CN110016511B

CN110016511B - 环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定及所用引物

Info

Publication number: CN110016511B
Application number: CN201910331093.9A
Authority: CN
Inventors: 冯俊丽; 汪艺; 朱勤超; 沈清
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2019-04-24
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-04-24
Also published as: CN110016511A

Abstract

本发明公开了一种环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定所用引物；包括：针对大西洋鳕鱼的引物，针对太平洋鳕鱼的引物，针对黑线鳕的引物，针对鳕科鳕鱼的引物。本发明还同时提供了利用上述引物进行的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，包括以下步骤：1)、待测样品(包括鱼类样品)中基因组DNA的提取；2)、利用引物进行实时荧光LAMP法和LAMP染色法；3)、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断。本发明将环等温扩增技术应用于国内市场常见鳕鱼(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕)及相关产品的品种鉴定标记研究。

Description

环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定及所用引物

技术领域

本发明涉及国内鳕科鳕鱼类产品的环介导等温扩增检测技术。

背景技术

鳕鱼多是生活在海洋底层和深海中下层的冷水性鱼类，属脊椎动物门(Vertebrata)、硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鳕形目(Gadiformes)。鳕鱼肉味甘美、营养丰富，是主要食用鱼类之一，在世界渔业中占有重要的地位。目前，我国鳕鱼的消费量正呈逐年递增趋势，市售鳕鱼主要分为三类：(1)属于鳕科的鳕鱼类，包括鳕属的大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)，太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)，狭鳕(Theragra chalcogramma)及其他鳕科的鱼类，如黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)，青鳕(Theragra chalcogramma)等；(2)不属于鳕科但被称为“银鳕鱼”的裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)和南极犬牙鱼(Dissostichuseleginoides)，其分别属鲉形目和鲈形目，但营养价值高于鳕科的鳕鱼类^[2]；(3)鱼目混珠的假鳕鱼类，俗称油鱼，主要是为棘鳞蛇鲭(Ruvettus pretiosus)和异鳞蛇鲭(Lepidocybium flavobrunneum)，均属于鲈形目。它们外形与鳕鱼相似，但生物学上并非一个种群，含有人体不能消化的蜡脂。

为规范鳕鱼类产品的标示，香港食品安全中心于2007年发出《有关识别及标签:油鱼/ 鳕鱼的指引》，只有鳕形目的鱼类才可以标为鳕鱼，但裸盖鱼和南极犬牙鱼仍可使用俗名“银鳕鱼”。然而，鳕形目鱼类品种繁多，形态学差异较小，不同的鳕鱼品种市场价格差异悬殊，常出现以次充好，伪造掺假的现象。此外，市售鳕鱼约有六成是去头去脏的冷冻形式，其余四成是去皮去骨的鱼切片，消费者在购买时难以通过形态特征判断鱼的种类。因此，为了更加有效地确保鳕鱼产品质量，防止欺诈，亟需建立对我国常见鳕鱼及相关制品进行特异性检测和品种鉴定的方法。

与传统的形态特征鉴别相比，基于DNA技术的分子生物学检测法更适合鳕鱼产品(冷冻切片及各种深加工制品)的鉴别。DNA上的遗传序列可以直接反映出物种间的差异，能精确的鉴定物种。其中线粒体DNA具有较高的进化和变异速率，因此常被用于鉴定近缘物种。常用的线粒体片段有16S rDNA,Cytb基因，COI基因和D-loop区域(也称Controlregion，CR)等。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。而且该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA 聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，而且还可以在反应体系里加入两条环引物，使反应速度更快，因此操作时间比PCR检测法更短，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，是一种适合现场、基层快速检测的方法。

LAMP法的反应结果通常通过凝胶电泳分析确定但是电泳法的操作时间较长，而且容易产生气溶胶污染。为了减少污染，提高效率，还可以采用指示剂法和实时荧光法来观察结果，其中指示剂法是在反应液中加入指示剂，通过反应产物的颜色变化判断结果。SYBRGreen⑧ I染料是最常用的LAMP指示剂，它与双链DNA小沟结合后能发出荧光，使反应液变为绿色，而未发生阳性扩增的反应液会维持橙色。实时荧光LAMP法(RealAmp)是在LAMP反应体系中加入荧光染料。随扩增进行，染料与扩增产物结合而发出荧光，荧光信号值与扩增产物量成正比，因此可以根据荧光信号值实时监测LAMP反应的过程。

LAMP方法目前被广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等各种核酸快速检测当中。但是，目前尚没有用于鳕科鳕鱼或其深加工产品种类鉴定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法及所用引物。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定所用引物；包括如下引物：

一、针对大西洋鳕鱼的引物：

二、针对太平洋鳕鱼的引物：

三、针对黑线鳕的引物：

四、针对鳕科鳕鱼的引物：

F3、B3为LAMP正、反向外引物，FIP、BIP为正、反向内引物。

具体如下表2所述。

本发明还同时提供了利用上述引物进行的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，包括以下步骤：

1)、待测样品(包括鱼类样品)中基因组DNA的提取；

2)、利用引物进行实时荧光LAMP法和LAMP染色法；

3)、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断。

判断内容包括是否为鳕鱼，以及具体为大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、黑线鳕中的哪种。

即，对样品(市售鳕鱼样品)的种类鉴定，判断是否与标签所述相符。

作为本发明的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法的改进，步骤2)为：

方法一、实时荧光LAMP法(可在96孔板各个反应孔中进行)：

实时荧光LAMP扩增体系：10μL反应体系中含有反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM)各0.2μL，上下游内引物(50μM)各0.32μL，Bst聚合酶0.4μL，10μM的

9 荧光染料0.2μL，DNA模板0.5μL；补ddH₂O至10μL；

反应在实时荧光PCR仪上进行，采用FAM通道收集荧光；

LAMP反应程序为：①60～63℃预反应13sec；②60～63℃反应47sec；③维持60～63℃收集荧光信号，并返回步骤②循环60次(收集荧光信号需13sec，所以即每分钟收集荧光信号一次)；

当体系中的引物为针对大西洋鳕鱼的引物、针对太平洋鳕鱼的引物、针对黑线鳕的引物时，LAMP反应程序的温度为60℃；

当体系中的引物为针对鳕科鳕鱼的引物时(12S rDNA体系)，LAMP反应程序的温度为 63℃；

反应结束后根据各管的荧光扩增曲线判断反应结果(各个反应可同时设置三个重复和非模板空白对照管)；

方法二、LAMP染色法：

LAMP染色法扩增体系：10μL反应体系中含有反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM)各0.2μL，上下游内引物(50μM)各0.32μL，Bst聚合酶0.4μL，DNA模板0.4μL，补ddH₂O 至10μL；

在上述10μL反应体系中加入8μL石蜡油以防蒸发(石蜡油不参与反应，也不与反应液、染料互溶)，并将0.4μL SYBR

I染料加在管盖内壁后盖紧管盖；

反应在水浴锅或金属浴上进行；

LAMP反应条件：当体系中的引物为针对大西洋鳕鱼的引物、针对太平洋鳕鱼的引物、针对黑线鳕的引物时，60℃反应60min；当体系中的引物为针对鳕科鳕鱼的引物时(12SrDNA 体系)，63℃反应60min；

反应结束后震荡反应管，使10μL反应液与0.4μL SYBR

I染料混合(石蜡油不参与反应，也不与反应液、染料互溶)，观察颜色变化(各个反应可同时设置三个重复和非模板空白对照管)。

作为本发明的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法的进一步改进，步骤3)为：

针对方法一、根据实时荧光LAMP反应得到的扩增曲线进行判断：无扩增曲线产生或检出时间≥60min者，判定结果为阴性；有S型扩增曲线且检出时间≤60min者，判定该样品结果为阳性；

即，当为实时荧光LAMP扩增体系时，根据实时荧光LAMP反应得到的扩增曲线与对应的检出时间判断被检鳕鱼样品的种类是否与标签所述相符；

针对方法二、反应60min后，根据SYBR

I染料与反应液混合后的颜色变化判断被检鳕鱼样品的种类是否与标签所述相符；反应液颜色保持橙色，判定结果为阴性；颜色变为绿色，可判定结果为阳性。

具体如下：

针对方法一、

首先利用以下公式(1)确定每批LAMP反应的荧光信号阈值Threshold：

Threshold＝10×SD_(1st-10th), 公式(1)

其中SD_(1st-10th)为各个反应管第1到第10个反应循环的荧光信号标准偏差；反应管的荧光信号值突破该荧光信号阈值时，所对应的反应时间即为样品的“检出时间”；

当某管反应有典型的S型扩增曲线出现且检出时间小于60min者，可判定该样品结果为阳性；相反，当某管反应无典型的S型扩增曲线出现或检出时间大于60min者，判定结果为阴性，可直接报告未检出。

具体为：当12S rDNA体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含鳕科鳕鱼成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min，可判定该样品中含有鳕科鳕鱼成分。

当品种特异性GMO体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含大西洋鳕鱼成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min，判定该样品中含有大西洋鳕鱼成分。

当品种特异性GMA体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含太平洋鳕鱼成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min，判定该样品中含有太平洋鳕鱼成分。

当品种特异性MA体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含黑线鳕成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min，判定该样品中含有黑线鳕成分。

针对方法二、

根据LAMP染色法反应液颜色变化判断结果(绿色为阳性，橙色为阴性)。即温浴60min 后，摇晃反应管使反应液和染料混合，如果反应液颜色变为绿色，可判定结果为阳性；如果反应液颜色为橙色，判定结果为阴性。

具体为：当12S rDNA体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含鳕科鳕鱼成分；当反应液变成绿色，可判定该样品中含有鳕科鳕鱼成分。

当品种特异性GMO体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含大西洋鳕鱼成分；当反应液变成绿色，可判定该样品中含有大西洋鳕鱼成分。

当品种特异性GMA体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含太平洋鳕鱼成分；当反应液变成绿色，可判定该样品中含有太平洋鳕鱼成分。

当品种特异性MA体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含黑线鳕成分；当反应液变成绿色，可判定该样品中含有黑线鳕成分。

作为本发明的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法的进一步改进，步骤1)：

待测样品(鱼类样品)采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(ZP307)提取基因组DNA；所得的DNA样品浓度范围为197-370ng/μL(备注：DNA浓度及纯度通过紫外可见分光光度计在260/280nm波长下测定)。

体系中使用的反应缓冲液可购自广州迪奥生物科技有限公司(货号R101S)。

本发明的发明过程如下：

①鳕鱼样品中基因组DNA的提取和纯化；

②3种常见鳕鱼品种(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕)鉴定标记基因的选择；以及鉴定特异性LAMP扩增引物的设计；

③鳕科品种鉴定标记基因的选择，以及鳕科鳕鱼通用LAMP扩增引物的设计；

④实时荧光LAMP体系和LAMP染色法体系的设置；

⑤根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断(即，对市售鳕鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符)。

上述步骤②的鳕鱼品种鉴定标记基因的选择及LAMP扩增引物的设计为：通过NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载得到鳕科中常见鳕鱼的线粒体基因序列。经DNAStar 软件里的MegAlign工具比对，发现Cytb在鳕科鳕鱼中差异最大，因此Cytb被选为3种常见鳕科鳕鱼品种鉴定标记基因，进行后续LAMP引物设计(如表1所示)。

上述步骤③的鳕科品种鉴定标记基因的选择及LAMP扩增引物的设计为：通过鳕科中常见鳕鱼、南极犬牙鱼(D.eleginoides)及油鱼(异鳞蛇鲭,L.flavobrunneum)的线粒体基因序列比对和分析，发现Cytb差异最大，12S rDNA在鳕科鳕鱼中差异最小，并与其他科鱼类差异较大，因此12S rDNA被选为鳕科的鉴定标记基因，进行后续LAMP引物设计(如表1所示)。

本发明的LAMP扩增引物的设计包括如下内容：将所筛选出的品种鉴定标记基因导入 LAMP引物在线设计软件Primer Explorer Version4.0 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，进行3种常见鳕鱼的特异性引物及鳕科通用引物的设计。并将候选的LAMP正、反向外引物(F3、B3)和正、反向内引物(FIP、BIP) 导入Primer Premier5.0软件(PREMIER Biosoft International，Palo Alto,CA)进行筛选和调整，以减少二聚体和错配发生率。再通过BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 测试以保证所设计引物的特异性，最终在大量实验的前提下确定了本发明所述的引物，并委托上海生工生物有限公司(上海，中国)合成(如表2所示)。

表1.常见鳕鱼类产品品种鉴定标记基因的筛选

本发明对常见鳕鱼品种鉴定特异性LAMP引物的设计，以及鳕科鳕鱼鉴定通用LAMP引物的设计，是通过MegAlign等工具比对分析，选择大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕的线粒体Cytb基因作为其品种鉴定标记基因，12Sr DNA基因为鳕科鉴定标记基因，进行LAMP引物的设计。

所设计的LAMP引物由六个区域组成，其中上游外引物(F3)、下游外引物(B3)分别包含一个区域，上游内引物(FIP)包含F1c、F2两个区域(F1c和F2之间用“-”隔开)，下游内引物(BIP)包含B1c、B2两个区域(B1c和B2之间用“-”隔开)。所得引物具体如下表2所述。

表2

注：每组LAMP体系的名称都是目标品种或基因标记的英文缩写。F3：LAMP扩增上游外引物，B3：LAMP扩增下游外引物；FIP：LAMP扩增上游内引物，BIP：LAMP 扩增下游内引物。

本发明在发明过程中，也试图针对16S rDNA设计LAMP引物，但是针对16S rDNA的LAMP引物设计没有成功(序列之间差异度太高，设计不出同时能扩增出多种鳕科鳕鱼的4条LAMP引物)。

本发明将环等温扩增技术应用于国内市场常见鳕鱼(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕) 及相关产品的品种鉴定标记研究。所建立LAMP反应体系具有良好的特异性、准确性和灵敏度，且检测时间短，操作简便。相较荧光定量PCR反应，LAMP反应是在恒温条件下进行，所以可以在简单的恒温仪器如水浴锅、金属浴中反应，成本更低，更适用于鳕鱼及其相关产品的现场快速检测。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为使用本发明特异性引物进行两种LAMP方法扩增阳性对照、阴性对照以及空白对照的扩增曲线图。

A、B、和C分别以大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕为检测目标，以另外两种鳕鱼及非鳕鱼品种(南极犬牙鱼和油鱼)为阴性对照，以灭菌蒸馏水替代DNA扩增模板作为空白对照。实时荧光LAMP检测结果中“others(其他品种)”指非目标鳕鱼品种。LAMP染色法检测结果从左到右依次为：第1列为目标鳕鱼，第2-5列为其他2种鳕鱼及2种非鳕鱼品种，第6列为空白对照。

D以3种鳕鱼(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕)为阳性对照，以2种非鳕鱼品种(南极犬牙鱼和油鱼)为阴性对照，以灭菌蒸馏水替代DNA扩增模板作为空白对照。实时荧光LAMP检测结果中“others”指非鳕鱼品种。LAMP染色法检测结果从左到右依次为：第1-3 列分别为大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕，第4列为南极犬牙鱼，第5列为油鱼，第6列为空白对照。

A～D：每张图上层(上图)为实时荧光LAMP检测结果，下层(下图)为LAMP染色法检测结果。

备注说明：

1、实时荧光LAMP扩增体系为：在96孔板各个反应孔中加入LAMP反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM)各0.2μL，上下游内引物(50μM)各0.32μL，Bst聚合酶0.4μL，

9荧光染料0.2μL(10μM)，DNA模板0.5μL，补ddH₂O至10μL。反应在实时荧光PCR仪上进行，采用FAM通道。大西洋鳕、太平洋鳕、黑线鳕体系的反应程序为：·60℃预反应13 sec；60℃反应47sec；维持60℃收集荧光信号，并返回反应步骤，循环60次。12S rDNA体系的反应条件与上述相同，只是反应温度设为63℃。

2、LAMP染色法扩增体系为：薄壁管中加入反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM)各0.2μL，上下游内引物(50μM)各0.32μL，Bst聚合酶0.4μL，DNA模板0.5μL，补ddH₂O 至10μL，并滴加8μL石蜡油封闭反应。将0.4μL SYBR

I染料滴加在管盖内壁后盖紧管盖。反应在金属浴中进行，其中大西洋鳕、太平洋鳕、黑线鳕体系维持60℃反应60min，12S rDNA体系维持63℃反应60min。反应结束后震荡反应管，使SYBR

I染料与10μL反应液混合，观察颜色变化(石蜡油不参与反应，也不与反应液、染料互溶)。

3、上述每个LAMP扩增均设置了3个重复。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图中得以体现，但平行结果均符合以下条件，即：有且仅含有目标鳕鱼DNA样品的反应管出现LAMP扩增，且三平行检测结果完全一致。

4、图1的结果显示每组引物均能特异性地扩增目标鳕鱼样品，而且阴性样品及空白对照都没有扩增。LAMP染色法的结果为图1A、1B、和1C中分别只有大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕为模板的反应管变成绿色，1D中鳕科鱼类为模板的反应管变成绿色，其他反应管颜色仍为橙色；

注：在黑白图片中无法看出颜色变化，但是阳性扩增有白色沉淀物，阴性和空白对照无沉淀产生。

图2为所建立鳕鱼LAMP检测方法灵敏度(绝对检出限)的确定。

A、B、和C分别以大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕的cytb为检测目标，用于确定这3 种鳕科鳕鱼的品种鉴定体系的灵敏度。D、E、和F分别为以大西洋鳕、太平洋鳕及黑线鳕的12S rDNA为检测目标。大西洋鳕、太平洋鳕及黑线鳕DNA的初始浓度分别为285ng/μL、370ng/μL和197ng/μL，分别进行10倍梯度稀释后，进行实时荧光LAMP和LAMP染色法扩增。

LAMP染色法检测结果中，A和D图第1-5列中大西洋鳕鱼的DNA浓度分别为285ng/μL、 28.5ng/μL、2.85ng/μL、0.285ng/μL和28.5pg/μL；D图第6列大西洋鳕鱼的DNA浓度为2.85pg/μL；B和E图第1-6列中太平洋鳕鱼的DNA浓度分别为370ng/μL、37ng/μL、3.7ng/μL、0.37ng/μL、37pg/μL和3.7pg/μL；C和F图第1-5列中黑线鳕鱼的DNA浓度分别为197ng/μL、19.7ng/μL、1.97ng/μL、0.197ng/μL和19.7pg/μL；F图第6列黑线鳕鱼DNA的浓度为1.97 pg/μL。

A～F：每张图上层为实时荧光LAMP检测中检出时间与模板DNA浓度log值之间的关系，下层为LAMP染色法中不同模板DNA浓度下的检测结果。

备注说明：

1、上述每个LAMP扩增均设置了3个重复。在实时荧光LAMP中，3个重复的检测结果以检出时间的标准误差(SD值)来反映；在LAMP染色法扩增结果中，3个重复的检测结果完全一致。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图中得以体现。

2、由图2可看出，本实验所建立的LAMP检测体系利用cytb对大西洋鳕、太平洋鳕及黑线鳕的绝对检出线(LODa)分别达到0.285ng/μL，37pg/μL，0.197ng/μL(图2A，2B 和2C)。在12Sr DNA体系中大西洋鳕的绝对检出限为37pg/μL，太平洋鳕和黑线鳕分别为 28.5pg/μL，19.7pg/μL(图2D，2E和2F)。上述结果在实时荧光LAMP和LAMP染色法体系中的检测结果一致，即灵敏度相等。

3、LAMP染色法的结果为图2A和图2C的1-4反应管变成绿色，图2B，2D，2E和2F 的1-5反应管变成绿色，其他反应管颜色仍为橙色；

图3为利用所建立的LAMP检测体系对混合样本进行检测。

图3A和3D的检测目标为大西洋鳕鱼，图3B和3E的检测目标为太平洋鳕鱼，图3C和3F的检测目标为黑线鳕鱼。图3A、3B和3C为以大西洋鳕、太平洋鳕及黑线鳕的cytb为检测目标的特异性品种鉴定标记检测体系，图3D、3E和3F为以12S rDNA为检测目标的鳕科鳕鱼的品种鉴定检测体系。

实时荧光LAMP检测体系中：采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(ZP307)(ZP307)提取含有0.01-100％(w/w)目标鳕鱼的混合样品的DNA，再以这些DNA为模板进行实时荧光LAMP鉴定。结果以折线图表示，以目标鳕鱼含量的百分比作为横坐标，以各个反应对应的检出时间的平均值(3个重复)作为纵坐标。

LAMP染色法检测体系中：样品准备步骤同上。各个图中lane1-5目标鳕鱼的DNA含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％。

图A～F，每张图上层为实时荧光LAMP体系对混合样本的检测结果，下层为LAMP染色法检测结果；

备注说明：

1、混合DNA制备：将切碎的油鱼(异鳞蛇鲭,L.flavobrunneum)鱼肉分别与3种鳕鱼肉(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕)混合制得含0.001～10％(w/w)目标鳕鱼肉的混合物，再准确称取0.03g,使用动物组织基因组DNA提取试剂盒基因组DNA。所有DNA置于-20℃保存备用。

2、上述每个LAMP扩增均设置了3个重复。在实时荧光LAMP中，3个重复的检测结果以检出时间的标准误差(SD值)来反映；在LAMP染色法扩增结果中，3个重复的检测结果完全一致。为使结果图像简洁美观，平行实验的结果没有在图中得以体现。

3、由图3可看出，本实验所建立的LAMP检测体系利用cytb对太平洋鳕的相对检出线 (LODr)达到0.1％，大西洋鳕和黑线鳕的相对检出线达到1％(图3A，3B和3C)。在12SrDNA体系中，3种鳕鱼的相对检测线均达到0.1％(图3D，3E和3F)，检测时间都在60min 内。上述结果在实时荧光LAMP和LAMP染色法体系中的检测结果一致，即灵敏度相等。

4、由图3可看出，在混合DNA样品中，目标DNA也能高效扩增而不受非目标DNA的干扰。

5、LAMP染色法的结果为图3A和图3C的1-3反应管变成绿色，图3B，3D，3E和3F 的1-4反应管变成绿色，其他反应管颜色仍为橙色；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、采用两种LAMP检测方法对市场上购买的鳕鱼(冰鲜或冷冻)进行种类鉴定，包括进行以下步骤：

①待测样品中基因组DNA的提取；采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(ZP307)(ZP307)提取样品DNA，于-20℃保存。

②以所建立的3种鳕鱼(大西洋鳕、太平洋鳕及黑线鳕)及鳕科LAMP检测体系进行品种鉴定。具体如下：

一、实时荧光LAMP扩增体系设置：反应体系为10μL，体系中含有反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM，见表2)各0.2μL，上下游内引物(50μM，见表2)各0.32μL，Bst 聚合酶0.4μL，10μM的

9荧光染料0.2μL，DNA模板0.5μL，补ddH₂O至10μL；

在96孔板各个反应孔中设置体系，封上光学膜。同时设置三个重复和非模板空白对照管。

实时荧光LAMP反应在实时荧光PCR仪上进行(反应在Mini Opticon Monitor3实时荧光PCR仪上进行)，采用FAM通道。大西洋鳕、太平洋鳕鱼和黑线鳕的cytb特异性品种鉴定体系反应程序为：60℃预反应13sec，60℃反应47sec；维持60℃收集荧光信号(约13sec)，并返回反应步骤，循环60次。12S rDNA鳕科鉴定反应体系与上述相同，只是反应温度设为 63℃。

二、LAMP染色法扩增体系设置：反应体系为10μL，体系中含有反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM，见表2)各0.2μL，上下游内引物(50μM，见表2)各0.32μL，Bst 聚合酶0.4μL，DNA模板0.5μL，补ddH₂O至10μL；在上述10μL反应体系中再滴加石蜡油8μL，并将SYBR

I染料0.4μL加在管盖内壁后盖紧管盖。

LAMP染色法扩增反应可在金属浴上进行，其中大西洋鳕、太平洋鳕、黑线鳕的cytb特异性品种鉴定体系反应温度为60℃，反应时间为60min；12S rDNA鳕科鉴定体系反应温度为63℃，反应时间为60min。反应结束后震荡反应管，使SYBR

④根据LAMP检测结果进行判断(即，对市售鳕鱼样品的种类鉴定，判断是否是鳕科鳕鱼、是否与标签所述相符)。

扩增结果分析及结果判断的依据有两种：

第一种，根据实时荧光LAMP反应中的特异性扩增曲线与对应的检出时间长短判断被检样品中是否属于上述3种鳕科鳕鱼；检测基因无特异性扩增曲线产生或检出时间大于60min 者，判定结果为阴性；有特异性扩增曲线产生且检出时间小于60min者，可判定该样品结果为阳性。

具体为：当12S rDNA体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含鳕科鳕鱼成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min(如图1D 上图，20min)，可判定该样品中含有鳕科鳕鱼成分。

当品种特异性GMO体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含大西洋鳕鱼成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min(如图1A 上图，35min)，判定该样品中含有大西洋鳕鱼成分。

当品种特异性GMA体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含太平洋鳕鱼成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min(如图1B 上图，25min)，判定该样品中含有太平洋鳕鱼成分。

当品种特异性MA体系的检测结果不出现S型扩增曲线或检出时间大于60min者，判定该样品中不含黑线鳕成分；当出现明显S型扩增曲线且检出时间小于60min(如图1C上图，35min)，判定该样品中含有黑线鳕成分。

第二种，根据LAMP染色法反应结束后的颜色变化判断被检样品中是否是鳕科鳕鱼；反应60min后，将反应液与SYBR

I染料混合后，若反应液维持橙色，判定结果为阴性；若反应液变成绿色，判定该样品结果为阳性。

具体为：当12S rDNA体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含鳕科鳕鱼成分；当反应液变成绿色(如图1D下图，第1-3列)，可判定该样品中含有鳕科鳕鱼成分。

当品种特异性GMO体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含大西洋鳕鱼成分；当反应液变成绿色(如图1A下图，第1列)，可判定该样品中含有大西洋鳕鱼成分。

当品种特异性GMA体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含太平洋鳕鱼成分；当反应液变成绿色(如图1B下图，第1列)，可判定该样品中含有太平洋鳕鱼成分。

当品种特异性MA体系的LAMP染色法检测反应液为橙色，判定该样品中不含黑线鳕成分；当反应液变成绿色(如图1B，第1行)，可判定该样品中含有黑线鳕成分。

表3、LAMP检测方法对市售鳕鱼(冰鲜或冷冻)品种鉴定结果

如表3所示，8个市售鳕鱼(冰鲜或冷冻)检测样品中在12S rDNA体系中显示阳性的，其确实属于鳕科。其中挪威北极鳕(3号和4号样品)是大西洋鳕鱼中的一种，是挪威海产局为了强调产地和物种另起的商品名称。6号样品野生黑鳕鱼学名裸盖鱼，为鲉形目黑鲉科鱼类，其外形与鳕鱼相似，因此也被称为黑鳕鱼，但是其不属于鳕科鱼类。根据香港食品安全中心于2007年发出的《有关识别及标签：油鱼/鳕鱼的指引》，裸盖鱼可使用俗名“银鳕鱼”。1 号和2号样品分别为鳕鱼切片和无头鳕鱼，但检测结果发现其不属于常见的大西洋鳕、太平洋鳕和黑线鳕，也不属于鳕科鱼类。该结果提示我们市场上可能存在标签造假的现象。

实施例2、采用如实施例1所述的两种LAMP检测方法对市场上随机购买的鳕鱼深加工商品进行种类鉴定：

从市场上随机购买标识为鳕鱼肠、烤鳕鱼片及产品成分中包含鳕鱼的商品，采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(ZP307)提取样品DNA，于-20℃保存。

即，将实施例1中的步骤①作了更改，其余内容等同于实施例1。

表4、LAMP检测方法对市售深加工鳕鱼产品的品种鉴定结果

如表4所示，6个深加工样品中在12S rDNA体系中显示阳性的，其确实属于鳕科鳕鱼。2 号和6号样品中出现大西洋鳕鱼和太平洋鳕鱼同时检出的现象，由于国内市场中太平洋鳕鱼价格低于大西洋鳕鱼，表明在加工制品中存在以次充好的现象。1号和4号样品产品名称分别为鳕鱼肠和鳕鱼饼，但检测结果发现其不属于常见的大西洋鳕、太平洋鳕和黑线鳕，也不属于鳕科鱼类。该结果提示我们市场上可能存在标签造假的现象。

对比例1、将本发明的引物改成如表5所示的序列，其余等同于实施例1，对表3所述的样品进行鉴定。

表5

8个样品的所得结果均为：

实时荧光LAMP检测结果为：12S rDNA体系不出现S型扩增曲线，GMO/GMA/MA体系均未出现S型扩增曲线；

LAMP染色法检测结果为：12S rDNA体系的LAMP反应液为橙色，GMO/GMA/MA体系的LAMP反应液为橙色。

因此：采用对比例1所述的引物无法实现有效的判定。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定及所用引物

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attccccttt gttgttgct 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaacgatg gggttagcag 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgtctgca tttgaattga tccctgcttt tacaatactc cacctg 46

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agacctgctc ggctttgctg tgtgaaatta tctggatctc c 41

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatacatgct aacggtgcct c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgtaaggga cagtagatat 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaaaggaca accccgatgt ttatacatat tgcccgaggt c 41

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgtaggtta cgtccttccc tgaatttgta atcacggtag cc 42

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcttggtttt gccgtaatac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgaaggaaa ggaacaacca 20

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggggtaaa attatcagga tctaggtcta acttctcttg ctctct 46

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atttgcttat gctatcctcc gttcaaacaa gagtgcaaga accc 44

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtatggtcgt taacattgat gg 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agggtaagct gacgacggt 19

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcctttggg ttttaagcta ttgcttatac ccaaaccatc cgc 43

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tagacccccc tagaggagcc taaggatggt gaggttaaac g 41

Claims

1.环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定所用引物；其特征是包括如下引物：

一、针对大西洋鳕鱼的引物：

F3：ATTCCCCTTTGTTGTTGCT；

B3：GGTAACGATGGGGTTAGCAG；

FIP：CTTGTCTGCATTTGAATTGATCCCT-GCTTTTACAATACTCCACCTG；

BIP：AGACCTGCTCGGCTTTGCTGT-GTGAAATTATCTGGATCTCC

二、针对太平洋鳕鱼的引物：

F3：TATACATGCTAACGGTGCCTC

B3：ACGTAAGGGACAGTAGATAT

FIP：GAAAAGGACAACCCCGATGTT-TATACATATTGCCCGAGGTC

BIP：TCGTAGGTTACGTCCTTCCCTGA-ATTTGTAATCACGGTAGCC；

三、针对黑线鳕的引物：

F3：GCTTGGTTTTGCCGTAATAC；

B3：GTGAAGGAAAGGAACAACCA；

FIP：CGGGGGTAAAATTATCAGGATC-TAGGTCTAACTTCTCTTGCTCTCT；

BIP：ATTTGCTTATGCTATCCTCCGTTC-AAACAAGAGTGCAAGAACCC；

F3、B3为LAMP正、反向外引物，FIP、BIP为正、反向内引物。

2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定所用引物；其特征是还包括如下针对鳕科鳕鱼的引物：

F3：GTATGGTCGTTAACATTGATGG；

B3：AGGGTAAGCTGACGACGGT；

FIP：GTCCTTTGGGTTTTAAGCTATTGC-TTATACCCAAACCATCCGC；

BIP：TAGACCCCCCTAGAGGAGCCT-AAGGATGGTGAGGTTAAACG。

3.利用如权利要求1或2所述的引物进行的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，其特征包括以下步骤：

1)、待测样品中基因组DNA的提取；

2)、利用引物进行实时荧光LAMP法和LAMP染色法；

3)、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断。

4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，其特征是所述步骤2)：

方法一、实时荧光LAMP法：

实时荧光LAMP扩增体系：10μL反应体系中含有反应缓冲液5μL，上下游外引物各0.2μL，上下游内引物各0.32μL，Bst聚合酶0.4μL，10μM的

9荧光染料0.2μL，DNA模板0.5μL；补ddH₂O至10μL；

反应在实时荧光PCR仪上进行，采用FAM通道收集荧光；

LAMP反应程序为：①60～63℃预反应13sec；②60～63℃反应47sec；③维持60～63℃收集荧光信号，并返回步骤②循环60次；

当体系中的引物为针对鳕科鳕鱼的引物时，LAMP反应程序的温度为63℃；

反应结束后根据各管的荧光扩增曲线判断反应结果；

方法二、LAMP染色法：

LAMP染色法扩增体系：10μL反应体系中含有反应缓冲液5μL，上下游外引物(10μM)各0.2μL，上下游内引物(50μM)各0.32μL，Bst聚合酶0.4μL，DNA模板0.4μL，补ddH₂O至10μL；

反应在水浴锅或金属浴上进行；

LAMP反应条件：当体系中的引物为针对大西洋鳕鱼的引物、针对太平洋鳕鱼的引物、针对黑线鳕的引物时，60℃反应60min；当体系中的引物为针对鳕科鳕鱼的引物时，63℃反应60min；

反应结束后震荡反应管，使10μL反应液与0.4μL SYBR

I染料混合，观察颜色变化。

5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，其特征是所述步骤3)：

针对方法二、反应60min后，根据SYBR

6.根据权利要求4或5所述的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，其特征是所述步骤1)：

待测样品采用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；所得的DNA样品浓度范围为197-370ng/μL。