CN101173251A - 快速脱除百合三种病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及“快速脱除百合三种病毒的方法”，属于生物技术领域。快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于：将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L。本发明脱除百合病毒的方法，脱毒组织具有脱毒率高，成活率高，再生速率快的优点。

Description

快速脱除百合三种病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及快速脱除百合三种病毒的方法。
背景技术
百合三种病毒LSV、CMV、LMoV是造成百合经济作物减产的主要原因。现有的脱去上述三种病毒的主要方法有如下几种：1)茎尖分生法：茎尖分生区是病毒含量最少的区域。茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm进行的无菌培养。但，这么小的茎尖实际上很难取得，成活率很低，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，多采用带有叶原基的生长锥来培养，通常0.2～0.4mm(毫米)的茎尖分生组织，但，带毒的几率增大。Kim对带LSV、CMV、LMoV的铁炮百合‘Georgia’进行茎尖脱毒；席梦利也采用茎尖脱毒对宜兴百合进行脱毒，获得了组培苗，但未进行病毒检测。2)热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，选择一定的温度和适当的处理时间，使寄主体内的病毒钝化失活，从而达到减轻病毒危害的目的。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。38±1℃，6h或25℃8h热空气和50±1℃，40min恒温水浴结合茎尖培养脱除了宜兴百合的CMV病毒。3)抗病毒药剂法：其作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成，抑制病毒增殖或移动。Blom-Barnhoorn采用不同的病毒唑浓度(20和100mg/L)，分别获得了两个百合品种‘Georgia’和‘Connecticut King’的无毒苗；Xu-PinSan在鳞片诱导培养基中加5mg/L(毫克/升)的病毒唑和硫尿嘧啶，获得80％无毒百合植株。Dapkuniene将组培小籽球在加有5mg/L(毫克升)苄基腺嘌呤和0.1mg/L NAA的MS培养基中获得了4个品种的无毒百合籽球。但现有的检测方法中还存在如下问题：茎(根)尖培养(stem or shoot tip culture)是切取茎(根)的先端部分或茎(根)尖分生组织部分进行的无菌培养。严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。但这么小的茎尖实际上很难取得，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，常采用带有叶原基的生长锥来培养。实际操作不可能得到不超过0.1mm的茎尖。较大茎尖脱毒率大为降低，甚至不能脱毒。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。但实际上38±1℃，6h和50±1℃ 40min恒温水浴下，茎尖培养不能成活，25℃8h热空气不能脱除LSV、LMoV。抗病毒药剂法中抗病毒剂的使用浓度越高，处理时间越长脱毒效果越加明显，但同时，高浓度抗病毒剂对植株的生长有明显伤害。
获得无病毒植株的难易程度与品种和感染病毒的种类有直接关系。同时，与病毒检测技术方法相关，早期均采用指示植物和ELISA法检测，灵敏度较低，很多情况下并没有真正完全脱除病毒。
发明内容
本发明针对上述三种方法的缺陷，提供一种快速脱除百合三种病毒的方法，并结合灵敏的病毒检测方法，解决成活率低，脱毒率低，再生速率低等技术问题，从而达到高效快速脱毒的目的。
快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于：将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L。
培养基成分为：MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂6g/L。
培养条件：2000～3000lx，光照时间14h/d，培养温度20～25℃。
本申请组合茎尖脱病法及抗病毒药剂法，将切取的茎尖分生组织增大，这样可以缩短了其培养的时间，但其所含病毒量增加了，采用一定浓度的病毒唑对其进行脱毒，由于病毒含量提高，其病毒唑的浓度应控制在一定的范围内，浓度太高，易造成死亡，浓度太低起不到脱毒的效果，本发明经过反复实验得出，茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L，脱毒效果最好，且脱毒组织经过3个月，18个月和栽培成花全过程检测，证明本发明方法脱毒率达92％。
本发明方法采用茎尖大小为0.5mm～0.8mm作为脱毒培养组织，容易切取，而且成活率和再生速率都大大提高了，由于茎尖增大了，其耐病毒唑浓度也提高了，所以可以在较高病毒唑浓度(4mg/L～6mg/L)下脱除病毒，脱毒率大大提高。
附图说明
图1：部分处理组合生长4周状况
其中A：0.5～0.7茎尖和2mg/L病毒唑形成愈伤组织，B：0.5～0.7茎尖和8mg/L病毒唑愈伤组织死亡，C：0.2～0.4茎尖和2mg/L病毒唑形成愈伤组织，D：1.0～1.2茎尖和4mg/L病毒唑形成的植株
图2：东方百合‘元帅’LSV跟踪检测电泳图
第1泳道：接种3周的茎尖和愈伤组织；第2泳道：生长9周的脱毒苗；第3泳道：生长12周形成的脱毒苗；第4泳道：茎尖直接形成的脱毒子球；第5泳道：脱毒子球形成的开花植株；第6泳道：阳性对照(脱毒前的病毒条带)；第7泳道：阴性对照。
图3：原始材料、脱毒组织在培养阶段、瓶中成球和成花栽培后的状态
其中1：东方百合‘元帅’3种病毒复合侵染表现出花瓣斑驳，花柱发育不良，2：OT杂交系‘动人’3种病毒复合侵染表现出叶卷曲，3：百合种球的茎尖，4：接种2周的茎尖，5：生长7周的茎尖，6：生长9周形成的脱毒苗，7：茎尖直接形成的脱毒子球，8：脱毒开花植株。
具体实施方式
1)脱毒方法
取经低温处理已抽芽3～6cm的鳞茎，从茎节处切下，去掉外部鳞片。用自来水冲洗1h，蒸馏水浸泡10min，再用0.1％氯化汞消毒10min(加几滴吐温80)，最后无菌水冲洗3～5次。在带有测微尺的体视显微镜(Olympus，SZX10)无菌条件下切取带有1-2个叶原基的，不同大小的茎尖分生组织，迅速接种于添加不同浓度病毒唑的培养基上，进行茎尖培养。培养基成分为：MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂6g/L。培养条件2000～3000lx，光照时间14h/d，培养温度20～25℃。
根据均匀试验设计，茎尖大小设为4个水平0.2-0.4mm、0.5-0.7mm、0.8-1.0mm、1.0-1.2mm；病毒唑浓度设为5个水平，0mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L，共20个处理，每个处理30个茎尖。注意观察茎尖的生长情况，统计茎尖成活率。(见表1、表2)
接种茎尖到添加不同病毒唑浓度的分化培养基上，7d左右，观察到有的茎尖开始膨大变绿，有的因为失水而变褐，死亡。20d左右，存活的茎尖有的分化成芽，有的膨大形成愈伤组织。每隔25d更换一次培养基，保证茎尖生长所需营养。随着茎尖不断的吸收作用，当病毒唑浓度大于6mg/L，部分茎尖慢慢失绿，变褐或成为白化苗死亡。当病毒唑浓度达到10mg/L时，茎尖的成活率只有30％。(见图1)
