CN117187439A - 一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，试剂盒及检测方法，属于植物病毒检测领域。本发明提供了三对能够特异性扩增重楼芜菁花叶病毒的检测引物对，同时利用这些引物对制备得到了一种检测试剂盒，可以快速准确的检测重楼是否感染了TuMV病毒；此外开发了一种与检测试剂盒相配的检测方法，该方法可以通过PCR凝胶电泳结果判断出重楼的病毒感染情况，具有快速、准确的优点。本发明得到的检测引物、检测试剂盒以及检测方法不仅可以对单一的重楼植株样本进行检测，还可以进行多样品的混检，有利于及早发现重楼植株感染TuMV的病情，为后续的及时防治争取宝贵时间，避免了TuMV病害的大规模爆发带来的经济损失。
Description
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒及检测方法。
背景技术
芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，是马铃薯Y病毒科危害范围最广、危害程度最大的病毒，它能够侵染43个科156个属318种植物，是严重危害蔬菜作物的第2大植物病毒。课题组通过对重楼感病植株进行转录组、病毒组大数据分析以及病毒全基因组序列的分离鉴定，首次明确了TuMV是感染重楼植株、并引起严重病害的罪魁祸首之一。在重楼感染TuMV初期，植株病症极不明显，使其难以被及时发现，进而错过了最佳防治时期；而随着病症程度的逐渐加深，叶片会逐渐呈现不均匀褪绿、花叶，并引起植株生长缓慢，品质衰退，抗病和抗性能力大幅减弱，最终导致整个植株枯死。而且在自然条件下，由于感病植株往往还会作为病源，继续通过病叶与健康叶之间的机械摩擦、蚜虫和蓟马等其它害虫的咬食携带进一步传播感染周围的健康植株，从而爆发大面积的病毒感染，目前已成为重楼规模化种植的严重威胁。另外，由于重楼种子自然萌发率低、成苗率低等原因，种植户普遍以根茎切断无性繁殖的方式进行种植，也进一步增加了病毒传播和感染的风险。因此如何实现重楼TuMV病情的早发现、早防治，已成为了控制其危害，保障重楼品质与产量和种植户经济效益的主要问题之一。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒和检测方法，以实现对重楼TuMV感病植株的及早发现，并为后续重楼TuMV病毒的早期防治奠定基础。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，包含以下三对引物：
TuMV-P5-F，序列为SEQ ID NO：14，TuMV-P5-R，序列为SEQ ID NO：15；
TuMV-P6-F，序列为SEQ ID NO：17，TuMV-P6-R，序列为SEQ ID NO：18；
TuMV-P7-F，序列为SEQ ID NO：20，TuMV-P7-R，序列为SEQ ID NO：21。
优选的，三对引物根据重楼芜菁花叶病毒全基因组序列设计。
本发明还提供了一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其含有上述三对检测引物任一对。
优选的，检测试剂盒还包含2×Taq PCR StarMix，阳性对照，阴性对照。
进一步优选的，阳性对照为重楼芜菁花叶病毒的cDNA模板序列，阴性对照为不含cDNA的PCR扩增体系。
本发明还提供一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)样品及模板的获得：利用RNA提取试剂盒提取待测样品的RNA，然后逆转录得到cDNA；
(2)PCR扩增：利用上述检测引物或上述检测试剂盒进行PCR扩增，PCR扩增程序为94-96℃2-5min；94-96℃10-20s，55-57℃10-20s，71-73℃20-40s，35个循环；71-73℃4-6min，4℃保存；
(3)结果判读：将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，成像后判读结果，出现明亮清晰的相应大小的特异性条带时表明重楼样品感染了芜菁花叶病毒；没有出现特异性条带是表明重楼样品未感染芜菁花叶病毒。
优选的，步骤(1)中的待测样品为单株重楼植株或多株重楼植株。
优选的，步骤(1)中的逆转录所用的引物为通用引物、随机引物或芜菁花叶病毒逆转录特异性引物中任一种。
