CN113667772A - 一种用于鉴定病毒TuMV的引物组合及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定病毒TuMV的引物组合及鉴定方法，本发明的引物组合包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明以西红花、山药的病株和组培材料作为检测样品，用BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA，针对病毒基因序列进行新引物的设计，改进PCR程序和检测方法，优化后的引物和方法检测效果灵敏度高且电泳条带清晰易辨认。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及一种用于鉴定病毒TuMV的引物组合及鉴定方法。
背景技术
TuMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，是仅有侵染芸薹属植物的Potyvirus属病毒。与该属其他病毒相比，TuMV具有广泛的寄主范围。在人工接种条件下，TuMV至少侵染43个双子叶植物的156个属的318种植物，除十字花科外，还包括菊科、茄科、藜科、苋科，豆科和石竹科，而且也侵染单子叶植物。在自然条件下，主要危害油菜和其它十字花科蔬菜，但新报道的寄主植物呈不断增加的趋势。
TuMV在不同寄主植物上产生花叶、坏死和矮化等类型症状。在不同类型油菜上的症状差异很大。甘蓝型油菜苗期主要症状有枯斑和花叶；成株期茎秆上表现条斑、轮纹斑和点状枯斑，叶片叶脉网状褐色坏死，病株一般矮化畸形，茎短缩，角果短小扭曲，严重的全株坏死。白菜和芥菜型油菜苗期主要症状为花叶和皱缩；后期植株矮化，叶片花叶、皱缩，茎秆有黑褐色条斑。
西红花在田间种植2～3年后均严重退化，叶片出现黄色条斑，整株矮化、黄化，顶端枯死，提前倒苗，球茎畸小，柱头产量大大降低。经田间调查和病毒学鉴定，导致中国西红花花品质衰退、产量递减的植物病源是TuMV，这种病毒对西红花的危害巨大，发生面积大，田间发病率为70％～97％。而通过组培快繁无毒种苗是解决西红花资源短缺的有效途径。
通过组培快繁脱毒种苗是解决很多品种植物资源短缺的有效途径。将外植体消毒处理后的组织培养材料进行脱毒处理后，采用RT-PCR技术，对西红花、山药等品种的不同阶段的材料进行了TuMV病毒检测，检验是否达到脱毒效果。参考相关文献采用的TuMV病毒检测方法，发现西红花的病株未能检测到TuMV病毒。说明现有的TuMV病毒检测方法需要进一步的优化改进，才能达到检验目的。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于鉴定病毒TuMV的引物组合及鉴定方法，本发明以西红花、山药的病株和组培材料作为检测样品，用BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA，针对病毒基因序列进行新引物的设计，改进PCR程序和检测方法，优化后的引物和方法检测效果灵敏度高且电泳条带清晰易辨认。
本发明采取的具体技术方案是：
一种用于鉴定病毒TuMV的引物组合，包括上游引物和下游引物，
上游引物序列为：5’ACACACGTTCAACGCGAAAG3’，如SEQ ID NO:1所示；
下游引物序列为：5’CCCTGAACGCCCAGTAAGTT3’，如SEQ ID NO:2所示。
本发明又提供了一种包含上述引物组合的试剂盒。
相应地，本发明还提供了一种鉴定病毒TuMV的方法，包括如下步骤：
(1)提取样本基因组RNA；
(2)以样本基因组RNA为模板，去除基因组DNA后，进行反转录(RT)合成cDNA；
(3)以反转录合成的cDNA为模板，以权利要求1所述引物组合进行PCR扩增；
(4)PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测。
优选地，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min，结束后4℃保存。
优选地，所述PCR扩增反应体系为：12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μL dH2O。
优选地，所述反转录反应以pimer mix为引物。
优选地，所述反转录反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μL RT burffer、4.0μL RNase water。
优选地，所述反转录反应程序为：混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
本发明的有益效果是：本发明针对TuMV病毒，通过改进RT-PCR程序、设计新引物，高效、灵敏地检测出TuMV病毒，以期为西红花、山药等的病毒防治和脱毒种苗制备提供科学依据，为抗病毒的品种的选育和组培快繁提供无毒种质资源。
附图说明
图1显示为实施案例1中西红花户外种植的病植株样品生长图；
图2显示为实施案例1中西红花不同病株样品PCR扩增片段电泳图；
图3显示为实施案例2中西红花户外种植的病植株样品生长图；
图4显示为实施案例2中西红花不同病株样品PCR扩增片段电泳图；
图5显示为实施案例3中西红花户外种植的病植株样品生长图；
图6显示为实施案例3中西红花不同病株样品PCR扩增片段电泳图；
图7显示为实施案例4中体细胞胚35℃、23℃培养30d的西红花愈伤样品生长图；
图8显示为图7的西红花愈伤样品脱毒检测采样图；
图9显示为实施案例4中西红花户外种植的病植株样品生长图；
