KR101342084B1

KR101342084B1 - 오이과실모틀모자이크바이러스 핵산부터 유래된 약독 바이러스 및 이의 전장 재조합 클론

Info

Publication number: KR101342084B1
Application number: KR1020100127256A
Authority: KR
Inventors: 이긍표; 이선주
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2013-12-18
Also published as: KR20120065906A

Abstract

본 발명은 박과식물 및 담배식물체 재배시 큰 피해를 야기하는 CFMMV, CGMMV, KGMMV, ZGMMV를 포함하는 토바모바이러스 (tobamovirus)의 방제를 위하여 이들 바이러스와 핵산서열의 상동성이 매우 높은 약독 CFMMV 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 발현 벡터의 전사체로 접종된 식물세포 및 식물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 약독 바이러스를 포함하는 토바모바이러스 방제용 조성물 및 상기 약독바이러스를 이용한 방제방법에 관한 것이다.
본 발명은 무병징 박과식물 감염성 바이러스의 실험실 내 제조가 가능한 것으로 재배 현장에서 박과식물의 바이러스 교차방어용으로 사용이 가능하다.

Description

오이과실모틀모자이크바이러스 핵산부터 유래된 약독 바이러스 및 이의 전장 재조합 클론 {Symptom Attenuated Virus from Nucleic Acid of Cucumber Fruit Mottle Mosaic Virus and Full-length Clone of the Same}

본 발명은 경미한 바이러스 증상의 오이과실모틀모자이크바이러스의 약독 바이러스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 박과식물 또는 담배식물체 감염성 바이러스인 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumver fruit mottle mosaic virus), CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV (Kyuri green mottle mosaic virus), ZGMMV (Zucchini green mottle mosaic virus)를 포함하는 토바모바이러스 (Tobamovirus)의 방제 가능한 오이과실모틀모자이크바이러스의 약독바이러스 및 이의 전장 재조합 클론에 관한 것이다.

최근까지 국내외에 알려져 있는 식물 바이러스병은 약 1,000여종에 달하며, 바이러스에 의한 피해액은 세계적으로 연간 200억불 정도로 추정된다. 식물바이러스는 농작물을 포함하여 살아있는 모든 식물체를 가해할 수 있을 뿐 아니라, 이병식물체의 즙액이나, 오염된 종자와 토양은 물론 매개충 체내에서 증식이 가능하여 대면적 발생의 위험이 연중 상존한다. 우리나라에서도 벼와 맥류를 비롯한 각종 작물의 바이러스병이 증가하고 있는 실정이며, 특히 과수, 채소, 화훼 등 경제적 부가가치가 높은 원예작물에 바이러스병의 피해가 심하다. 생물학적 특성상 약제를 이용한 방제가 불가능하고 전신성이며, 영양번식을 하는 원예작물의 경우에는 후대까지 계속 전염되므로 경제적 피해가 더욱 커지고 있으므로 유전공학기법을 이용한 바이러스병 방제에 관한 연구가 더욱더 요구되고 있다 (유전공학기법을 이용한 방제기술).

오이과실모틀모자이크바이러스 (Cucumber Fruit Mottle Mosaic Virus; 이하 CFMMV)는 토바모바이러스 (Tobamovirus) 속(屬)에 속하는 바이러스로서 오이, 호박, 멜론, 참외, 수박, 박 등의 박과식물 (Cucurbitaceae)과 같은 농작물 및 담배식물을 숙주로 한다. CFMMV와 같이 박과식물 생육에 피해를 야기하는 현재까지 알려진 토바모바이러스들에는 cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV), Zucchini green mottle mosaic virus (ZGMMV) 등이 있으며, 이들 바이러스에 감염되면 잎의 모자이크 및 과실의 모틀증상을 동반하여 식물의 생육을 현저히 왜화시키거나, 총생 및 모자이크를 동반한 기형, 괴저증상을 야기한다. 따라서 박과식물의 재배시 생육과 과실의 상품성을 현저히 감소시킬 수 있다. 국내의 경우도 1999년 이후 지속적으로 이들 바이러스에 의한 피해가 보고되고 있다.

이러한 박과식물 감염성 바이러스들의 병해는 방제하는 방법으로, 약독 바이러스에 의한 교차방어 (cross protection)을 이용할 수 있다. 교차방어에 의한 바이러스의 방제는 약독 바이러스에 감염된 식물이 그 바이러스와 같거나 매우 근연한 바이러스에는 감염이 억제되는 현상을 의미하는 것으로 병원성 (강독) 바이러스와 같은 계통으로서 병의 징후가 없거나 극히 경미한 바이러스를 식물에 접종하여 감염시켜, 병원성 바이러스에 의한 감염을 방제하는 방법이다.

