CN115820660A - 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 - Google Patents
一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115820660A CN115820660A CN202210826129.2A CN202210826129A CN115820660A CN 115820660 A CN115820660 A CN 115820660A CN 202210826129 A CN202210826129 A CN 202210826129A CN 115820660 A CN115820660 A CN 115820660A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pds
- hemerocallis
- gene
- hemerocallis fulva
- pds gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000009206 Hemerocallis fulva Species 0.000 title claims abstract description 72
- 235000002941 Hemerocallis fulva Nutrition 0.000 title claims abstract description 72
- 101150108119 PDS gene Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 69
- 241000756137 Hemerocallis Species 0.000 claims abstract description 58
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 25
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 abstract description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 15
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 7
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000723573 Tobacco rattle virus Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 206010001557 Albinism Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241001126858 Scytosiphon Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010413 gardening Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010001545 phytoene dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/40—Monitoring or fighting invasive species
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用，本发明涉及一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用，本发明的目的是为了提供一种沉默效率高的萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用方法。本发明一种萱草PDS基因VIGS沉默体系包含如SEQIDNO.1所示的基因序列。萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。本发明通过浸种法、叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染萱草幼苗，皆出现不同程度的白斑与白化现象，后期通过qPCR检测PDS基因的表达量，相比于对照，采用以上方法侵染后的萱草PDS基因表达量皆有效降低。本发明适用于萱草基因工程领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用。
背景技术
病毒介导的基因沉默技术VIGS(virus induced gene silencing)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默，出现相应的表型变化。VIGS技术在当代植物上直接产生RNAi效果，大幅度节约时间和成本；可同时实现多个基因的沉默；避免了传统转基因体系的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物和受基因型限制的品种，因而在植物基因功能的研究中应用越来越广泛。
萱草(Hemerocallis fulva)是原产我国的多年生宿根花卉，其不但具有很高的观赏价值和食用价值，同时兼具耐热、耐寒、耐旱、耐瘠薄、抗倒伏等抗性优势。目前，国内外学者对萱草的研究主要集中于育种方面，其分子生物学研究方面仍处于起步阶段。同时，萱草遗传转化体系虽已建立，由于萱草为多年生宿根植物，生长周期长，愈伤诱导耗时久，在一定程度上制约了萱草基因功能研究的进展，而VIGS技术不需要遗传转化体系就能获得基因沉默植物，从而有望克服上述瓶颈来大大促进相关基因的功能鉴定，因此，亟待建立一套VIGS技术在萱草中高效诱导内源基因沉默的体系。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种沉默效率高的萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用方法。