图10显示为实施案例4中西红花不同病株样品PCR扩增片段电泳图；
图11显示为实施案例5中体细胞胚18℃培养30d的西红花愈伤样品生长图；
图12显示为实施案例5不同西红花愈伤样品PCR扩增片段电泳图；
图13显示为实施案例6中山药样品生长图；
图14显示为实施案例6山药样品PCR扩增片段电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施案例1
1.西红花检测材料选取
以西红花户外种植的病植株取样，样品1-10，见图1。
2.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
(1)BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA。
(2)取0.2g西红花材料，切成小块，加入液氮研磨成粉末后提取总RNA。
(3)PCR引物设计：TuMV引物设计分别根据已经发表的TuMV cDNA序列而设计的，引物序列见表2。
表2为检测TuMV所用的PCR引物
(4)反转录(RT):反转录以植物总RNA为模板，去除基因组DNA后，用表3中的引物进行反转录合成cDNA，其反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μLRT burffer、4.0μL RNase water。混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
表3反转录所用的引物
(5)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表3中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μLdH2O，其反应条件见表4。
表4PCR扩增的条件
按照上述条件进行PCR扩增，若材料中有TuMV，则会扩增出TuMV的特异性片段0.6kb
(6)电泳及凝胶成像：将聚合酶链式反应产物置于1.2％琼脂凝胶中进行电泳。
3.结果与分析
(1)西红花不同材料PCR检测
采用PCR方法检测西红花病株，其结果见图2。以TuMV设计的特异性片段为引物，分别以总RNA的反转录产物为模板，经PCR扩增后，在电泳图中没有出现TuMV的特异性片段。
实施案例2
1.西红花检测材料选取
以西红花户外种植的病植株取样，样品1-10，见图3。
2.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
(1)BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA。
(2)取0.2g西红花材料，切成小块，加入液氮研磨成粉末后提取总RNA。
(3)PCR引物设计：Potyvirus和Potyviridae通用引物采用文献的方法设计，见表5。
表5为检测Potyvirus和Potyviridae所用的PCR扩增引物
4)反转录(RT):反转录以植物总RNA为模板，去除基因组DNA后，用表6中的引物进行反转录合成cDNA，其反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μLRT burffer、4.0μL RNase water。混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
表6反转录所用的引物
(5)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表2中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μLdH2O，其反应条件见表7。
表7PCR扩增的条件
按照上述条件进行PCR扩增，若材料中有Potyvirus和Potyviridae，则会扩增出Potyvirus和Potyviridae的特异性片段，见表8。
表8特异性扩增片段的长度
(6)电泳及凝胶成像：将聚合酶链式反应产物置于1.2％琼脂凝胶中进行电泳。
3.西红花不同材料PCR检测
采用PCR方法检测西红花病株，其结果见图4(图中：1-11反转录时引物为Potyvirus下游引物，PCR引物Potyvirus上游引物、下游引物，其中10为阴性对照；12-22反转录时引物为Potyviridae反转录引物M4T，PCR引物Potyviridae上游引物、下游引物，其中22为阴性对照，23为2000的Mark。)。以Potyvirus和Potyviridae设计的特异性引物为引物，分别以总RNA的反转录产物为模板，经PCR扩增后，在电泳图中没有出现Potyvirus和Potyviridae的特异性片段(它们的大小为1.7kb)。
实施案例3
1.西红花检测材料选取
以西红花户外种植的病植株取样，样品1-10，见图5。
2.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
(1)BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA。
(2)取0.2g西红花材料，切成小块，加入液氮研磨成粉末后提取总RNA。
(3)PCR引物设计：TuMV的引物设计根据已经发表的TuMV cDNA序列而设计的，引物序列见表9。
表9为检测TuMV和TRV所用的PCR引物
