CN102181522B - 黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表PSL-F&PSL-R所示。本发明还进一步提供了检测黄瓜细菌性角斑病菌的方法，该方法以样品菌液或者植物提取DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增结束后用凝胶电泳可检测到179bp的扩增片段。本发明引物特异性好，灵敏度高，为黄瓜种子进出口安全提供了保证。

Description

黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物。
背景技术
黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)是世界性黄瓜病害，主要侵染黄瓜，该病菌在种子内、外或随病残体在土壤中越冬，远距离传播主要依靠带菌种子。该病目前在世界各地均有分布，在我国主要分布在华北、东北及华中地区。近年来我国黄瓜种植面积不断增大，黄瓜育种产业发展很快，黄瓜种子远距离调运的频次及数量也大幅度增加，因此该病传播及扩散的风险日益增大。
本研究选择黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因设计一对引物，建立了黄瓜细菌性角斑病菌的PCR检测方法，反应结束后利用凝胶电泳检测判定是否有黄瓜细菌性角斑病菌。
发明内容
本发明目的在于提供用于黄瓜细菌性角斑病菌PCR检测用引物序列。
本发明通过分析黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因序列的基础上，设计了引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表PSL-F和PSL-R所示。
本发明还进一步给出了应用上述引物进行PCR检测的方法，其以样品菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR扩增，反应结束后根据电泳检测扩增片段判定结果。
具体地说本发明以样品菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR反应，即在25μL反应体系中加入18.3μL超纯水，10×PCR buffer2.5μL，1μL引物PSL-F(20μmol/L)，1μL引物PSL-R(20μmol/L)，(10mmol/L)dNTP 1μL，模板1μL，空白对照加1μL超纯水代替模板，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL。其中，上述反应条件可以是：94℃5min；94℃30S，58℃30S，72℃30S，35个循环；72℃8min。
进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
本发明根据黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因序列设计引物，该引物特异性好，用于PCR检测灵敏性高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有黄瓜细菌性角斑病菌，为黄瓜种子进出口安全提供了保证。
附图说明
图1：本发明检测方法对黄瓜细菌性角斑病菌检测的实验结果
所有参试的12株黄瓜细菌性角斑病菌均能扩增出单一的179bp的电泳条带。图1中M：Marker DL2000；1-10分别为来源于NCPPB菌种保藏中心的黄瓜细菌性角斑病菌，NCPPB编号分别为540，541，542，543，277，467，1425，1428，1096，1097；条带11及12为2株吉林分离物；13为空白对照。
图2是本发明检测方法的灵敏度实验结果。
图2中M：Marker DL2000，1-7分别为：7.5×107、7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×101、7.5×100cfu/mL，8：空白对照，结果显示7.5×103cfu/mL以上浓度菌液均可观察到电泳条，空白对照无条带。经过换算，本检测方法最低检测限大约是7.5个细菌。
图3是本发明检测方法对黄瓜叶片的检测应用实验。
图3中M为Marker DL2000；1-3为NCPPB 540菌株及2个吉林分离菌株接种黄瓜叶片后提取DNA扩增条带；4为健康黄瓜植株叶片提取的DNA；5为空白对照。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物的设计与合成
根据黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因序列，利用Primer Premier
5.0软件设计引物，引物序列为：
PSL-F(正向)：5′-GTTCGGCGACGCAATCAATG-3′
PSL-R(反向)：5′-GTTGACTTCTTCGGCGGTGG-3′
实施例2PCR扩增方法的建立
1、PCR反应体系
以菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR反应，即在25μL反应体系中加入18.3μL超纯水，2.5μL10×PCR buffer，1μL引物PSL-F(20μmol/L)，1μL引物PSL-R(20μmol/L)，1μL dNTP(10mmol/L)，1μL模板，空白对照加1μL超纯水代替模板，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL。
2、PCR反应条件
PCR反应条件：94℃5min；94℃30S，58℃30S，72℃30S，35个循环；72℃8min。
实施例3黄瓜细菌性角斑病菌PCR方法的特异性确定
以10株来源于NCPPB菌种保藏中心的Pseudomonas syringae pv.lachrymans及2吉林分离菌株为模板，进行PCR扩增检测。所有P.syringae pv.lachrymans均在179bp扩增出条带，空白对照无条带，说明该方法能够检测到所有收集到的黄瓜细菌性角斑病菌。
2、以黄瓜细菌性角斑病菌(NCPPB 540)为阳性对照，以收集到的P.Syringae不同致病变种、Pseudomonas属的不同种及Erwinia等不同属的参试菌株(具体见表1)为做模板进行PCR扩增，结果只有阳性对照有扩增条带，其余均无扩增条带，证明了该检测方法的特异性。
实施例4灵敏度实验
将浓度为7.5×107cfu/mL的(NCPPB 540)菌株分别稀释成7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×101、7.5×100、cfu/mL共8个浓度梯度，结果显示7.5×103以上浓度度均可观察到电泳条，经过换算，本检测方法最低检测限大约是7.5个细菌。
实施例5黄瓜细菌性角斑病菌PCR方法的应用实验
以接种黄瓜细菌性角斑病菌并表现症状的黄瓜叶片总DNA为模板，以健康叶片为对照，结果发现接种叶片可观察到明显的目标片段，而健康对照及空白对照均无目标片段。
表1
Figure BSA00000445292700051
Figure ISA00000445292900011

Claims (3)

1.一种黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物，其核苷酸序列为：
PSL-F：5′-GTTCGGCGACGCAATCAATG-3′
PSL-R：5′-GTTGACTTCTTCGGCGGTGG-3′
2.一种检测黄瓜细菌性角斑病菌的方法，该方法以样品菌液或者植物提取DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，扩增结束后利用凝胶电泳检测其扩增片段从而判定结果。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应过程中的退火温度为58℃。
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