CN107980728A - 北方根结线虫抗性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种农作物病虫害抗性鉴定方法，具体的说就是北方根结线虫抗性鉴定方法，属农业植保领域。本发明包括以下步骤：(1)无菌花生毛状根制备、(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备、(3)北方根结线虫的接种于培养、(4)抗性鉴定。本发明的优点是：该鉴定方法科学，省时省力，过程简单易于操作，根据有根结根数占整个根系的百分率进行抗性评价最为简单有效。

Description

北方根结线虫抗性鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种农作物病虫害抗性鉴定方法，具体的说就是北方根结线虫抗性鉴定方法，属农业植保领域。

背景技术

花生根结线虫病是花生生产上毁灭性病害之一，在我国大部分花生主产区均有发生，从发现至今一直是制约花生产量持续增加的重要限制因素。花生根结线虫病又称花生根瘤线虫病。俗称地黄病、地落病、黄秧病等是一种世界性病害，几乎所有种植花生的国家和地区都有发生。我国最早发现于山东省，目前在山东、安徽、江苏、河北、北京、辽宁、吉林、河南、湖南、湖北、广东、广西、贵州、陕西、甘肃、海南等省(市、区)均有发生，其中以山东发病最为普遍。花生感病后根的吸收功能被破坏，植株矮小发黄，结果少而稀。一般减产20％～30％，严重的可减产70％以上，甚至绝收。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足，提供北方根结线虫抗性鉴定方法。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：包括以下步骤：

(1)无菌花生毛状根制备

选用粒大饱满的20个花生品种种子，清洗干净，表面消毒，接种于无激素的MSB5培养基上，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；

(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备

清洗上述发病根系，捣碎，过筛，滤液喷洒于40目、200目、325目和500目组合筛上，收集325目和500目上的线虫和卵，获得根结线虫悬液和根结线虫卵悬液；

(3)北方根结线虫的接种于培养

将根结线虫悬液或根结线虫卵悬液，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置1h，用膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；

(4)抗性鉴定

调查记录根结数量，计算供试群体根内根内有根结根数占整个根系的百分率。

进一步的，本发明北方根结线虫抗性鉴定方法，根据计算结果和抗性评价标准，分别评价花生品种对北方根结线虫的抗性，抗性分级标准:

免疫：无根结；

高抗：有根结根数占整个根系的10％以下；

抗病：有根结根数占整个根系的10％～30％；

感病：有根结根数占整个根系的30％～50％；

高感：有根结根数占整个根系的50％以上。

进一步的，本发明北方根结线虫抗性鉴定方法，具体试验过程如下：

(1)无菌花生毛状根制备

选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min；在无菌条件下，用75％酒精浸泡花生种子0.5-1min；然后再在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒；其次用无菌水洗涤花育45种子3～4次，每次3-5min；最后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去花生种子的种皮，接种于无激素的MSB5培养基上；

在无菌条件下，接种环挑取于农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种后置于28℃恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基中；其中，LB液体培养基中添加50mg/L Kan，于28℃、180r/min的摇床内暗培养复苏21h；然后取0.05ml该菌液于上述液体培养基再次活化(条件同上)，使其达到对数生长期；最后使农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养。

(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备

收集上述花生根结样品，将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段，放入组织捣碎均浆机中，加水捣碎5～10min，形成线虫与根组织碎片的混合物；

将混合物加入到1.0％NaClO溶液中，没过根系，混合3min；将含有NaClO溶液的混合物倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目；

薄雾喷洒40目筛上的混合物，喷洒0.5h，使线虫和卵从根组织内移到表面，至组合筛的底部；

取出组合筛中的325目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫悬液，并配成200条/ml的浓度；

取出组合筛中的500目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫卵悬液，离心，去除上清液，再加入200@10-6链霉素，继续离心，去除上清液，以上过程重复3次；倒去上清液,加入无菌水离心5min,以上过程重复3次；最后一次倒去上清液，留下底部无菌线虫悬浮液。

(3)北方根结线虫的接种于培养

将上述根结线虫悬液1ml或卵悬液1ml，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置1h，膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；

(4)抗性鉴定

将步骤(3)的花生毛状根漂洗干净，调查记录根结数量，计算供试群体根内有根结根数占整个根系的百分率。

本发明的优点是：该鉴定方法科学，省时省力，过程简单易于操作，根据虫卵以及根线虫数量指数进行抗性评价最为有效。

具体实施方式

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

试验过程

1.无菌花生毛状根制备

选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min。(1)无菌条件下，用75％酒精浸0.5-1min,在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒，最后用无菌水洗涤3～4次，每次3-5min；处理后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于无激素的MSB5培养基上。

无菌条件下，用接种环挑取于-20℃低温冰箱中冻存的将发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种后置于28℃恒温培养箱中暗培养，长出单菌落后挑取1个单菌落转入10mlLB液体培养基(添加50mg/L Kan)中，于28℃、180r/min的摇床内暗培养复苏21h,取0.05ml该菌液于上述液体培养基再次活化(条件同上)，使其达到对数生长期。使农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养。