(4)反转录(RT):反转录以植物总RNA为模板，去除基因组DNA后，用表10中的引物进行反转录合成cDNA，其反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μL RT burffer、4.0μL RNase water。混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
表10反转录所用的引物
(5)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表3中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μLdH2O，其反应条件见表11。
表11PCR扩增的条件
按照上述条件进行PCR扩增，若材料中有TuMV，则会扩增出TuMV的特异性片段0.6kb。
(6)电泳及凝胶成像：将聚合酶链式反应产物置于1.2％琼脂凝胶中进行电泳。
3.结果与分析
(1)西红花不同材料PCR检测
以西红花病株为病毒检测材料，反转录引物分别用Potyvirus、M4T、pimer mix三种引物，PCR引物为TuMV上游引物、下游引物；改变PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min，结束后4℃保存。其结果见电泳图6(图中：泳道1-10反转录引物为Potyvirus下游引物，泳道11-20反转录引物M4T，PCR引物Potyvirus上游引物、下游引物，21为阴性对照，22为2000的Mark；泳道23-32反转录引物为Potyvirus下游引物，33-42反转录引物为pimer mix，PCR引物Potyvirus、CMV、TuMV、TRV上游引物、下游引物，43为阴性对照，44为2000的Mark)。泳道1-21未出现特异性片段，泳道23-42扩增到500-600b的条带，43阴性显阳性有污染，污染条带大小为350b-400b。该结果初步表明，西红花病株主要携带TuMV病毒。
实施案例4
1.西红花检测材料选取
(1)抗病毒药剂处理的愈伤样品，1-4(上面一排)为35℃培养30d的愈伤，5-8(下面一排)为23℃培养30d的愈伤，如图7所示；
(2)外界正常、腐烂的球茎和芽，组培的芽、新球茎、叶片作为检测材料，如图8所示，西红花脱毒检测采样：1)外界芽尖；2)外界芽基；3)外界正常球茎；4)外界带斑球茎；5)组培芽；6)组培新球茎；7)外界坏芽；8)组培坏芽；9)组培坏芽；10)组培叶片。
(3)西红花户外种植的病植株取样，样品1-10，见图9；
2.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
(1)BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA。
(2)取0.2g西红花材料，切成小块，加入液氮研磨成粉末后提取总RNA。
(3)PCR引物设计：TuMV的引物设计分别根据已经发表的TuMV cDNA序列设计，引物序列见表12。
表12为检测TuMV所用的PCR引物
(4)反转录(RT):反转录以植物总RNA为模板，去除基因组DNA后，用表13中的引物进行反转录合成cDNA，其反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μL RT burffer、4.0μL RNase water。混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
表13反转录所用的引物
(5)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表12中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μL dH2O，其反应条件见表14。
表14PCR扩增的条件
按照上述条件进行PCR扩增，若材料中有TuMV，则会扩增出TuMV的特异性片段(0.6kb)。
(6)电泳及凝胶成像：将聚合酶链式反应产物置于1.2％琼脂凝胶中进行电泳。
3.结果与分析
(1)西红花不同材料PCR检测
以西红花组培、外界种植的样品为材料，按照试验获得的TuMV病毒检测方法进行PCR检测，其结果见电泳图10(图中：泳道1-8为图7提取的西红花愈伤，9为阴性对照，10阳性对照；泳道11-20为图8提取的西红花样品；泳道21-30为图9提取的西红花病株样品；31为阴性对照，32为阳性对照，33为Mark)。泳道20为西红花组培芽长成的正常、健康的绿叶，未检测到TuMV病毒。除了泳道20，包括病株叶片样品泳道21-30都检测出TuMV病毒。说明该检测方法有一定的科学性和准确性。
实施案例5
1.西红花检测材料选取
以杀菌剂处理的西红花愈伤为材料，样品1-6，见图11。
2.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
(1)BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA。
(2)取0.2g西红花材料，切成小块，加入液氮研磨成粉末后提取总RNA。
(3)PCR引物设计：根据通用引物采用文献的方法设计3个新引物，见表15。
表15为检测TuMV新设计的PCR扩增引物
(4)反转录(RT):反转录以植物总RNA为模板，去除基因组DNA后，进行反转录合成cDNA，其反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μL RT burffer、4.0μL RNase water。混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