一种萱草PDS基因VIGS沉默体系包含如SEQ IDNO.1所示的基因序列。
所述一种萱草PDS基因VIGS沉默体系的构建方法按以下步骤进行：
一、提取萱草叶片RNA，反转录得萱草cDNA；
二、根据萱草转录组数据库获得PDSmRNA序列信息，并以该序列为模板设计引物，扩增PDS基因的CDS全长序列，连接至pMD19-T载体中并转入大肠杆菌后，进行蓝白斑筛选，挑单克隆阳检，获得连有PDS基因的CDS序列的重组质粒；
三、采用引入EcoR Ⅰ和BamHI酶切位点的特异性引物，以步骤二中的重组质粒为模板进行PCR扩增，纯化获得萱草PDS特异性核苷酸片段，如SEQ IDNO.1所示；
四、以EcoR Ⅰ和BamHI内切酶为酶切位点，将萱草PDS特异性核苷酸片段和TRV 2质粒进行双酶切，胶回收纯化后用T4连接酶过夜连接，再将连接产物转化大肠杆菌中扩繁，提取重组质粒，进行双酶切和测序验证，将成功连接PDS的TRV2命名为TRV2-PDS重组质粒。
一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。
本发明通过浸种法、叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染萱草幼苗，皆出现不同程度的白斑与白化现象，后期通过qPCR检测PDS基因的表达量，相比于对照，采用以上方法侵染后的萱草PDS基因表达量皆有效降低。
本发明的有益效应：
1、本发明首次通过成功构建萱草PDS基因VIGS沉默体系，获得了具有能够使萱草PDS基因沉默的体系。
2、本发明采用烟草脆裂病毒构建萱草PDS基因沉默体系，能够在萱草植株内进行系统扩散并表达。
3、本发明所述沉默体系浸染萱草，尤其是通过注射萱草幼苗的胚乳，能使病毒侵染液被萱草更加充分地吸收，从而高效降低萱草PDS基因的表达水平，叶片出现白化现象明显。
附图说明
图1为本发明实施例一中构建的重组病毒载体TRV2-PDS转入大肠杆菌后的菌落验证图；
图2为本发明实施例一中沉默载体以浸种法侵染萱草种子后生长出幼苗出现的白化表型图；
图3为本发明实施例一中沉默载体以叶片注射法侵染萱草幼苗后未出现白化表型图；
图4为本发明实施例一中沉默载体以真空渗透法侵染萱草幼苗后出现的白化表型图；
图5为本发明实施例一中沉默载体以注射胚乳法侵染萱草幼苗后出现的白化表型图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种萱草PDS基因VIGS沉默体系包含如SEQ IDNO.1所示的基因序列。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述沉默体系的构建方法按以下步骤进行：
一、提取萱草叶片RNA，反转录得萱草cDNA；
二、根据萱草转录组数据库获得PDS mRNA序列信息，并以该序列为模板设计引物，扩增PDS基因的CDS全长序列，连接至pMD19-T载体中并转入大肠杆菌后，进行蓝白斑筛选，挑单克隆阳检，获得连有PDS基因的CDS序列的重组质粒；
三、采用引入EcoR Ⅰ和BamHI酶切位点的特异性引物，以步骤二中的重组质粒为模板进行PCR扩增，纯化获得萱草PDS特异性核苷酸片段，如SEQ IDNO.1所示；
四、以EcoR Ⅰ和BamHI内切酶为酶切位点，将萱草PDS特异性核苷酸片段和TRV 2质粒进行双酶切，胶回收纯化后用T4连接酶过夜连接，再将连接产物转化大肠杆菌中扩繁，提取重组质粒，进行双酶切和测序验证，将成功连接PDS的TRV2命名为TRV2-PDS重组质粒。
具体实施方式三：本实施方式萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用方法为：
一、将TRV2-PDS重组质粒和TRV1质粒分别转入农杆菌感受态细胞中，挑取转化后的阳性农杆菌菌落接种至LB抗性液体培养基中，28℃，200rpm培养14-16h；然后再将培养后的菌液分别以体积比1:20的比例接入含200μM乙酰丁香酮的液体抗性培养基，28℃，200rpm培养14-16h，培养至OD600＝1.0-1.3，收集含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液；
二、分别将含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液5000rpm离心15min，再用重悬液重悬菌液沉淀，将重悬后的TRV2-PDS菌液和TRV1菌液等体积混合，得到侵染液；
三、使用侵染液侵染萱草；其中侵染萱草的方法为浸种法、叶片注射法、真空渗透法或注射胚乳法；