식물바이러스 방제를 위한 교차방제기술의 사용은 대표적으로 토마토에 피해를 주는 토마토모자이크바이러스 (Tomato mosaic Virus; ToMV)와 매우 다양한 기주 범위를 갖는 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus; CMV)에서 약독 바이러스를 이용해 왔으며, 최근에는 일본에서 CMV약독 바이러스의 특징이 특정 위성RNA (satellite RNA)를 갖는 점에 착안하여 이를 이용한 CMV 방제를 위한 위성RNA 이용에 관한 특허를 받았고 지속적으로 여러 위성RNA에 대한 특허를 신청한 바 있다. 그러나, 박과식물 감염성 토마모바이러스의 방제에는 사용이 불가능한데, 이는 ToMV는 박과식물을 숙주로 하지 않고, CMV는 바이러스의 염기서열 상동성이 매우 낮아 토바모바이러스를 교차방어할 수 없기 때문이다.

또 다른 박과식물의 방제법으로는 현재 바이러스 방제를 위하여 종자 건열처리 (80℃에서 약 3일간)를 이용하여 박과식물 종자 내에 존재하는 토바모바이러스의 불활성화를 야기하여 방제하는 방법 등을 사용하고 있다. 그러나, 이 방법은 종자전염으로 발생하는 바이러스병의 방제로 실제 작물의 재배 중에 토양 및 접촉전염 등으로 발생하는 바이러스병을 방제할 수는 없다. 이에, 본 발명자는 실험실 내에서 감염성 오이과실모틀모자이크바이러스를 생산하는 기술을 개발하였으며, 특히 감염시 병징이 없는 약독 무병징 바이러스 (CFMMV-SA)를 제조하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 오이과실모틀모자이크바이러스 유래 식물 감염성 핵산분자로부터 유래한 약독바이러스를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 CFMMV유래 식물 감염성 핵산분자로부터 유래한 약독바이러스를 포함하는 재조합 발현벡터, 이 재조합 발현벡터의 전사체로 감염된 식물세포 및 식물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터의 전사체 또는 이 전사체에 감염된 식물의 즙액을 포함하는 토바모바이러스 방제용 조성물 및 상기 발현벡터의 전사체 또는 이 전사체에 감염된 식물의 즙액을 박과식물의 유모에 접종하여 박과식물 감염성 바이러스들인 CFMMV, CGMMV, KGMMV, ZGMMV를 포함한 토바모바이러스 (tobamovirus) 감염을 방제하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 박과식물 및 담배식물체 재배시 큰 피해를 야기하는 CFMMV, CGMMV, KGMMV, ZGMMV를 포함하는 토바모바이러스 (tobamovirus)의 방제를 위하여 이들 바이러스와 핵산서열의 상동성이 매우 높은 약독 CFMMV 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 발현 벡터의 전사체에 의해 감염된 식물세포 및 식물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 약독 바이러스를 포함하는 토바모바이러스 방제용 조성물 및 상기 약독바이러스를 이용한 방제방법에 관한 것이다.

이하 구체적으로 본 발명을 설명한다.

본 발명은 오이과실모틀모자이크바이러스 핵산부터 유래하며 아미노산의 일정 위치에 돌연변이가 일어나 증상이 경미한 것을 특징으로 하는 약독 바이러스 및 서열번호17의 아미노산서열, 이 아미노산을 코딩하는 핵산서열, 서열번호1의 핵산서열을 포함하는 약독바이러스를 제공한다.

본 명세서의 오이과실모틀모자이크바이러스는 바이러스유전자은행에서 분양받은 오이 건조잎에서 유래한다. 오이에서 증식한 CFMMV는 다른 토바모바이러스와 마찬가지로 유전정보가 RNA에 존재하는 positive sense-ss (single stranded)RNA 바이러스다. 이 바이러스는 증식하는 과정에서 기주 내에서 다양한 돌연변이로 인한 유전적 다양성을 이루기 때문에 cDNA를 제작할 경우 다양한 돌연변이 서열이 클로닝될 수 있다. 이 방법을 이용하여 다양한 감염성을 갖는 전장 CFMMV 클론을 제작하였으며, 이중 강독 바이러스 (CFMMV-RM) 및 약독 바이러스로 적용될 수 있는 무병징 (식물체에 병징을 전혀 야기하지 않는)의 바이러스를 선별하여 본 발명의 오이과실모틀모자이크바이러스 (본 발명에서는CFMMV-SA라 명명함)를 완성하였다. 구체적으로 서열번호 18의 아미노산 서열의 위치 799, 876, 1139 중에서 선택된 1이상의 위치에서 돌연변이가 일어난 약독 바이러스를 완성하였으며, 더욱 바람직하게는 상기 위치 799는 루신 (Leucine)에서 프롤린 (Proline)으로, 위치 876은 글루타메이트 (Glutamate)에서 글리신 (Glycine)으로, 위치 1139는 발린 (Valine)에서 글리신 (Glycine)으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스를 완성하였다.