优选的，芜菁花叶病毒逆转录特异性引物为TuMV-GSP-adaptor，序列为SEQ IDNO：1。
本发明的有益效果在于：根据重楼芜菁花叶病毒的基因组序列设计得到了一个可特异性的将TuMV逆转录合成cDNA的逆转录引物TuMV-GSP-adaptor，该引物可以增加TuMV逆转录产物的产量，增强了后续实验的灵敏性，降低了非特异性扩增的风险。还根据重楼芜菁花叶病毒的基因组序列设计得到了三对可特异性扩增TuMV片段的PCR引物对：TuMV-P5-F和TuMV-P5-R，TuMV-P6-F和TuMV-P6-R以及TuMV-P7-F和TuMV-P7-R；利用这三对引物可以简单快速且准确的鉴定重楼植株是否感染了芜菁花叶病毒，实现对重楼芜菁花叶病毒的早期发现与及时防治，降低该病毒对重楼的危害，避免造成大规模的减产。此外通过设计筛选得到的TuMV检测引物，制备了一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，该试剂盒不仅可以对单个重楼植株样本进行检测，还可以对多个重楼植株的混合样本进行检测，加快了检测速度，降低了检测成本。
附图说明
图1为实施例1中的重楼TuMV感病植株照片；图中的a为感病初期的重楼植株，b为感病中期的重楼植株，c为大规模处于感病后期的重楼植株。
图2为实施例3中重楼TuMV基因组结构组成模式图，图中从5’UTR端到3’UTR端依次是：P1蛋白、HC-Pro蛋白、P3蛋白、6K1蛋白、CI蛋白、6K2蛋白、Vpg、Nia-Pro、Nib蛋白以及CP蛋白(外壳蛋白)。
图3为实施例3中根据全基因组序列所设计扩增条带序列位点图。
图4为实施例3中重楼TuMV病毒感染检测引物筛选琼脂糖凝胶电泳在化学发光凝胶成像系统下的条带照片。
图5为实施例4中三种引物验证琼脂糖凝胶电泳在化学发光凝胶成像系统下的条带照片。
图6为实施例5中三对引物对不同重楼样品以及重楼混合样品的检测凝胶电泳图。
图中M为DL2000 Plus DNA Marker I DNA Ladder，PC为阳性对照，NC为阴性对照，样品P5、P6、P7为3对优选特异性PCR扩增的引物。
具体实施方式
EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(RN09)购买自北京艾德莱生物科技有限公司；M-MLV逆转录试剂盒、RNase inhibitor、2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、2×Taq PCRStarMix均购买自Takara公司；
下述实施例中所用的引物皆由武汉华大基因公司合成，未具体说明的仪器和试剂均可以通过市购获得。
实施例1RNA提取
利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(RN09)提取重楼的RNA，具体步骤如下：
(1)随机称取100mg的处于感病时期重楼新鲜叶片(图1)，加入液氮充分研磨至细粉末状，转入装有500μL RLT裂解液和50μL PLANTaid的RNase-free离心管中，涡旋振荡30s；
(2)13000rpm离心10min后取400μL的上清液至新的RNase-free离心管中，加入200μL的无水乙醇，混匀；
(3)将混合物转入吸附柱RA中，13000rpm离心2min，弃掉收集管中废液；
(4)加入500μL去蛋白液RW1，室温放置1min，13000rmp离心30s，弃掉收集管中废液；
(5)加入700μL漂洗液RW，13000rmp离心30s，弃掉收集管中废液；重复漂洗一遍；
(6)将吸附柱RA放回收集管中，13000rmp离心2min；取出吸附柱RA，放入一个新的RNase-free离心管中；
(7)向吸附膜上加入50μL RNase-free water，室温放置1min，13000rmp离心1min；收集RNA样本备用。
实施例2逆转录
利用不同的引物对实施例1获得的RNA进行逆转录，具体步骤如下：
(1)取实施例1中得到的RNA样本21μL，再加入2.5μL 10×DNase I buffer、0.5μLRNase inhibitor(40U/μL)、1μL DNase I(5U/μL)，37℃孵育30min，65℃变性10min，冰上放置2min。然后取3μL作为逆转录模板，加入1μL逆转录引物、10μL RNase-free water；
(2)70℃变性10min，冰上放置2min；
