CN112322759A - 一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法，包括如下步骤：S1：样本采集：分别采集大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的组织样本多份；S2：构建RAD文库：通过高通量测序技术获得步骤S1中所说的三种鳕鱼的基因序列，构建鳕鱼基因RAD文库；S3：SNP calling：采用无参软件对步骤S2构建RAD文库进行Call SNP分析，筛选出三种鳕鱼均不相同的SNP位点；S4：基因分型：获得每条鳕鱼的SNP及基因型，再根据步骤S3筛选出的三种鳕鱼均不相同的SNP位点，分别用于鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼。本发明建立了鳕鱼鉴定技术体系，鉴定方法简单易行，且特异性好、灵敏度高，具有非常好的实用及推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法。
背景技术
鳕鱼肉味甘美、营养丰富，除了富含普通鱼油所有的DHA、DPA外，还含有人体所必需的维生素A、D、E和其他多种维生素，且鳕鱼肝油中这些营养成分的比例正是人体每日所需要量的最佳比例，因此，鳕鱼享有“餐桌上的营养师”“移动DHA”“深海黄金”等美称，也因此，鳕鱼成为全世界年捕捞量最大的鱼类之一。市场上贸易的鳕鱼，常常出现错误标签和以次充好的现象，从几十元1斤的油鱼，到上百元1斤银鳕鱼，均以鳕鱼自居，鱼龙混杂，真假难辨。这不仅重影响了国内外贸易秩序，而且物种来源不明的鱼类可能因含有过敏原和有毒成分而带给消费者潜在的食品安全风险。
传统的鱼类鉴定方式主要是采用的鱼类形态学鉴定或蛋白质鉴定。鱼类形态学鉴定一般是仅凭专家肉眼观察鱼类形态鉴定其品种，这种方式不适用于经过切片、绞碎等处理的鱼类产品；蛋白质鉴定主要用于新鲜或冰冻组织的鉴定，不适用于经过高盐、高热或高压处理的鱼类产品。
DNA鉴定方法，仅需一些带有完整遗传信息的组织即可鉴定子代和亲代关系，因此具有特异性好、灵敏度高、操作简便等优点，被广泛应用于法医学、生物学和遗传学等研究领域。然而，我国有关鱼种DNA鉴定方法的研究起步较晚，且尚无大通量的鳕鱼DNA鉴定技术平台和体系。而鳕鱼真伪检测鉴定技术体系的建立，不仅为我国海产品物种防伪和商业打假提供了技术支撑，也进一步丰富了我国水生动物遗传资源信息，为珍稀水生动物保护发挥了积极作用。
发明内容
针对上述鳕鱼真伪检测鉴定技术存在的问题，本发明提供一种基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，基于BGISEQ-500高通量测序平台，应用 RAD-seq(酶切位点DNA测序)，采用有参考基因组以及无参考基因组的比对分析方法进行基因分型，鉴定大西洋真鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼三种鳕鱼。具体技术方案如下：
一种基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，包括如下步骤：
S1：样本采集：分别采集大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的组织样本多份；
S2：构建RAD文库：通过高通量测序技术获得步骤S1中所说的三种鳕鱼的基因序列，构建鳕鱼基因RAD文库；
S3：SNP calling：采用无参软件对步骤S2构建RAD文库进行Call SNP 分析(单核苷酸多态性分析)，筛选出三种鳕鱼均不相同的SNP位点；
S4：基因分型：获得每条鳕鱼的SNP及基因型，再根据步骤S3筛选出的三种鳕鱼均不相同的SNP位点，分别鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼。
作为优选的技术方案的，步骤S1中，所述采集大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的组织样本为肌肉组织，每种鳕鱼采集的样本份数不少于3 份。
作为优选的技术方案的，步骤S2中，所述构建RAD文库的高通量测序技术为采用BGISEQ-500测序技术；使用的引物接头为ad153接头，其序列为：
F：AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA，
R：AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTG；
所述使用的限制性内切酶为TaqⅠ。
作为优选的技术方案的，步骤S3中，所述Call SNP分析软件为采用无参软件Stacks，其分析步骤为：
S3-1：Ustacks：根据三种鳕鱼的基因序列相似性找出核苷酸序列；
S3-2：Cstacks：将变异的核苷酸序列汇总；
S3-2：Sstacks：过滤掉低质量变异的核苷酸序列。
各步数据分析的参数如下：
步骤S3-1中数据分析的参数为：-m 2-M 2-p 15；
步骤S3-2中数据分析的参数为：-b 1-n 3-p 15；
步骤S3-3中数据分析的参数为：-p 15-b 1。
经过Call SNP分析，初步选到的SNP位点为6941个；基于每种鱼80％以上的个体一致的基因型，筛选出三种鳕鱼均不相同的基因型，满足以上2 个条件的SNP位点共为7个。
前述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，还包括引物验证步骤，筛选出三种鳕鱼均不相同的基因型的SNP位点后，需设计引物获得PCR产物并测序验证。