또한 본 발명은 상기 약독 오이과실모틀모자이크바이러스의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 또한 이 재조합 벡터 전사체의 접종으로 감염된 식물세포 또는 식물을 포함하며 이 식물은 바람직하게는 박과식물에 해당한다. 또한 이 식물은 바람직하게는 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumver fruit mottle mosaic virus), 오이녹반모자이크바이러스(cucumber green mottle mosaic virus), 큐리녹반모자이크바이러스( Kyuri green mottle mosaic virus) 또는 쥬키니녹반모자이크 바이러스 (Zucchini green mottle mosaic virus)에 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는 식물에 해당한다.

또한, 본 발명은 상기 약독바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 토바모바이러스 (tobamovirus) 방제용 조성물을 제공한다. 특히, 박과식물 또는 담배 식물체의 방제에 효과가 있으며, 상기의 방제되는 토바모바이러스에는 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumber fruit mottle mosaic virus), 오이녹반모자이크바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus), 큐리녹반모자이크바이러스 (Kyuri green mottle mosaic virus), 쥬키니녹반모자이크 바이러스 (Zucchini green mottle mosaic virus)를 포함한다

본 발명은 또한, 상기 오이과실모틀모자이크 바이러스 약독 바이러스 또는 상기 약독 바이러스에 감염된 식물의 즙액을 식물에 접종하는 것을 특징으로 하는 식물 토바모바이러스의 방제 방법을 포함하며, 특히 박과식물 방제법으로 활용될 수 있다. 또한 이 방제법은 특히 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumber fruit mottle mosaic virus), 오이녹반모자이크바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus), 큐리녹반모자이크바이러스 (Kyuri green mottle mosaic virus), 쥬키니녹반모자이크 바이러스 (Zucchini green mottle mosaic virus)를 방제하는데 활용 가능하다.

방제법으로는 여러 가지가 있지만, 예를 들면, 약독 바이러스를 0.01M 인산 완충액 (pH 약 7.0)으로 10~50㎍/㎖로 희석하여, 이것을 카보런덤 (carborundum), 세라이트, 벤토나이트 등을 소량 더해 식물에 접종하는 것을 포함한다.

본 발명에서, 상기 약독 바이러스의 식물의 접종 부위는 각별히 제한 되지 않지만, 자엽기 (子葉期) 등 어린 식물일수록 감염율이 높기 때문에 바람직하다.

국내 박과식물의 토바모바이러스 (tobamovirus)에 의한 재배피해는 매우 막대하며, 남부지역을 중심으로 급속히 확산되고 있어 그 방제가 절실하나 농약으로는 현재까지 방제하기 어려운 상황이다. 지금까지 종자의 열처리를 통하여 바이러스의 불활성화를 유도하여 발병을 억제시키고 있지만, 본 발명은 무병징 박과식물 감염성 바이러스의 실험실 내 제조가 가능한 것으로 재배 현장에서 박과식물의 바이러스 교차방어용으로 사용이 가능하다. 또한 본 발명의 약독 바이러스는 경제적 작물에 병징을 거의 일으키지 않아서 품질을 저하시키지 않으며, 안정성 검사로 인하여 강한 병원성 회복이 일어나지 않으며, 강독에 대한 충분한 간섭작용을 하는 바 약독 바이러스로 이용되기 위한 필수 요소를 갖추고 있다. 따라서 본 발명의 활용으로 박과작물 감염성 바이러스 방제비용 절감이 가능하여 막대한 경제적 효과를 제공한다.