(3)再加入4μL 5×M-MLV buffer、1μL dNTP Mix(10mM)、0.5μL RNase inhibitor(40U/μL)、0.5μL M-MLV(200U/μL)42℃反应75min，75℃反应10min，获得重楼cDNA样品。
(4)逆转录引物分别为通用引物Oligo-dT，特异性引物TuMV-GSP-adaptor，序列为SEQ ID NO：1或随机引物，其中Oligo-dT和随机引物均购买自武汉华大基因科技有限公司，特异性引物TuMV-GSP-adaptor是根据目的RNA的已知序列进行特殊设计并由华大基因科技有限公司进行合成的。
在反转录过程中，由于随机引物会从RNA的多个位点(包括核糖体RNA)开始转录，在扩增过程中特异性偏低，会导致无法检测出是否感染；Oligo-dT引物同大多数真核细胞mRNA3’端的poly(A)尾杂交，相较于使用随机引物特异性会变高。但是Oligo-dT引物对RNA样品的质量要求较高，一旦RNA质量不高，容易出现杂带，同时也会降低逆转录效率；而基因特异性引物与模板序列互补，转录效率高且特异性强，因此为反转录中的最佳引物(BorsonND,Salo WL,Drewes LR.A lock-docking oligo(dT)primer for 5'and 3'RACE PCR.PCRMethods Appl.1992Nov；2(2):144-8)。本发明根据重楼TuMV序列所设计的特异性逆转录引物TuMV-GSP-adaptor可以实现仅特异性地将TuMV序列逆转录合成为cDNA，增加了TuMV逆转录产物的产量，同时也进一步增强了后续PCR扩增反应的灵敏性、降低了非特异性扩增的风险。
实施例3特异性引物的设计与筛选
(1)根据重楼芜菁花叶病毒(TuMV)的基因组结构组成模式(图2)及其全基因组序列(Genbank登录号：OP348875)设计PCR特异性引物，引物序列见表1，引物位置同图3。其中引物设计直接将重楼芜菁花叶病毒(TuMV)全基因组序列提交至DNAMAN软件上，选择其高度保守区进行设计。
表1重楼芜菁花叶病毒的PCR引物
(2)对表1中的8对特异性引物利用PCR反应进行鉴定筛选，PCR扩增程序为94-96℃2-5min；94-96℃10-20s，55-57℃10-20s，71-73℃20-40s，35个循环；71-73℃4-6min，4℃保存；
结果如图4所示：阴性对照(NC)没有扩增出条带，片段P8的特异性引物TuMV-P8靠近PolyA尾巴，在扩增过程中出现非特异性扩增，不利于芜菁花叶病毒检测结果的判断。由于RNA提取步骤中会有少量DNA残留，因此片段P1、P2、P3、P4所设引物特异性不高，无法扩增出相应条带，因此无法检测出芜菁花叶病毒感染结果。而片段P5、P6、P7的扩增引物特异性较高，能够准备的扩增出目的片段，精准判断重楼是否感染芜菁花叶病毒。
实施例4检测引物的验证
(1)以实施例2得到的重楼cDNA为模板，将实施例3筛选得到的片段P5、P6、P7的3对引物进行PCR验证，反应体系见表2，反应程序见表3：
表2PCR反应体系
| 组分 | 用量 |
| 2×Taq PCR StarMix | 12.5μL |
| TuMV-P-F(10μM) | 1μL |
| TuMV-P-R(10μM) | 1μL |
| cDNA模板 | 1.5μL |
| ddH2O | 补充至25μL |
表3 PCR反应程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 98℃ | 3min | 1 |
| 98℃ | 15s | 35 |
| 56℃ | 15s | 35 |
| 72℃ | 30s | 35 |
| 72℃ | 5min | 1 |
(2)制备1.5％的琼脂糖凝胶，然后取15μL步骤(1)扩增得到的PCR产物进行电泳检测，同时点样Marker I DNA Ladder用于指示扩增片段的大小，在150V下电泳15min后用凝胶成像系统成像。结果如图5所示，三对引物均可以成功扩增出重楼芜菁花叶病毒。
实施例5混合样品的检测
随机选取5株重楼植株叶片，分别标记为样品1至样品5，其中样品1、样品3和样品4为感染了芜菁花叶病毒的重楼植株。对上述5个重楼植物叶片进行RNA提取，然后逆转录得到cDNA模板，然后分别取1μL5个样品的cDNA进行混合，得到混合样品，然后分别利用TuMV-P5-F和TuMV-P5-R，TuMV-P6-F和TuMV-P6-R以及TuMV-P7-F和TuMV-P7-R引物对进行鉴定。