四、继续培养萱草幼苗，浸种法侵染后培养的萱草幼苗待出现第二片叶时检测被沉默基因的表达量；叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染的萱草幼苗，待侵染2-3次后检测被沉默基因的表达量。其它步骤与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是：重悬液的配方为：重悬液的配方为：300μM乙酰丁香酮、10mM MgCl2、10mM乙磺酸和400mg/L半胱氨酸。其它步骤与具体实施方式三或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一不同的是：步骤二重悬至菌体OD600＝1.2。其它步骤与具体实施方式三至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三至六之一不同的是：含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液等体积混合后室温黑暗静置活化3-5h。其它步骤与具体实施方式三至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三至七之一不同的是：步骤三中注射胚乳法是使用1mL带针头的无菌注射器，将活化后的侵染液注射到已发芽萱草幼苗的胚乳中。其它步骤与具体实施方式三至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式三至八之一不同的是：叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染每7d一次，重复浸染1-2次，其它步骤与具体实施方式三至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式三至九之一不同的是：使用侵染液侵染萱草幼苗后需黑暗处理24h后再置于22℃，16h光照和18℃，8h黑暗的条件下培养。其它步骤与具体实施方式三至九之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：一种萱草PDS基因VIGS沉默体系的构建方法，按以下步骤进行：
1、萱草PDS干扰片段克隆
依据萱草转录组数据库基因注释信息得到八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase，PDS)mRNA序列信息，使用Primer5软件工具设计用于扩增PDS基因全长序列的引物；
用Trizol法(TaKaRa RNAiso)提取萱草叶片Total RNA(萱草叶片于二零二一年八月采于黑龙江省东北农业大学园艺研究站温室)，使用赛默飞反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，用引物1和引物2扩增该基因的CDS全长，连接至pMD19-T载体中并转入大肠杆菌后，进行蓝白斑筛选，挑单克隆阳检，获得连有目标基因的CDS序列的重组质粒；采用引入EcoR Ⅰ和BamHI酶切位点的特异性引物，以上述重组质粒为模板进行PCR扩增，测序结果如SEQIDNO.1所示，共284bp。其中，PCR酶使用TaKaRa公司生产的E×Taq，PCR反应程序为：98℃预变形2min；98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸1min，运行35个循环，72℃终延伸2min，4℃终止。使用天根公司PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物，得到萱草PDS基因特异性片段，纯化方法参照试剂盒说明书。
萱草PDS基因全长序列如下所示：
atgagtgttc ttgggtcatt ttctgctgtg tgcccaagtg gtggcatcaa gagcagaaga
agattttcgc gggcttctaa tagttttgag gggtttagaa gtagtgaatg catggggtat
caattgaaag tgccaattcc gttctttgcg aaaacaggga gctcaaagtt gagccctttg
caggtggttt gcaaggatta cccaaggcct gaacttgagg gtactattaa tttcttagaa
gctgctcagt tgtcttcgtc tttccgtagt cgccctagac cggagaaagg gcttgaaatt
gtcattgctg gagcaggttt ggctggacta tcaactgcca aatatcttgc tgatgccggt
cacaaaccta tattgttgga agctagagat gttcttgggg gcaagattgc tgcttggaaa
gacaaggatg gggattggta cgagacaggc ctccatatat tctttggagc ataccccaac
atacagaact tgtttggaga acttggaatt gatgatcgtt tgcagtggaa agagcattcc
atgatcttcg caatgccgaa taaacctggg gaatttagcc gctttgattt tccggaggtt
cttcctgctc ccttaaatgg aatatgggct atcttgaaga acaatgaaat gctgacttgg
cctgagaaag tgaaatttgc cattggactt ttgccggcca ttgtaggagg acaggcttat
gttgaggctc aggatagcct gtctgttact gagtggatga gaaagcaggg tgtgcctgat
cgagtgaatg atgaagtgtt catagcaatg tctaaggctc taaacttcat aaacccagat
gaactttcca tgcagtgtat tttgattgct ctaaatcgtt ttctacagga aaagcatggg
tccaaaatgg cattcttgga tggtagtccg cctgagagat tatgcatgcc aatcgttgat
cacattcaat cattgggtgg cgaagtccgt cttaattcac gtctacaaaa gatcgaactg
aattcagatg gaactgtgaa gcattttgtt cttggcaatg gaaatattat caaaggagat
gcttacgtag ttgctgcacc tgttgatatt ttcaagcttc ttttgcctca agaatggaaa
