体积为25μl
10*PCR Buffer    2.5μl
2.5mM DNTPmix      1μl
5μM上游引物F      1μl
5μM下游引物R      1μl
5U/μl聚合酶    0.25μl
DD H2O         18.25μl
模板DNA            1μl
                               
                  25μl
反应程序：94℃预变性3min，然后进入循环：95℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s；共35个循环。最后72℃延伸5min。
结果：从图一结果可以看出，2、3、4号样品为大豆疫霉，均出现250bp大小特异性单一条带，5号样品为恶疫霉、6号样品为苎麻疫霉、7-9号样品为烟草疫霉、10品为马铃薯疫霉、11-13品为辣椒疫霉，14样品为甜瓜疫霉，1号样品为DD水，结果表明，本发明中的大豆疫霉特异引物只能从大豆疫霉样品中扩增出250bp的特异单一条带，对其它同属其它真菌如恶疫霉、苎麻疫霉、马铃薯绯腐疫霉、辣椒疫霉、马铃薯晚疫霉、烟草疫霉等等要么没有条带出现，要么出现非预期大小的非特异条带出现。
序列表
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GGTAACAACTGGGCCAAG 18
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CAAGAAAGCCTTACGACG 18

Claims (1)

1.一种用于大豆疫霉检测的PCR引物对，其特征在于，序列为：
上游引物(F)：5′-GGTAACAACTGGGCCAAG-3’
下游引物(R)：5’-CAAGAAAGCCTTACGACG-3’
用引物对待测样品进行DNA扩增，如果结果产生一条特异谱带(产生谱带大小为250bp)，则该样品含有大豆疫霉，如果结果没有出现单一特异大小谱带，则样品中不含有大豆疫霉。
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