도 1은 CFMMV-SA과 RM 의 전장 클로닝과 감염성 클론 스크리닝에 관여하는 순서도의 개략도이다.
도 2는 T7 프로모터를 포함한 감염성 CFMMV 클론의 구축을 위한 개략도이다. 이때, wild-type CFMMV와 구분할 수 있는 KpnI 제한효소 자리를 삽입할 수 있도록 A, B 두 파트로 나누어 클론을 구축하였다.
도 3은 CFMMV-SA 클론 구축 과정을 나타낸 모식도와 클로닝 과정상의 전기영동 확인 사진이다. (A)는 CFMMV-A(3552bp)와 -B(3010bp)의 PCR 증폭 (B)는 A 파트의 pUC19로의 클로닝 (C) B 파트의 pCFMMV-A로의 클로닝 (D) CFMMV 전장 클론 완성.
도 4는 CFMMV-SA 클론의 SphI을 이용한 선형화 과정(A)과 시험관내 전사체를 1% 아가로스 겔에 전기영동한 사진이다(B). 이를 N. benthamiana의 5~6 본엽에 접종하였다.
도 5는 CFMMV-wild type과 CFMMV-SA 클론 접종 시 병징의 모습이다. N. benthamiana는 16dpi (A), Melon은 6dpi (B), Cucumber는 10dpi (C), Squash는 12dpi (D)에서의 증상을 보여주는 사진이다.
도 6은 index plant에 접종하였을 때, CFMMV-SA과 wild-type과의 증상과 접종 상위엽의 RT-PCR 사진이다. (A) D.stramonium에 접종시 나타나는 증상 (B) C.amaranticolor접종시 나타나는 증상.
도 7은 CFMMV-SA의 RT-PCR 증폭 프라이머를 화살표로 나타낸 것이며, 각각에 대한 RT-PCR 전기영동 사진이다. (A) KpnI 자리를 중심으로 제작한 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 후 KpnI 처리 하였을 때, 부분 절편화 된 사진 (B) 6.5kb의 CFMMV 전장을 증폭한 사진 (C) Coat Protein(외피 단백질) 전체를 증폭하여 검정한 사진.
도 8은 N. benthamiana와 멜론(A 왼쪽), C.amaranticolor의 접종엽, 상위엽(A 오른쪽)의 Gel double diffusion(GDD) 실험 사진이다. (B)는 웨스턴 블롯 결과이다. 1~4 은 N. benthamiana이며, 5~8은 멜론의 외피단백질이 검출된 밴드이다.
도 9는 CFMMV-SA이 접종된 멜론의 과실이며 이를 RT-PCR(A)과 Tissue printing(B) 한 사진이다.
도 10은 CFMMV-SA로부터 CFMMV-RM을 클로닝한 개략도이다.
도 11은 CFMMV-RM의 클로닝 과정이다.
도 12은 새로 구축한 CFMMV-RM의 시험관 내 전사체를 전기영동한 사진과 이를 N. benthamiana에 접종시 나타난 증상이며, 다시 바이러스가 증식된 N. benthamiana의즙액을 D. stramonium에 접종하여 나타난 증상을 보여주는 사진이다.
도 13은 CFMMV-RM을 증식 기주인 N. benthamiana와 멜론, 오이에 접종하였을 때의 병징 사진이다.
도 14는 (A) CFMMV CP 검정용 프라이머를 이용하여 RT-PCR한 결과 사진이다. 건강한 식물체 (Lane 1: Negative control), CFMMV wild-type (Lane 2); CFMMV-RM 감염된 오이의 4번째 접종 상위엽, 23번째 접종 상위엽과 과실 (Lane 3,4,5); 멜론의 4번째 접종 상위엽, 26번째 접종 상위엽과 과실 (Lane 6,7,8) (B) 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아마이드겔에 전기영동하여 Coomassie brilliant blue로 염색한 사진 (C) 웨스턴 블롯, Cont: 건강한 N. benthamiana (Negative control), CFMMV-wildtype이 감염된 N. benthamiana (Possitive control), Cu: CFMMV-RM에 감염된 오이, Me: 멜론, Nb: N.benthamiana와 단백질 마커 (lane M).
도 15는 CFMMV-RM에 감염된 오이(B)와 멜론(C) 과실에서의 Tissue printing 사진이다. (A)는 건강한 식물체의 Tissue printing 사진이다.
도 16는 CFMMV-SA와 -RM4, -RM8, wild-type CFMMV의 아미노산 서열의 차이를 나타낸 표이다.
도면 17 은 CFMMV-SA의 클론이 구축된 벡터의 개열지도이다.
도면 18 은 CFMMV-SA의 핵산의 염기 서열이다.
도면 19 는 CFMMV-RM4의 핵산의 염기 서열이다.
도면 20 은 CFMMV-RM8의 핵산의 염기 서열이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 더욱 상세하게 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예1 > 오이과실모클모자이크바이러스 ( CFMMV ) 약독 바이러스의 채취와 동정

바이러스유전자은행 (서울여대, 은행장 류기현)에서 분양받은 CFMMV가 감염된 오이 건조잎을 0.01M의 인산완충액 (pH 7.2)과 1:1,000 (w/w)의 농도로 유발에서 마쇄하여 접종액을 제조하였다. 제조된 접종액을 오이 자엽에 50㎕ 분주하고 300 메쉬 (mesh)의 탄소가루 (carborundum)과 같이 물리적 방법으로 접종하였다. 접종 후 15일 째 병징이 나타나는 상위 감염잎을 다시 동일한 완충액에 1:10 (w/w)의 농도로 유발에 마쇄하고 지표식물 중의 하나인 Chenopodium amaranticolor (명아주)에 접종하였다. 접종 후 7일째에 작은 괴사반점을 하나씩 오려내어 증식기주인 Nicotiana benthamiana (야생담배)에 접종하여 증식하였다.