表1因素水平表
Table 1 The combination of the experiment
    水平因素 1 2 3 4
  A病毒唑浓度Concentration of Virazole(mg/L)     2     4     8     10
  B茎尖大小Size of tip meristem(mm)     0.2～0.4    0.5～0.7    0.8～1.0    1.0～1.2
表2正交试验结果分析表
Table 2 Analyze of the experiment
  试验号No.     因素AFactorA   因素BFactorB     成活率(％)Ratio of survival shoots     脱毒率(％)Ratio of eliminated sample
    1     1     1     40     88.9
    2     1     2     80     55.6
    3     1     3     100     33.3
    4     1     4     93.3     11.1
    5     2     1     76.7     100
    6     2     2     90     77.8
    7     2     3     100     44.4
    8     2     4     100     33.3
    9     3     1     70     88.9
    10     3     2     70     66.7
    11     3     3     80     77.8
    12     3     4     63.3     66.7
    13     4     1     60     88.9
    14     4     2     50     88.9
    15     4     3     60     100
    16     4     4     50     55.6
    17     5     1     40     100
    18     5     2     40     88.9
    19     5     3     30     66.7
    20     5     4     30     88.9
    I/4     78.3     57.3
    II/4     91.7     66
    III/4     70.8     74
    IV/4     55     84.2
    V/4     35
    R1     56.7     26.9
    I/4     47.2     93.3
    II/4     53.3     75.6
    III/4     75     64.4
    IV/4     83.4     51.1
    V/4     86.1
    R2     38.9     42.2
从成活的组培苗中，每个处理随机选取3个进行多重RT-PCR检测。试验结果表明：
感病百合中CMV和LMoV被全部脱除，而LSV在部分组培苗中还存在。在没有添加病毒唑的处理中，茎尖大小在0.2-0.4mm范围时，可以脱除全部病毒。但从上表结果显示，此范围内茎尖的成活率只有40％，而且由于操作困难，茎尖太小极易失水而失活，茎尖生长也很缓慢。
当茎尖大于1.0mm时，病毒唑浓度即使达到10mg/L也不能完全脱除病毒。
病毒唑浓度小于4mg/L时，检测到CMV+LSV两种病毒同时存在的现象。当病毒唑浓度大于4mg/L时，未脱除的只有LSV，而CMV和LMoV均无。病毒唑浓度大于6mg/L，茎尖大小小于1.0mm时，LSV也被脱除。
当病毒唑浓度达到4mg/L时，茎尖大小在0.8mm以上，有部分病毒不能脱除；病毒唑浓度在6mg/L以上时，大部分病毒均可被脱除。在10mg/L，茎尖大小小于1.0mm时，病毒脱除率可达98％，但是该浓度时茎尖的成活率却只有30％。综合茎尖成活率和脱毒率两因素，当病毒唑浓度在4mg/L～6mg/L之间，茎尖大小在0.5mm～0.8mm，效果最好，病毒脱除率可达92％。
2)检测本发明方法的效果
应用本实验室建立的RT-PCR方法进行病毒检测，并分别在脱毒原始材料、脱毒组织培养3个月、18个月和栽培成花全过程(见图3)检测病毒。
针对CMV、LMoV和LSV三种病毒外壳蛋白CP基因保守序列设计了三对引物，利用该方法扩增不同的目的片段。引物序列分别是：
CMV：上游引物5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG
及下游引物5’-TCAGACTGGGAGCACTCCG..。
LMoV：上游引物5’-GCAAATGAGACACTTAACGCT
及下游引物5’CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG。
LSV：上游引物5’-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG
及下游引物5’-TTTGTGTATCGATGATTTCGG。
1.植物总RNA提取与cDNA第一链的合成
称取新鲜病叶50mg，在1.5mL的eppendorf管中，加入少量液氮，用干净灭菌的玻璃棒迅速磨碎，加500μL病毒抽提液：0.5M pH8.0的Tris-HCl，2％PVP-40.1％PEG6000，0.8％NaCI和0.05％Tween 20。继续研磨混匀，从中取10μL用抽提液再稀释50～100倍后即为工作液(RT-PCR的模板)。
2多重RT-PCR扩增
反应体系：
总RNA提取物                                5.0μL
Oligo dT Primer(0.5μg/μL)                0.5μL
SS II反转录酶(20U/μL)                     0.2μL
Rnase inhibitor(40U/μL)                   0.5μL
Taq PCR buffer(内含1.5mmol/L MgCl2)        2.5μL
dNTP(200μmol/L)                           1.6μL
Taq酶(5U/μL)                              0.2μL
引物CMV1/CMV2(5pmol)                       0.5μL
引物LSV1/LSV2(5pmol)                       0.5μL
引物LMoV1/LMoV2(5pmol)                     0.5μL
ddH2O                                      13μL
Total                                      25μL
PCR程序：PCR程序
42℃反转录30min，95℃4min，94℃20s，52℃30s，72℃40s，72℃5min，30个循环。
反应在PCR扩增仪(PTC-100TM programmable thermal controller，MJ.reseach Inc)上进行，30个循环，72℃延伸5min，最后于4℃结束。
2)反应产物的电泳检测
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压100V，PCR产物上样量为6μL，用凝胶成像仪Gel Doc1000凝胶分析仪(Bio-Rad)扫描并产生TIFF图象，经图象分析软件(QUANTY ONE)进行分析。(见图2)
结论：经本发明方法处理过的脱毒级组织经再培养后没有发现有病毒，说明本发明方法脱毒效果非常好