gaaattcctt atttcaagaa attggataaa ctagtgggag tccccgtgat caacgtgcat
atatggtttg atagaaagct gaagaacacc tatgatcacc tccttttcag caggtcttgg
ctagtactta tttcattaat tgttttcaca gttttatttt ttttgtcacg gactgtataa
萱草PDS基因特异性核苷酸片段序列为：
agaccggaga aagggcttga aattgtcatt gctggagcag gtttggctgg actatcaact
gccaaatatc ttgctgatgc cggtcacaaa cctatattgt tggaagctag agatgttctt
gggggcaaga ttgctgcttg gaaagacaag gatggggatt ggtacgagac aggcctccat
atattctttg gagcataccc caacatacag aacttgtttg gagaacttgg aattgatgat
cgtttgcagt ggaaagagca ttccatgatc ttcgcaatgc cgaa
2、载体构建
以EcoR Ⅰ和BamHI内切酶为酶切位点，将PDS基因特异性片段产物和TRV2质粒进行双酶切，用天根公司胶回收试剂盒纯化回收后再用T4连接酶过夜连接，后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中扩繁，抗性筛选后挑取阳性单菌落进行菌落PCR，利用琼脂糖凝胶电泳进行验证，如图1所示，条带约在284bp，符合预期目标，后进行双酶切和测序验证，将成功连接PDS的TRV2命名为TRV2-PDS。
3、农杆菌菌液制备及侵染
将TRV1和TRV2-PDS质粒转入EHA105感受态细胞中，挑取转化后的阳性农杆菌单菌落，分别接入3mlLB抗性液体培养基中(50mg/L卡那和20mg/L利福平)，28℃，200rpm培养14-16h；菌液PCR鉴定条带位置后菌液以体积比1:20接入60ml含200μM乙酰丁香酮(AS)的液体抗性培养基，培养至OD600＝1.0-1.3，收集两种菌液，然后分别5000rpm离心15min，再用含300μM AS、10mM MgCl2、10mM MES、400mg/L半胱氨酸的重悬液重悬菌液沉淀，然后将重悬后的TRV2-PDS菌液和TRV1菌液按体积比1:1的比例混合后黑暗静置活化3-5h，得到浸染液。
所述LB抗性液体培养基是向市售的LB液体培养基中加入卡那和利福平；含200μM乙酰丁香酮(AS)的液体抗性培养基是向市售的LB液体培养基中加入乙酰丁香酮。
4、VIGS沉默效率的鉴定
以萱草种子为实验材料，选取600粒颗粒饱满的种子作为供试材料，100粒种子用浸种法侵染后播于灭菌蛭石中，此作为试验组1，剩余500粒种子用清水浸泡露白后与试验组1的种子同时播种于蛭石中，其中100粒14d后不侵染作为空白对照组；100粒14d后用TRV1和TRV2空载体菌液1:1混合注射作为阴性对照组；100粒用注射叶片法侵染幼苗作为试验组2；100粒用真空渗透法侵染的幼苗作为试验3；100粒用注射胚乳法侵染幼苗作为试验组4。
浸种法侵染萱草，对萱草已浸泡至露白的种子进行菌液浸泡，置于18-22℃的黑暗环境中浸泡三天，每天需更换新的浸泡菌液。浸泡侵染完成后，将浸泡后的种子播于已灭菌的蛭石中。叶片注射法侵染萱草，对播种于灭菌蛭石中，生长待有第二片叶出现后的幼苗，将1ml无菌注射器的针头插入叶片中进行菌液注射。真空渗透法侵染萱草，对播种于灭菌蛭石中，生长待有第二片叶出现后的幼苗，从蛭石中移出并用灭菌去离子水清洗根部，在真空泵中，将幼苗浸没在侵染液中，真空状态下反复抽吸两次，每次30S后保持真空状态30S，最后用灭菌去离子水冲洗2次再种回灭菌蛭石中。注射胚乳法侵染萱草，对播种于灭菌蛭石中，已发芽并出现地上部分的萱草幼苗，用1mL带针头的无菌注射器将侵染液注射进萱草已发芽的胚乳中。叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染每7d一次，重复1-2次。叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染后的幼苗需黑暗处理24h后再置于22℃，16h光照和18℃，8h黑暗的条件下培养，浸种法侵染后的萱草种子直接置于22℃，16h光照和18℃，8h黑暗的条件下培养。
将浸种法侵染后的萱草种子生长至有第二片叶且有白化表型的幼苗取样保存(液氮速冻，-80℃保存)，注射叶片法、真空渗透法和注射胚乳法侵染的萱草幼苗于14-21d内取样，
其中以浸种法侵染萱草种子后生长出幼苗出现的白化表型图如图2所示，由图2可知，幼苗矮小，就生长出第二片叶，且新叶具有明显白化表型；
以叶片注射法侵染萱草幼苗后未出现白化表型图如图3所示，由图3可知，由于萱草幼苗叶片薄而脆弱，用叶片注射法无法有效地将侵染液注射进叶片内，且对叶片造成了一定的机械损伤，部分叶片出现萎蔫状态，无白斑、白化的表型；
以真空渗透法侵染萱草幼苗后出现的白化表型图如图4所示，由图4可知，萱草幼苗的第一片叶上出现白化表型，约占整个叶片长度的二分之一；
以注射胚乳法侵染萱草幼苗后出现的白化表型图如图5所示，由图5可知，萱草幼苗的第一片叶出现白化表型，表型明显，面积较大，几乎占据整个叶片。
以未侵染萱草幼苗为空白对照，以TRV1和TRV2空载体菌液按1：1混合注射的植株为阴性对照，对阴性对照植株和TRV2-PDS植株进行qRT-PCR分析。本发明中对照组与试验组各设置3个生物学重复，以Actin为内参基因，对PDS的表达量进行qRT-PCR分析，基因表达量计算采用2^-ΔΔCt法(Livak法)。结果如表2显示，与阴性对照相比，TRV2-PDS植株的表达量均显著降低。