(5)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表15中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μL dH2O，其反应条件见表16。
表16PCR扩增的条件
按照上述条件进行PCR扩增，若材料中有TuMV，则会扩增出TuMV的特异性片段0.6kb。
(6)电泳及凝胶成像：将聚合酶链式反应产物置于1.2％琼脂凝胶中进行电泳。
3.结果与分析
以西红花材料为样品，用新设计的三个TuMV病毒引物作为PCR上、下游引物，按照此前获得的TuMV病毒检测方法进行PCR检测，其结果见电泳图12(泳道1-6为ck引物，泳道7-12为引物1，泳道13-18为引物2，泳道19-24为引物3)。泳道1-8为对照引物，泳道17-24即引物2的的特异性条带较好。
实施案例6
1.山药检测材料选取
以山药植株为材料，见图13。
2.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
(1)BioTeke通用植物总RNA快速提取试剂盒提取RNA。
(2)取0.2g山药材料，切成小块，加入液氮研磨成粉末后提取总RNA。
(3)PCR引物设计：根据通用引物采用文献的方法设计3个新引物，见表17。
表17为检测TuMV新设计的PCR扩增引物
(4)反转录(RT):反转录以植物总RNA为模板，去除基因组DNA后，进行反转录合成cDNA，其反应体系为：10.0μL reationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μL RT burffer、4.0μL RNase water。混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
(5)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表17中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为12.5μL mix(酶)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μL cDNA和9.5μL dH2O，其反应条件见表18。
表18PCR扩增的条件
按照上述条件进行PCR扩增，若材料中有TuMV，则会扩增出TuMV的特异性片段0.6kb。
(6)电泳及凝胶成像：将聚合酶链式反应产物置于1.2％琼脂凝胶中进行电泳。
3.结果与分析
以山药材料为样品，用新设计的三个TuMV病毒引物作为PCR上、下游引物，按照此前获得的TuMV病毒检测方法进行PCR检测，其结果见电泳图14(泳道1-6为ck引物，泳道7-12为引物1，泳道13-18为引物2，泳道19-24为引物3)。引物2的泳道13-18作为条带特异性的检测，证明新引物PCR过程不产生非特异性条带，特异性强。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 福建省中科生物股份有限公司
<120> 一种用于鉴定植物病毒TuMV的引物组合及鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acacacgttc aacgcgaaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctgaacgc ccagtaagtt 20
Claims (8)
1.一种用于鉴定植物病毒TuMV的引物组合，包括上游引物和下游引物，其特征在于，
上游引物序列为：5’ACACACGTTCAACGCGAAAG3’，
下游引物序列为：5’CCCTGAACGCCCAGTAAGTT3’。
2.一种包含如权利要求1所述引物组合的试剂盒。
3.一种鉴定植物病毒TuMV的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样本基因组RNA；
(2)以样本基因组RNA为模板，去除基因组DNA后，进行反转录合成cDNA；
(3)以反转录合成的cDNA为模板，以权利要求1所述引物组合进行PCR扩增；
(4)PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min，结束后4℃保存。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为：12.5μL mix(酶预混液)、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、1.0μLcDNA和9.5μL dH2O。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述反转录反应以pimer mix为引物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反转录反应体系为：10.0μLreationI、1.0Primer mix、1.0μL RT酶、4.0μL RT burffer、4.0μL RNase water。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反转录反应程序为：混合振荡、离心，42℃、50min，85℃、5min，-80℃保存。
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