< 실시예2 > 오이과실모클모자이크바이러스 ( CFMMV ) 의 동정 및 순화

N. benthamiana에서 증식된 CFMMV 각각은 다시 지표식물인 Chenopodium amaranticolor (명아주)에 접종하여 생물학적 특성이 동일함을 확인하였고, 확인된 개체들은 다시 N. benthamiana에서 1달간 증식시켰다. 증식된 개체들에서 CFMMV를 순화하였고, 전자현미경 검경을 통하여 토바모바이러스임을 확인하였다.

< 실시예3 > CFMMV 의 RNA 게놈에 대한 클로닝과 핵산염기서열

CFMMV 가 감염된 N. benthamiana 에서 병징이 발현된 잎과 순화된 CFMMV 비리온 (virion) 에서 RNA 만을 순수 분리하였다.

< 실시예3 -1> CFMMV 의 전장 cDNA 의 카피

단리 정제한 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 이용된 프라이머는 표 1에 기재되어 있다. RT-PCR은 총 RNA 2㎍, 1X 완충액, 10mM dNTP, 1pM 프라이머(GPL 60), 0.05M DTT, 40U RNase Inhibitor, 및 200U SuperscriptIII 역전사효소를 포함한 반응액 50㎕를 이용하여 실시하였다.

실제 클로닝하여 얻은 바이러스와 wild-type 바이러스와의 구분을 위하여 KpnI 제한효소 자리를 삽입할 수 있도록 전장바이러스를 2부분 (A 파트: 3552bp, B 파트: 3010bp) 으로 나누어 클로닝을 진행하였다 (도 2).

PCR은 다음이 포함된 최종 50㎕ 반응액을 이용하여 수행하였다: 2㎕ 제1쇄 cDNAs, 1x 완충액, 0.5 mM dNTP, 0.5 pM 프라이머 및 Ex taq 중합효소 (Takara). PCR은 다음의 온도 조건에서 실시하였다: 94℃에서 5분, 이어 94℃에서 30초, 58℃에서 40초 및 72℃에서 3분을 35번 순환; 최종적으로, 72℃에서 10분 동안 연장반응시켰다 (도 3).

CFMMV 전장 클론 구축과 RT-PCR 검정을 위한 프라이머

프라이머	프라이머 서열(5'→3')	사이즈 및 증폭 위치
GPL57	GGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGATAAAAGTTTTTTACATTGAA (서열번호 9)	3552bp, CFMMV-A
GPL58	GAGAGGTACCGGCCACAGAGGCATACATAGACAGA (서열번호10)
GPL59	GAGAGGTACCAAATAGCAATTACAGCAACT ATCCGT (서열번호11)	3010bp, CFMMV-B
GPL60	GAGATAAGCATGCTGGGCCCCTACCCGGGGCAAA (서열번호12)
GPL88	ACGCTTTTAAAAGCGGGTTATGCTG (서열번호13)	821bp, CFMMV RdRp
GPL89	GGAGGCAGATCCACAAAATCGAAAT (서열번호14)
SJ15	ATGTCTTACTCTACTTCTGGTTTGC (서열번호15)	488bp, CFMMV CP
SJ16	TCACTTCGAGGTAGACGACGA (서열번호16)

< 실시예3 -2> T7 프로모터를 가지는 CFMMV 전장 cDNA 클론의 구축

T7 프로모터를 가지는 CFMMV 클론을 구축하기 위한 backbone을 얻기 위하여 pUC19 클로닝 벡터의 멀티플-클로닝 위치의 SacI-KpnI 을 결손시켰다. 이에 CFMMV의 5’ NTR과 RdRp의 중간 부분까지 약 3552bp 의 CFMMV-A 파트의 PCR 산물 또한 SacI-KpnI 을 이용하여 절단하여 삽입하였다. 상기의 클론을 선발한 후 다시 KpnI-SphI으로 절단하고, A 파트에 이어진 RdRp 에서부터 3’ NTR까지의 3010bp의 B파트 PCR 산물 역시 KpnI-SphI으로 절단하여 삽입하였다.

최종적으로 자연상에 존재하는 바이러스에는 없는 제한효소 KpnI 이 삽입된 전장 CFMMV 클론을 완성하였다 (도 3). 이를 ‘CFMMV-SA’로 명명하였다.

< 실시예3 -3> CFMMV - SA ( 약독 바이러스)의 핵산 염기서열 분석

CFMMV-SA 클론의 핵산 염기서열 분석을 솔젠트 사에 의뢰하여 전장 핵산 염기서열의 정보를 얻었다. 이를 CFMMV 서열 (GenBank/ accession NC_002633)과 얼라인먼트 (alignment)를 하였을 때 전체 게놈은 98.7%의 상동성을 나타내었다.

CFMMV의 RNA-의존 RNA 중합효소의 핵산 염기서열은 98.4%, Coat protein(CP)는 99.8%, Movement protein(MP)는 99.6%의 상동성을 보였으며, 아미노산 서열은 RNA-의존 RNA 중합효소의 경우 96.5%, CP는 99.8%로 단 하나의 아미노산의 변이만이 나타났고, MP의 경우 100% 상동성을 보였다.