结果如图6所示，阴性对照(NC)均没有扩增出条带，与阳性对照(PC)相比，在5个样品中三对引物在样品1、样品2和样品4中均扩增得到了相应大小的电泳条带，在样品3和样品5中并没有扩增得到电泳条带，与样品设置结果一致，而在混合样品中，3对引物均扩增得到的相应大小的电泳条带，表明TuMV病毒菌液。电泳结果说明TuMV-P5-F和TuMV-P5-R，TuMV-P6-F和TuMV-P6-R以及TuMV-P7-F和TuMV-P7-R三对引物可以检测混合重楼样品是否感染了芜菁花叶病毒；其中阳性对照为从已严重感染芜菁花叶病毒的重楼病株从分离得到的TuMV病毒菌液。
实施例6试剂盒的制备
将PCR反应混合物2×Taq PCR StarMix 1mL，引物对TuMV-P5-F和TuMV-P5-R，TuMV-P6-F和TuMV-P6-R以及TuMV-P7-F和TuMV-P7-R各10μM，ddH2O(阴性对照)1mL、感染了芜菁花叶病毒的重楼cDNA(阳性对照)20μL共同包装，再配以产品使用说明书，得到重楼芜菁花叶病毒检测试剂盒。
上述实施例仅为本发明的部分优选实施例，并非全部实施例，并不能理解为本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求书记载的内容为准。应当指出的是，在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，其特征在于：包含以下三对引物：
TuMV-P5-F，序列为SEQ ID NO：14，
TuMV-P5-R，序列为SEQ ID NO：15；
TuMV-P6-F，序列为SEQ ID NO：17，
TuMV-P6-R，序列为SEQ ID NO：18；
TuMV-P7-F，序列为SEQ ID NO：20，
TuMV-P7-R，序列为SEQ ID NO：21。
2.根据权利要求1所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，其特征在于：所述三对引物根据重楼芜菁花叶病毒全基因组序列设计。
3.一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1或2所述的检测引物任意一对。
4.根据权利要求3所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包含2×Taq PCR StarMix，阳性对照，阴性对照。
5.根据权利要求4所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为重楼芜菁花叶病毒的cDNA模板序列，阴性对照为不含cDNA的PCR扩增体系。
6.一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）样品及模板的获得：提取待测样品的RNA，逆转录得到cDNA；
（2）PCR扩增：利用权利要求1或2所述的检测引物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒进行PCR扩增；
（3）结果判读：将扩增产物进行凝胶电泳并成，电泳图中出现明亮清晰的相应大小的特异性条带时表明待测样品感染了芜菁花叶病毒；没有出现特异性条带是表明待测样品未感染芜菁花叶病毒。
7.根据权利要求6所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的待测样品为单株重楼植株或多株重楼植株。
8.根据权利要求6所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的逆转录的引物为通用引物、随机引物或芜菁花叶病毒逆转录特异性引物中任一种。
9.根据权利要求8所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：所述芜菁花叶病毒逆转录特异性引物为TuMV-GSP-adaptor，序列为SEQ ID NO：1。
10.根据权利要求6所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的PCR扩增程序为94-96℃ 2-5min；94-96℃ 10-20s，55-57℃ 10-20s，71-73℃ 20-40s，35个循环；71-73℃ 4-6min，4℃保存。
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