上述设及的基因序列如下：
1、扩增萱草PDS基因的CDS全长引物
引物1：5’-ATGAGTGTTCTTGGGTCATT-3’
引物2：5’-TTATACAGTCCGTGACAAAA-3’
2、扩增萱草PDS特异性片段，在正反引物引入EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点
引物3：5-AACCAGGAATTCAGACCGGAGAAAGGGCTTGA-3’
引物4：5’-AACCAGGGATCCTTCGGCATTGCGAAGATCA-3’
3、Actin的荧光引物
引物1：5’-CTGAGCGGGAAGTTGTAAGGGAC-3’
引物2：5’-ATCACGGATGGCTGGAAGAGGAC-3’
效果验证
观察统计各组在试验过程中的发芽率(发芽率＝发芽的种子数/供试的种子总数)和沉默数量效率(沉默数量效率＝有白化表型的植株/供试的植株总数)。
表1各试验组培养情况
由表1可知，试验组1的种子浸泡侵染后，相较于未侵染的其他试验组的种子，发芽率有所降低；试验组1的种子生长至第二片叶，观察其表型，叶片有白斑，出现白化表型的植株极少，表明浸种法沉默数量效率极低；试验组2的萱草幼苗未出现白斑、白化表型，表明该法不适用于构建萱草病毒基因沉默体系；试验组3获得的有表型的植株相较于试验组1和2的都多，沉默数量效率可达11％；试验组4有表型的植株远高于其他试验组，沉默数量效率可达59％。
表2基因表达量分析
| 组别 | 空白对照组 | 阴性对照组 | 试验组1 | 试验组2 | 试验组3 | 试验组4 |
| 表达量 | 1.517 | 1.378 | 0.757 | 1.246 | 0.40668 | 0.00009 |
由表2可知，试验组2的萱草幼苗通过叶片注射法并未实现PDS基因的有效沉默，但试验组1、试验组3和试验组4的PDS基因表达量相对于阴性对照组和空白对照组极显著降低，皆低于对照组的50％，说明以上3组萱草幼苗体内的PDS基因都实现有效沉默，结合萱草试验组的表型，说明本实施例里克隆的萱草PDS基因是正确的。且试验组4的沉默效率更加显著，基因表达量小于千分之一，说明通过注射胚乳法侵染萱草幼苗可高效且快速地沉默萱草内源PDS基因。
Claims (10)
1.一种萱草PDS基因VIGS沉默体系，其特征在于，所述沉默体系包含如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
2.根据权利要求1所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系，其特征在于，所述沉默体系的构建方法按以下步骤进行：
一、提取萱草叶片RNA，反转录得萱草cDNA；
二、根据萱草转录组数据库获得PDSmRNA序列信息，并以该序列为模板设计引物，扩增PDS基因的CDS全长序列，连接至pMD19-T载体中并转入大肠杆菌后，进行蓝白斑筛选，挑单克隆阳检，获得连有PDS基因的CDS序列的重组质粒；
三、采用引入EcoRⅠ和BamHI酶切位点的特异性引物，以步骤二中的重组质粒为模板进行PCR扩增，纯化获得萱草PDS特异性核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示；
四、以EcoRⅠ和BamHI内切酶为酶切位点，将萱草PDS特异性核苷酸片段和TRV2质粒进行双酶切，胶回收纯化后用T4连接酶过夜连接，再将连接产物转化大肠杆菌中扩繁，提取重组质粒，进行双酶切和测序验证，将成功连接PDS的TRV2命名为TRV2-PDS重组质粒。
3.如权利要求1所述的萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于所述应用的方法为：
一、将TRV2-PDS重组质粒和TRV1质粒分别转入农杆菌感受态细胞中，挑取转化后的阳性农杆菌菌落接种至LB抗性液体培养基中，28℃，200rpm培养14-16h；然后再将培养后的菌液分别以体积比1:20的比例接入含200μM乙酰丁香酮的液体抗性培养基，28℃，200rpm培养14-16h，培养至OD600＝1.0-1.3，收集含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液；
一、分别将含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液5000rpm离心15min，再用重悬液重悬菌液沉淀，将重悬后的TRV2-PDS菌液和TRV1菌液等体积混合，得到侵染液；
三、使用侵染液侵染萱草；其中侵染萱草的方法为浸种法、叶片注射法、真空渗透法或注射胚乳法；
四、继续培养萱草幼苗，浸种法侵染后培养的萱草幼苗待出现第二片叶时检测被沉默基因的表达量；叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染的萱草幼苗，待侵染2-3次后检测被沉默基因的表达量。
5.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于重悬液的配方为：300μM乙酰丁香酮、10mMMgCl2、10mM乙磺酸和400mg/L半胱氨酸。
6.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于步骤二重悬至菌体OD600＝1.2。
7.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液等体积混合后室温黑暗静置活化3-5h。
8.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于步骤三中注射胚乳法是使用1mL带针头的无菌注射器，将活化后的侵染液注射到已发芽萱草幼苗的胚乳中。