Wild-type의 CFMMV와 비교하여 가장 변이가 심했던 부분을 NheI-SalI(1285bp-4740bp)을 이용하여 재조합 클론을 제작하였다.

< 실시예3 -4> CFMMV - RM (강독 바이러스)의 재조합 cDNA 클론의 구축

아미노산 서열 분석 결과 변이가 심한 RNA-의존 RNA 중합효소에 존재하는 NheI-SalI 제한효소 자리를 이용하여 3455bp의 CFMMV 게놈을 다시 클로닝하였다 (도 10).

상기의 방법으로 CFMMV 감염 N. benthamiana의 잎에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 표 1에 제시한 T7 프로모터를 포함한 프라이머 세트를 이용하여 전장의 CFMMV 게놈을 PCR로 증폭하였다.

PCR은 다음이 포함된 최종 50㎕ 반응액을 이용하여 수행하였다: 2㎕ 제1쇄 cDNAs, 1x 완충액, 0.5mM dNTP, 0.5 pM 프라이머 (GPL 57, 60) 및 Ex taq 중합효소 (Takara). PCR은 다음의 온도 조건에서 실시하였다: 94℃에서 5분; 이어 94℃에서 30초, 58℃에서 1분 및 72℃에서 7분의 35번 순환; 최종적으로, 72℃에서 10분 동안 연장반응 시켰다.

증폭한 총 6562bp의 전장 CFMMV를 NheI-SalI으로 절단하였으며, CFMMV-SA 클론 역시 NheI-SalI 처리하여 제거하였다. 이를 접합하여 새로운 전장의 CFMMV cDNA 클론을 완성하였으며, 이를 ‘CFMMV-RM’이라고 명명하였다 (도 11).

< 실시예4 > 시험관 내에서의 CFMMV 의 생산

구축한 두 종류의 전장의 CFMMV cDNA 클론 2㎍을 SphI 처리를 하여 선형화 하였으며 제한효소 처리 후에는 DNA를 Klenow enzyme으로 blunting 시킨 다음 PCI(25:24:1)로 정제하였다. Ambion사의 mMASSAGE mMACHINE kit을 이용하여 In vitro transcript (IVT)를 제작하였다. 1X완충액, 1X NTP/캡 유사체 (m7GpppG), 2㎕의 T7 RNA 중합효소 (RNase 억제제 포함) 및 2㎍ SphI-선형화 플라스미드 DNA가 포함된 20㎕의 반응액을 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, DNase I을 1㎕ 첨가하고 추가적으로 15분 동안 반응시켰다.

제작된 IVT는 전기영동결과 약 6.5kb의 RNA transcript를 보여주었으며, 이는 CFMMV 바이러스 RNA genome이 합성되었음을 의미한다 (도 4, 12).

< 실시예5 > 두 종류의 CFMMV cDNA 클론의 감염성 확인

인위 생산된 바이러스의 감염성의 확인을 위하여 IVT를 index plant인 Chenopodium amaranticolor, Datura stramonium과기주식물인N. benthamiana, Early hanover(멜론), True lemon(오이), Black beauty(쥬키니 호박)에 접종하였다.

이때, CFMMV-SA의 경우 증식 기주인 N. Benthamiana와 멜론, 오이, 쥬키니 호박에서는 병징을 보이지 않았고 (도 5), 기존에 알려진 index plant인 C. amaranticolor에는 local lesion이 관찰되었으며 D. stramonium에도 chlorotic lesion이 형성되었다 (도 6). CFMMV-RM은 기주 식물인 N. benthamiana와멜론, 오이, 쥬키니 호박에서 전형적인 모틀과 모자이크 병징을 나타내었다. Index plant인 D. stramonium에 local lesion이 관찰되었다 (도 12, 13).

< 실시예5 -1> RT - PCR 검정

병징이 나타나지 않은 CFMMV-SA 감염된 N. benthamiana는 우선 CFMMV A, B 파트의 클로닝에 사용된 프라이머 세트인 GPL 57과 60을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 다음이 포함된 최종 20㎕ 반응액을 이용하여 수행하였다: 2㎕ 제1쇄 cDNAs, 1x 완충액, 0.25mM dNTP, 0.5 pM 프라이머 및 Ex taq 중합효소(Takara). 전장 RNA를 증폭하기 위한 PCR은 다음의 온도 조건에서 실시하였다: 94℃에서 5분; 이어 94℃에서 30초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 7분의 35 싸이클; 최종적으로, 72℃에서 10분 동안 연장반응 시켰다. 더욱 정확한 검정을 위하여 wild type에는 존재하지 않는 제한효소 자리인 KpnI을 중심으로 제작한 GPL 88, 89 primer를 이용하여 821bp의 CFMMV 게놈 일부가 증폭되었음을 확인하였으며, 이를 KpnI으로 처리 한 결과 일부 절단된 것을 확인할 수 있었다 (264, 557, 821bp). 또한 SJ 15, 16 프라이머 세트를 이용하여 CP 검정을 하였으며 온도조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분; 이어 94℃에서 30초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 1분의 35 싸이클; 최종적으로, 72℃에서 10분(도 7).