2.无菌胞囊线虫悬浮液的制备

采用机械捣碎—过筛喷淋法。用清水洗净花生根结样品，用剪刀将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段，放入组织捣碎均浆机中，加适量水捣碎5～10min，形成线虫与根组织碎片的混合物。将混合物倒入装有1.0％NaClO溶液的三角瓶中，使溶液没过根系，摇晃三角瓶3min。再将混合物倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目。用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约0.5h，使线虫和卵从根组织内移到表面，被喷雾水冲洗至组合筛的底部。注意调节好水的流量，以免水溢出使线虫流失，喷淋后期使用无菌水。喷淋过后，取出组合筛中的325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中到筛的一侧，然后再用少量无菌水从筛的背面冲洗筛上物，收集液体到容器中，获得根结线虫悬液，并配成200条/ml的浓度。用同法冲洗500目筛，可制备卵悬液。将分离的线虫悬浮液分装于离心管中在离心机中离心5min(1500r/min)；倒去上清液；再加入200@10-6链霉素，离心10min(1500r/min)；如此重复3次,倒去上清液，加入无菌水离心5min(1500r/min)，重复3次；最后一次倒去上清液，留下底部约0.5mL无菌线虫悬浮液。

3、北方根结线虫的接种于培养

无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液1ml(约100条)或卵悬液1ml(约100个)，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置1h，用膜封口。倒置25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫。

4.抗性鉴定

清水将根系漂洗干净，然后调查记录根结数量，计算供试群体根内根内有根结根数占整个根系的百分率，根据计算结果和抗性评价标准，分别评价花生品种对北方根结线虫的抗性。

抗性分级标准:

免疫：无根结；

高抗：有根结根数占整个根系的10％以下；

抗病：有根结根数占整个根系的10％～30％；

感病：有根结根数占整个根系的30％～50％；

高感：有根结根数占整个根系的50％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)无菌花生毛状根制备

选用粒大饱满的20个花生品种的种子，清洗干净，表面消毒，接种于无激素的MSB5培养基上，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；

(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备

清洗上述发病根系，捣碎，过筛，滤液喷洒于40目、200目、325目和500目组合筛上，收集325目和500目上的线虫和卵，获得根结线虫悬液和根结线虫卵悬液；

(3)北方根结线虫的接种于培养

将根结线虫悬液或根结线虫卵悬液，均匀接至不同花生品种的毛状根培养皿上，盒盖静置1h，用膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；

(4)抗性鉴定

调查记录有根结根数占整个根系的百分率。

2.根据权利要求1所述的北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：

根据计算结果和抗性评价标准，分别评价花生品种对北方根结线虫的抗性，抗性分级标准:

免疫：无根结；

高抗：有根结根数占整个根系的10％以下；

抗病：有根结根数占整个根系的10％～30％；

感病：有根结根数占整个根系的30％～50％；

高感：有根结根数占整个根系的50％以上。

3.根据权利要求1所述的北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：具体试验过程如下：

(1)无菌花生毛状根制备

选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min；在无菌条件下，用75％酒精浸泡花育45种子0.5-1min；然后再在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒；其次用无菌水洗涤花育45种子3～4次，每次3-5min；最后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去花生种子的种皮，接种于无激素的MSB5培养基上；

在无菌条件下，接种环挑取于农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种后置于28℃恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基中；其中，LB液体培养基中添加50mg/L Kan，于28℃、180r/min的摇床内暗培养复苏21h；然后取0.05ml该菌液于上述液体培养基再次活化，使其达到对数生长期；最后使农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；

(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备

收集上述花生根结样品，将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段，放入组织捣碎均浆机中，加水捣碎5～10min，形成线虫与根组织碎片的混合物；

将混合物加入到1.0％NaClO溶液中，没过根系，混合3min；将含有NaClO溶液的混合物倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目；

薄雾喷洒40目筛上的混合物，喷洒0.5h，使线虫和卵从根组织内移到表面，至组合筛的底部；

取出组合筛中的325目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫悬液，并配成200条/ml的浓度；

取出组合筛中的500目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫卵悬液，离心，去除上清液，再加入200@10-6链霉素，继续离心，去除上清液，以上过程重复3次；倒去上清液,加入无菌水离心5min，以上过程重复3次；最后一次倒去上清液，留下底部无菌线虫悬浮液；

(3)北方根结线虫的接种于培养

将上述根结线虫悬液1ml或卵悬液1ml，均匀接至不同花生品种的毛状根培养皿，盒盖静置1h，膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；

(4)抗性鉴定

将步骤(3)的花生毛状根漂洗干净，调查记录根结数量，计算供试群体根内有根结根数占整个根系的百分率。