9.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染每7d一次，重复浸染1-2次。
10.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于使用侵染液侵染萱草幼苗后在黑暗处理24h后再置于22℃，16h光照和18℃，8h黑暗的条件下培养。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210826129.2A CN115820660A (zh) | 2022-07-13 | 2022-07-13 | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210826129.2A CN115820660A (zh) | 2022-07-13 | 2022-07-13 | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115820660A true CN115820660A (zh) | 2023-03-21 |
Family
ID=85522800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210826129.2A Pending CN115820660A (zh) | 2022-07-13 | 2022-07-13 | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115820660A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116042692A (zh) * | 2022-09-30 | 2023-05-02 | 山东和正生态农业开发有限公司 | 一种萱草的遗传转化方法及其应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060235215A1 (en) * | 2002-12-26 | 2006-10-19 | Bret Cooper | Stress-related polypeptides and uses therefor |
| US20090222952A1 (en) * | 2005-11-08 | 2009-09-03 | Cropdesign N.V. | Plants Having Improved Growth Characteristics And A Method For Making The Same |
| US20120331585A1 (en) * | 2010-02-24 | 2012-12-27 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CN106939313A (zh) * | 2017-03-03 | 2017-07-11 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法 |
| CN108707622A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-10-26 | 华中农业大学 | 基于烟草脆裂病毒沉默体系提高石竹转化率的方法 |
| WO2020146949A1 (en) * | 2019-01-18 | 2020-07-23 | Frontier Agri-Science Inc. | Plants having increased tolerance to cellulose biosynthetic inhibiting herbicides |
| CN114375837A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-22 | 东北农业大学 | 一种提高萱草种子愈伤组织诱导率的方法 |
| CN114480481A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-05-13 | 东北农业大学 | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 |
-
2022
- 2022-07-13 CN CN202210826129.2A patent/CN115820660A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060235215A1 (en) * | 2002-12-26 | 2006-10-19 | Bret Cooper | Stress-related polypeptides and uses therefor |
| US20090222952A1 (en) * | 2005-11-08 | 2009-09-03 | Cropdesign N.V. | Plants Having Improved Growth Characteristics And A Method For Making The Same |
| US20120331585A1 (en) * | 2010-02-24 | 2012-12-27 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CN106939313A (zh) * | 2017-03-03 | 2017-07-11 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法 |
| CN108707622A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-10-26 | 华中农业大学 | 基于烟草脆裂病毒沉默体系提高石竹转化率的方法 |