이는 인위 생산한 CFMMV-SA이 무병징 전신 감염성 클론임을 핵산수준에서 검정할 수 있는 결과이다.

전형적인 병징을 나타낸 CFMMV-RM의 감염체에서 N. benthamiana, 오이, 멜론에서 총 핵산을 추출한 후 RT-PCR을 수행하였다. CP를 증폭하기 위하여 표 1에 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 이때, 모든 식물체에서 488bp의 CP가 검출되었다(도 14).

< 실시예5 -2> Gel double diffusion ( GDD ) 분석

CFMMV-SA의 혈청학적 분석을 위하여 GDD (gel double diffusion)를 통하여 감염 여부를 검정하였다. 우선 3차 증류수 100ml에 아가로스 0.8g을 넣고 고온에서 녹인 후 온도가 떨어지면 Sodium Azide(NaN₃) 0.2g을 넣고 9㎝ 페트리디쉬에 두께 0.5㎝의 gel을 만든다.

여기에 직경 5mm로 간격 4mm를 두어 육각형의 형태로 만들어 준 후 8% sucrose 용액과 잎을 함께 갈아 얻은 sample의 즙액을 넣고, 가운데 구멍에는 antibody를 넣어 주어 실온에서 관찰하였다.

16시간 후 CFMMV의 wild type을 계대 접종한 C. amaranticolor와 합성된 IVT를 감염시킨 C. amaranticolor의 접종엽과 그 상위엽에서 추출된 즙액과 면역반응을 알 수 있는 침강선이 나타나 IVT로 감염시킨 경우에도 바이러스가 증식하고 있음을 확인하였다. 또한 N. benthamiana와 멜론에서도 침강선을 확인하였다. (도 8 A)

< 실시예5 -3> 웨스턴 블롯 분석

CFMMV-SA (약독 바이러스)와 CFMMV-RM (강독 바이러스) 감염식물에서의 웨스턴 블롯 분석을 하기 위하여, 단백질 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 분리하고 전기전이 장치 (Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기-블롯팅 방식으로 NC 막에 전이시켰다. Blotting된 membrane을 잘 분리하여 SNAP-id system (Millipore Co.)으로 옮겨 blocking,1^st antibody (1:1000KGMMV)binding, washing, 2^nd antibody (1:7500;Anti-RabbitIgGApconjugate, PromegaCo.) binding, washing순서로 membrane의 단백질에 2^nd antibody까지 binding 하였다. Binding이 끝난 membrane은 alkaline phosphatase (AP) solution (100mM Tris-Cl, pH8.0; 100mM NaCl, 5mM MgCl2)으로 1분간 반응시킨 후, alkaline phosphatase에 대한 Western Blue stabilized substrates (Promega Co.)를 1mL 첨가하였다.

그 결과 발색하는 밴드를 확인하였으며 이에 따라 증식하고 있는 CFMMV의 coat protein이 발현되고 있음을 검정할 수 있었다 (도 8, 14).

< 실시예5 -4> 과실에서의 바이러스 증식 확인

CFMMV-SA 감염된 early hanover (멜론) 식물체를 유리온실에서 생육하여 과실을 얻어 바이러스가 과실까지 도달하여 감염을 일으키는지 확인하기 위하여 GPL 88, 89 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR과 tissue printing을 통하여 검정하였다.

CFMMV-RM 역시 white wonder (오이), early hanover (멜론) 식물체를 유리온실에서 생육하여 잎과 과실에서의 증식을 확인하기 위하여 SJ 를 이용하여 RT-PCR을 수행하였으며, Tissue printing을 통하여 검정하였다. RT-PCR은 과경과 근접한 과육의 일부를 취하여 RNA를 추출한 후, 각 프라이머로 증폭하였다. RNA를 주형으로 하여 one-step RT-PCR premix kit(intronbio co.)를 사용하여 42℃ 30분, 94℃ 5분을 주었으며, 94℃ 30초 58℃ 40초 72℃ 1분 30초 35번의 순환을 하였으며, 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. Fruit tissue printing 검정을 위하여 과실을 약 1-2mm 두께로 Slice하여 nitrocellulose membrane에 약 20초간 압착 시키고, 그 membrane을 TBS buffer에 10분간 침지하였다. SNAP-id system (Millipore Co.)을 통하여 웨스턴 블롯과정과 동일하게 1^st antibody (1:1000KGMMV)와 2^nd antibody (1:7500;Anti-Rabbit IgGAp conjugate, PromegaCo.)를 binding 하여 발색하였다. 결과적으로 과실전체에서 바이러스가 증식하고 있음을 핵산과 단백질의 검출로 확인하였으며, 특히 과실에서는 CFMMV-SA와 CFMMV-RM 모두 무병징이 확인되었으며 생육에 지장이 없이 바이러스가 증식하고 있음을 확인하였다(도 9, 15).

< 실시예6 > CFMMV - RM 의 핵산 염기서열과 분석

CFMMV-RM의 선발된 클론 중 2개의 클론 (CFMMV-RM4, -RM8)을 솔젠트사에 핵산염기서열 분석을 의뢰하였다. 이 핵산 염기서열을 바탕으로 아미노산 서열을 분석하였다. CFMMV-SA와 비교하였을 때, RM4는 4개의 아미노산의 변이를 보였으며, RM8은 3개의 아미노산의 변이를 나타내었다. 결론적으로 병징을 나타내는 바이러스 (2개의 바이러스 클론과 wild type 바이러스)와 병징을 나타내지 않는 바이러스 (CFMMV-SA)는 단 3개의 아미노산, Leucine → Proline, Glutamate → Glycine, Valine → Glycine 의 변이만이 확인 되어, 이 3개의 아미노산이 병징을 약화시키는 요인이라는 것을 예측할 수 있었다.

< 실시예7 > CFMMV - SA ( 약독 바이러스)의 안정성

CFMMV-SA의 유전적 안정성을 정확하게 스크리닝 하기 위하여, CFMMV-SA의 전사체를 N. benthamiana에 기계적 접종하였으며, 초기 감염과 그 후의 계대에도 약독바이러스로서의 특성을 유지하고 있는지와 RT-PCR을 통한 증식 여부를 검정하였다.

그 결과 접종 후 7일 째 부터 총 3회 계대 배양 하였을 때 여전히 약독의 병징을 유지하였고 RT-PCR 결과에서도 바이러스가 정상적인 증식을 하고 있음이 확인되었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 18의 아미노산 서열의 위치 799, 876 및 1139 위치에서 돌연변이가 일어난 서열을 갖는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스 (CFMMV)로서, 상기 위치 799는 루신 (Leucine)에서 프롤린 (Proline)으로, 위치 876은 글루타메이트 (Glutamate)에서 글리신 (Glycine)으로, 위치 1139는 발린 (Valine)에서 글리신 (Glycine)으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스 (CFMMV).
삭제
제1항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스 (CFMMV).
제1항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스 (CFMMV).
제4항에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 1 인 것을 특징으로 하는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스 (CFMMV).
제4항의 염기서열을 포함하는 약독 오이과실모틀모자이크바이러스 (CFMMV) 재조합 발현벡터.
제6항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 17에 개시된 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제6항에 따른 재조합 발현벡터의 전사체로 접종된 식물세포
제6항에 따른 재조합 발현벡터의 전사체로 접종된 식물.
제9항에 있어서, 상기 식물은 박과식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제9항에 있어서, 상기 식물은 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumber fruit mottle mosaic virus), 오이녹반모자이크바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus), 큐리녹반모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus) 또는 쥬키니녹반모자이크 바이러스 (Zucchini green mottle mosaic virus)에 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는 식물.
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 약독 바이러스 또는 제 9항에 따른 식물의 즙액을 포함하는 식물 토바모바이러스(tobamovirus) 방제용 조성물
제12항에 있어서, 상기 식물은 박과식물인 것을 특징으로 하는 식물 토바모바이러스(tobamovirus) 방제용 조성물
제12항에 있어서, 상기 식물 토바모바이러스가 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumber fruit mottle mosaic virus), 오이녹반모자이크바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus), 큐리녹반모자이크바이러스 (Kyuri green mottle mosaic virus) 또는 쥬키니녹반모자이크 바이러스 (Zucchini green mottle mosaic virus)인 것을 특징으로 하는 식물 토바모바이러스 (tobamovirus) 방제용 조성물
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약독 오이과실모틀모자이크 바이러스 또는 제 9항에 따른 식물의 즙액을 식물에 접종하는 것을 특징으로 하는 식물 토바모바이러스의 방제 방법.
제 15항에 있어서, 식물이 박과식물인 것을 특징으로 하는 식물 토바모바이러스의 방제 방법
제 15항에 있어서, 토바모바이러스 중 오이과실모틀모자이크바이러스 (cucumber fruit mottle mosaic virus), 오이녹반모자이크바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus), 큐리녹반모자이크바이러스 (Kyuri green mottle mosaic virus), 쥬키니녹반모자이크 바이러스 (Zucchini green mottle mosaic virus) 방제를 특징으로 하는 방제 방법