Claims (3)

1.快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于：将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，所述培养基成分为：MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂6g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述培养条件为：2000～3000lx，光照时间14h/d，培养温度20～25℃。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102440188A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 杨凯 使用盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法
CN102440183A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 安利清 使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法
CN102440189A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 杨凯 使用病毒灵药剂对百合脱毒培养的方法
CN102440186A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 杨凯 使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法
CN102577965A (zh) * 2012-03-01 2012-07-18 玉溪明珠花卉股份有限公司 东方百合种球脱毒方法
CN105830930A (zh) * 2016-05-20 2016-08-10 湖南省蔬菜研究所 一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法
CN107347639A (zh) * 2017-06-27 2017-11-17 丹东天赐花卉有限公司 一种蓝莓组培苗的脱毒方法和培养方法
CN109042334A (zh) * 2018-09-21 2018-12-21 杨晓峰 一种朱顶红脱毒组织培养和快速繁殖方法
CN111837949A (zh) * 2020-07-10 2020-10-30 佛山市粤山生物科技有限公司 一种植物组织培养的污染苗脱菌培养基及培养方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1903015A (zh) * 2005-07-29 2007-01-31 潘利军 百合组培苗化学药剂处理脱毒的方法

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102440188A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 杨凯 使用盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法
CN102440183A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 安利清 使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法
CN102440189A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 杨凯 使用病毒灵药剂对百合脱毒培养的方法
CN102440186A (zh) * 2010-10-14 2012-05-09 杨凯 使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法
CN102577965A (zh) * 2012-03-01 2012-07-18 玉溪明珠花卉股份有限公司 东方百合种球脱毒方法
CN102577965B (zh) * 2012-03-01 2013-09-04 玉溪明珠花卉股份有限公司 东方百合种球脱毒方法
CN105830930A (zh) * 2016-05-20 2016-08-10 湖南省蔬菜研究所 一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法
CN105830930B (zh) * 2016-05-20 2018-06-19 湖南省蔬菜研究所 一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法
CN107347639A (zh) * 2017-06-27 2017-11-17 丹东天赐花卉有限公司 一种蓝莓组培苗的脱毒方法和培养方法
CN107347639B (zh) * 2017-06-27 2019-08-13 丹东天赐花卉有限公司 一种蓝莓组培苗的脱毒方法和培养方法
CN109042334A (zh) * 2018-09-21 2018-12-21 杨晓峰 一种朱顶红脱毒组织培养和快速繁殖方法
CN111837949A (zh) * 2020-07-10 2020-10-30 佛山市粤山生物科技有限公司 一种植物组织培养的污染苗脱菌培养基及培养方法

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