| WO2020146949A1 (en) * | 2019-01-18 | 2020-07-23 | Frontier Agri-Science Inc. | Plants having increased tolerance to cellulose biosynthetic inhibiting herbicides |
| CN114375837A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-22 | 东北农业大学 | 一种提高萱草种子愈伤组织诱导率的方法 |
| CN114480481A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-05-13 | 东北农业大学 | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANDRÉ C VELÁSQUEZ等: "Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato", 《J VIS EXP.》 * |
| 公菲菲: "萱草属植物生物钟基因LHY的克隆及功能验证", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑）》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116042692A (zh) * | 2022-09-30 | 2023-05-02 | 山东和正生态农业开发有限公司 | 一种萱草的遗传转化方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115820686B (zh) | 一种柑橘CsGSTU18基因及其应用 | |
| CN115820660A (zh) | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 | |
| CN114480481A (zh) | 一种萱草pds基因vigs沉默体系及其应用 | |
| CN116444636B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-6及其应用 | |
| CN116425847B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-10及其应用 | |
| CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN102559676B (zh) | 水稻根特异性启动子及其应用 | |
| CN113652447A (zh) | 基于vigs的高效桃叶片基因沉默方法 | |
| CN117363629B (zh) | 一种柑橘CsGATA12基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法 | |
| CN117247939B (zh) | 基于还亮草的复杂花形态相关基因的vigs系统及其应用 | |
| CN116496371B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-5及其应用 | |
| CN115094082B (zh) | 鉴定MsPDS基因的VIGS沉默体系及鉴定方法 | |
| CN117025834B (zh) | 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用 | |
| CN114107371B (zh) | 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导转基因烟草方法 | |
| CN116496372B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-11及其应用 | |
| CN116410989B (zh) | 一种病毒诱导的三七pds基因沉默体系及应用 | |
| CN117431256B (zh) | 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 | |
| CN113170731B (zh) | 一种基于百合鳞片叶尖的高温脱毒方法及其应用 | |
| CN118222576A (zh) | 梅花pds基因vigs沉默体系及其构建方法与应用 | |
| CN114606246A (zh) | 一种trv载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法 | |
| CN117646027A (zh) | 一种基于vigs的沉默葡萄基因的方法 | |
| CN115960918A (zh) | 一种杜梨Pbr0335基因VIGS沉默体系及其构建方法与应用 | |
| CN117025626A (zh) | 烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体和应用 | |
| CN117230111A (zh) | 百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法及其应用 | |
| CN117987428A (zh) | 一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20230321 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |