CN102440186A - 使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，属于植物组培快繁技术和生物技术领域。该方法包括：百合种球病毒的检测、培养基的配制、备用、外植体灭菌和接种、外植体培养、组培苗的病毒检测等步骤，快速获得大量脱毒组培苗。本发明通过正交法获得百合直接分化成芽和无根组培苗的最佳诱导培养基配方，以及通过配制一系列浓度梯度的脱氧无环鸟苷地昔洛伟抗病毒药剂，筛选出最适脱毒浓度，脱毒效率可达到88％，不仅缩短了诱导培养周期，还具有脱毒率高，增值系数高等特点，为培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。

Description

使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法

一、技术领域

本发明使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，属于植物组培快繁技术和生物技术领域。

二、背景技术

百合是单子叶植物纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)的总称，为多年生宿根草本花卉。百合属在世界上有90余种，原产我国的约有47种，占世界总数的51％。百合栽培品种繁多，其花朵硕大，色彩丰富，花姿优美，既能作切花、盆花，又能在园林绿地中应用，且大多数百合可以食用，是上等的滋补佳品。百合素有“百年好合”之意，深受人们的喜爱。百合主要分布在中国、日本、北美和欧洲等温带地区，我国近年来的百合切花生产发展较快，在昆明、上海、深圳已形成三大生产基地。但其繁殖主要还是采用常规分球、分珠芽鳞片扦插，鳞片包埋等繁殖的方式。长期的无性繁殖使百合体内逐渐积累大量病毒致使百合患病毒病，影响百合的产量和质量。因此建立简便易行、脱毒率高的脱毒体系是减少病毒对百合的危害、恢复种性的关键问题之一。

自Stewart(1896)描述百合的坏死条纹以来，相继报道了百合的病毒病原14种。其中发生普遍，危害严重的病毒有5种，即百合潜隐病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、郁金香碎花病毒(Tulip breaking virus，TBV)、异名百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)和百合丛簇病毒(Lily rosette virus，LRV)；其他9种病毒均在栽培地区极少发生，对百合生产构不成普遍危害，如百合X病毒(Lily virus X，LVX)、百合环斑病毒(Lily ring spot virus，LRSV)、水仙花病毒(Narcissus mosaicvirus，NMV)和烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)。本发明主要对百合无症病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)病毒、百合丛簇病毒(Lily rosettle virus，LRV)进行检测。

开展百合脱毒研究最早是Phillips(1962年)，他利用百合茎尖培养脱毒成功以后，先后又有许多外国学者利用茎尖脱毒成功。目前国际上有几个国家利用这种方法获得百合无病毒苗，并在生产上大规模应用。茎尖脱毒培养的两个关键技术环节是茎尖的成活率和脱毒率。茎尖培养成活率低。褐化是降低茎尖培养成活率的首要因素。褐化的发生与许多因素有关，茎尖大小、取材季节、培养方式、激素浓度、基本培养基、培养基添加物都对茎尖褐化有影响，例如茎尖越小，褐化越严重，成活率越低。在茎尖培养时为抑制褐化的发生，需要优化上述各因子。应用抗氧化剂AC和VC也可有效抑制茎尖培养的褐化现象。鉴于此，本发明采用百合鳞茎作为材料进行脱毒苗的培养。

常用脱毒技术有茎尖分生组织培养、珠芽培养、热处理法、化学疗法及互相结合的方法。此外，花器官等其他器官培养脱毒也是一种有效的脱毒方法。现在离体培育无病毒植株已成为花卉生产的重要环节。早在1943年White就发现植物生长点附近的病毒很少甚至无病毒。1962年Phillips最早进行百合脱毒研究；1966年Mori和Hamaya通过茎尖培养获得了百合无病毒植株；1993年赵祥云利用0.3～0.8mm珠芽生长点对淡黄花百合进行离体培养，培育出的幼苗可成功地脱去烟草环斑病毒；2001年席梦利对宜兴百合脱毒培养得出，接种0.3～0.5mm的茎尖脱毒效果最好，对CMV的脱毒率达到40％，小于0.3mm的茎尖不能培养成活；2003年徐品三等发现脱毒效果因百合品种和病毒种类而有所差异，“卡萨布兰卡”百合中LSV容易脱去，脱毒率达76％，“魅丽”百合中CMV能全部脱去；2003年屈云慧等直接用茎尖脱去Elle百合CMV病毒，接种0.2～0.3mm茎尖脱毒率达43％。1994年Kim研究报道了病毒唑对CMV有较强的抑制作用效果。1999年Xu等研究了通过化学处理(病毒唑或二氢尿嘧啶)和35℃热处理生产脱去鳞茎中带有的LSV等病毒，并通过诱导东方百合Georgia品种愈伤组织获得脱毒鳞茎。2003年屈云慧等对带有CMV的亚洲百合Elle在40℃下处理5d以后，剥取0.2～0.3mm茎尖组织培养时脱毒率可达67％，而成苗率也达到48％。2001年席梦利等以宜兴百合为试材，对3种脱毒方法(茎尖培养、热处理结合茎尖培养、花药培养)进行研究，结果表明，珠芽经50±1℃热水处理40min，培养30d后，切取0.8～1.0mm茎尖培养的脱毒效果最好，脱毒率达100％，38±1℃热空气处理后切取茎尖培养也能提高脱毒效果。

因此，进行病毒脱除处理、推广无毒化栽培技术对提高百合的观赏价值和经济价值有着重要的现实意义。

主要参考文献：

[1]周晓燕.百合主要病害及其防治[J].植物保护，2002，28(1)：57-58.

[2]钟景辉，蔡秋锦.百合病害及其持续治理[J].森林病虫通讯，2000，19(2)：23，28-31.

[3]傅玉兰.花卉学[M].北京：中国农业出版社，2001.216-217.

[4]沈淑琳.百合病毒病及其检验[J].1996，10(1)：223-226

[5]王小菁，李玲.植物生长调节剂在植物组织培养的应用[M].北京：化学工业出版社.2002，9：11-12.

[6]赵祥云，程谦，邢尤美，等.百合珠芽组培及脱毒研究[J].园艺学报，1993，20(3)：284-288.

[7]席梦利，王节萍，章静娟，等.宜兴百合脱毒技术[J].江苏农业学报，2001，17(1)：492511.

[8]徐品三，栾雨时，刘纪文等.百合不定芽培养脱毒种球生产的研究[J].植物学报，2003，20(3)：3012318.

[9]洪艳华，殷广峰，张立军.百合脱毒及病毒检测技术进展[J].沈阳农业大学学报，2003，34(3)：2252227.

[10]高尚士.花卉病毒病的检疫及其消除方法[J].植物检疫，1994，(6)：3402341.

[11]KimJ Y，Lee SY，Choi J K，et al.Effect of virazole on elimination of viru2 ses(LSV and CMV)from infectedlily Plants[J].RDA Journal of Agricultural Science(Korea Republic)，1994，36：3702374.

[12]Xu PS，Niimi Y.Evaluation ofvirus2free bulbet Production by antiviral and/or heat treatment in vitro scalecultures of Lilium longiflorum‘Georgia’and L.‘Casabl2anca’[J].Journal ofthe Japanese society for HorticulturalScience，1999，68：6402647.

[13]王小菁，李玲.植物生长调节剂在植物组织培养的应用[M].北京：化学工业出版社.2002，9：11-12.

[14]刘用生，李友勇.植物组织培养中活性炭的使用[J].植物生理学通讯.1994，30(3)：214-217.

[15]阎贤伟.甜樱桃茎尖培养和快速繁殖研究[J].园艺学报，1990，17(4)：275-279.

[16]ASJES C J，BLOM-BARNHOORN G J.Air-borne field spread of tulip breaking virus，lily symptomlessvirus and lily virus X in lily affected by seasonal incidence of flying aphids and control by sprays of mineral oil，vegetable oil，insecticide and pheromone in the Netherlands[J].Acta Horticulture，1994，377：301-324.

[17]ASJ ES C J.Control of aphid-borne Lily symptomless virus and Lily mottle virus in Lilium in theNetherlands[J].Virus Research，2000，71(1-2)：23-32.

三、发明内容

本发明的目的是寻找更好的适合百合组培苗脱毒的新方法，为以后培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培提供技术基础。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，按如下步骤进行：

(1)材料选取：“西伯利亚”(Siberia)、“索邦”(Sorbonne)种球；

(2)百合种球病毒的检测：选取供试种球的球茎鳞片，提取总RNA，反转录后作为模板，采用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测，确定种球鳞片是否携带病毒。

(3)培养基的配制、备用：基本培养基为MS培养基；

采用正交法研究6-BA和NAA浓度对百合组培的影响，确定可直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，配制最佳诱导培养基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的浓度配制含抗病毒药物的培养基。抗病毒药物采用0.2u滤膜过滤除菌。

(4)外植体灭菌、接种：将检测被病毒感染的百合鳞茎用自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌10分钟，然后在70％酒精浸泡20秒。取出材料，用无菌水冲洗5-6遍。将材料切割成2.0mm×2.0mm小方块，接种于最佳诱导培养基上培养。

(5)外植体培养：在温度22±1℃，光照12h/d，光照强度1500Lx的环境条件下培养45-50天，百合鳞茎外植体直接分化成鳞茎芽和无根组培苗。进一步将叶片切下，将组培小鳞茎纵切2-4块分别接种于对照组(诱导培养基)和实验组(诱导培养基+一定浓度的抗病毒药物)上，继续培养；连续切割，继代三次后，RT-PCR检测病毒苗携带病毒的情况。

(6)组培苗病毒检测：根据检测病毒的种类：百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)，黄瓜花叶病毒(CMV)，百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus，LRV)按照已知基因序列设计特异性引物，经RT-PCR检测无扩增为阴性脱毒苗。

所述的使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于最佳诱导培养基配方：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0％蔗糖+琼脂粉6.0g/L(PH 5.8)。

所述的使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于实验组所使用的药剂脱氧无环鸟苷地昔洛伟(6-Deoxyacyclovir)的最适浓度7mg/L，脱毒率可达到88％。

研究发现，本发明通过正交法确定使百合直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，以及对百合进行脱毒所使用的脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂的最适浓度，达到脱毒效率高，时间短等优点。

本发明与现有技术相比，其显著优点是极大的提高了组培苗的脱毒效率，为培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。

四、具体实施方式

通过下面的实施例对本发明进一步的说明。

实施例：(脱毒组培苗的病毒检测)

(1)植物材料

分别以对照组和实验组的组培苗为材料。

(2)病毒RNA的提取

采用TRIzol试剂，分别对每个供试样品进行总RNA的提取，提取过程中使用的RNase-free水的配制方法：将洗净玻瓶中加满0.1％(v/v)DEPC超纯水，过夜处理后玻瓶高压灭菌；RNase-free的塑料和玻璃器皿处理方法：玻璃器皿可在150℃烘烤6小时；塑料器皿在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再高压灭菌。具体操作步骤如下：

1)供试样品直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物样品加入1ml TRIzol。样品加入TRlzol后，室温放置5min，使样品充分裂解；

2)4℃，12,000rpm离心10分钟，取上清；

3)每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相；

4)4℃，12,000rpm离心10-15min。将最上层水相转移到新管中；

5)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底；

6)RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-ffee水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

7)4℃，5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀；

8)沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

(3)病毒各基因序列的扩增

a)病毒序列PCR扩增引物的设计

根据已报道的百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)，黄瓜花叶病毒(CMV)，百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus，LRV)的外壳蛋白基因的序列设计Tm＝55℃的PCR反应特异性引物。

b)cDNA第一链的合成

采用病毒外壳蛋白基因PCR下游引物作为反转录第一链的起始引物，反转录合成反应体系如下：

将1μg总RNA置于离心管中，置于70℃水浴中10min，短暂离心后马上转移到冰中。将反应液与变性后总RNA混合，反应体系如下：

Reverse transcription 10×buffer                  2.0μl

dNTP mixture，10mM                                2.0μl

MgCl2，25mM                                       4.0μl

Recombinant

Ribonuclease inhibitor                                0.5μl

AMV reverse transcriptase(High Conc.)             1.5u

Virus coat protein gene PCR reverse primers，10mM 1.0μl

Total RNA                                         1.0μg

Nuclease-Free water to a final volume of          20μl

反转录反应在42℃下进行15min，反应完成后95℃，5min失活反转录酶，转入4℃保温5min。-20℃保存备用。

c)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

以反转录cDNA产物为模板，设置不加模板cDNA的PCR反应为阴性对照，按如下体系进行：

10×PCR reaction buffer(Mg2+plus)                 2μl

dNTP mixture，10mM                                1μl

Virus coat protein gene PCR forward primer，10mM  1μl

Virus coat protein gene PCR reverse primer，10mM  1μl

Reverse transcription cDNA products               1μg

Taq，5U/μl                                       0.2μl

Nuclease-Free water to a final volume of          20μl

PCR程序：

94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，SYBR Green染色，紫外灯下观察，检测有无目标扩增片段，照相记录。

(4)RT-PCR产物检测

当不加模板cDNA的阴性对照PCR反应无目标扩增产物时，有目标扩增条带的个体为病毒感染植株，无目标扩增条带的个体为无病毒感染植株，即脱毒植株。

Claims (3)

1.使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)材料选取：“西伯利亚”(Siberia)、“索邦”(Sorbonne)种球；

(2)百合种球病毒的检测：选取供试种球的球茎鳞片，提取总RNA，反转录后作为模板，采用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测，确定种球鳞片是否携带病毒；

(3)培养基的配制、备用：基本培养基为MS培养基；

采用正交法研究6-BA和NAA浓度对百合组培的影响，确定可直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，配制最佳诱导培养基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的浓度配制含抗病毒药物的培养基。抗病毒药物采用0.2u滤膜过滤除菌。

(4)外植体灭菌、接种：将检测被病毒感染的百合鳞茎用自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌10分钟，然后在70％酒精浸泡20秒。取出材料，用无菌水冲洗5-6遍。将材料切割成2.0mm×2.0mm小方块，接种于最佳诱导培养基上培养。

(5)外植体培养：在温度22±1℃，光照12h/d，光照强度1500Lx的环境条件下培养45-50天，百合鳞茎外植体直接分化成鳞茎芽和无根组培苗。进一步将叶片切下，将组培小鳞茎纵切2-4块分别接种于对照组(诱导培养基)和实验组(诱导培养基+一定浓度的抗病毒药物)上，继续培养；连续切割，继代三次后，RT-PCR检测病毒苗携带病毒的情况。

(6)组培苗病毒检测：根据检测病毒的种类：百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)，黄瓜花叶病毒(CMV)，百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus，LRV)按照已知基因序列设计特异性引物，经RT-PCR检测无扩增为阴性脱毒苗。

2.根据权利要求书1所述的使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于最佳诱导培养基配方：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0％蔗糖+琼脂粉6.0g/L(PH 5.8)。

3.根据权利要求书1所述的使用脱氧无环鸟苷地昔洛伟药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于实验组所使用的药剂脱氧无环鸟苷地昔洛伟(6-Deoxyacyclovir)的最适浓度7mg/L，脱毒率可达到88％。