经引物验证后，获得4个SNP位点可用于鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼；该4个SNP位点均包括3个特异碱基，其扩增引物序列、扩增的序列长度及各SNP位点特异碱基位于该序列中的位置分别为：
F1：CAGATACCCTCGAATA，
R1：CAAACAAATAGAGGGGTTTGGTA；
扩增的序列1长度为329bp；SNP1的位置为：82bp、112bp、220bp；
F2：CCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAAT，
R2：AGAAAAAATAGTTAGGTCAACGGATGC；
扩增的序列2长度为191bp；SNP2的位置为：75bp、104bp、136bp；
F3：ATTCGGGCAGAACTAAGCCAACCTG，
R3：CTCATGTTATTTATTCGAGGGAAAGC；
扩增的序列3长度为193bp；SNP3的位置为：127bp、163bp、199bp；
F4：CATCTTCAGGTGTAGAAGCTGGGG，
R4：TGAGAAATTGCCGGGGGTTTCAT；
扩增的序列4长度为192bp；SNP4的位置为：52bp、76bp、127bp。
大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的各SNP位点的特异碱基分别是：
大西洋鳕鱼：SNP1：G、T、A；
SNP2：A、T、T；
SNP3：G、A、T；
SNP4：T、T、A；
格陵兰扁鳕鱼：SNP1：T、C、G；
SNP2：C、A、A；
SNP3：A、C、A；
SNP4：A、C、G；
法国银鳕鱼：SNP1：A、A、T；
SNP2：T、G、C；
SNP3：T、G、C；
SNP4：C、A、T。
作为优选的技术方案的，步骤S4中，所述基因分型为采用撰写的perl脚本得到每条鳕鱼的SNP及基因型；所述鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼为：将筛选出的SNP位点在大西洋鳕鱼的基因组中定位，挑出其前后长度为200bp的序列；设计特异引物扩增选定的序列，将呈阳性的结果送测，验证确定变异位点的碱基序列。
本发明的有益效果是：
本发明通过高通量测序平台，应用RAD-seq技术，建立三种鳕鱼鉴定RAD 文库，并在此基础上筛选出三种鳕鱼均不相同的SNP位点，根据这些SNP位点结合基因分型分别确定三种鳕鱼的类型，设立了大通量鳕鱼DNA鉴定技术平台，建立了鳕鱼真伪检测鉴定技术体系，不仅为我国海产品物种防伪和商业打假提供了技术支撑，也进一步丰富了我国水生动物遗传资源信息，为珍稀水生动物保护发挥了积极作用。
本发明方法以鳕鱼的肌肉组织为检测样本，样本获得容易且方便；采用 BGISEQ-500高通量测序技术，测序速度快且定位准确；而同无参软件Stacks 进行Call SNP分析，简单易行，且结果准确率高。经分析获得的可用于鉴定三种鳕鱼4个SNP位点及其所在基因片段扩增序列，为后续的三种鳕鱼的鉴定提供快捷的操作方法。而且，本发明方法同样具备DNA鉴定的特异性好、灵敏度高、操作简便等优点，具有非常好的实用及推广价值。
附图说明
图1为本发明中SNP位点标记号为7285的PCR产物凝胶电泳结果；
图2为本发明中SNP位点标记号为37353的PCR产物凝胶电泳结果；
图3为本发明中SNP位点标记号为43999的PCR产物凝胶电泳结果；
图4为本发明中SNP位点标记号为12014(SNP1)的PCR产物凝胶电泳结果；
图5为本发明中SNP位点标记号为16364(SNP2)的PCR产物凝胶电泳结果；
图6为本发明中SNP位点标记号为42229(SNP3)的PCR产物凝胶电泳结果；
图7为本发明中SNP位点标记号为1926(SNP4)的PCR产物凝胶电泳结果。
图中：M：DNA marker；青：青斑鱼；弹：弹涂鱼；H2O：清水；大1：大西洋鳕鱼1号样本；大2：大西洋鳕鱼2号样本；格1：格陵兰扁鳕鱼1号样本；格2：格陵兰扁鳕鱼2号样本；法1：法国银鳕鱼1号样本；法2：法国银鳕鱼2号样本。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例是一种基于高通量测序鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼三种鳕鱼的方法，具体操作如下：
一、样本采集：
分别采集大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的肌肉组织作为鉴定的样本，每种鳕鱼的样本数不少于3份；为了保证结果的精确度，本实施例中，每种鳕鱼的样本数为：大西洋真鳕鱼6份，格陵兰扁鳕鱼12份，法国银鳕鱼10份，共计28份。
二、方法
2.1RAD文库构建和测序
采用BGISEQ-500(100PE)对所采集的28份鳕鱼肌肉样本的基因序列测序，该测序采用ad153引物接头具体序列如下：
F：AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(序列1)，
R：AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTG(序列2)；
采用的限制性内切酶为TaqⅠ(TCGA)。
2.2.1Call SNP
采用无参软件Stacks分析构建的RAD文库构建和测得的鳕鱼基因序列，具体分析步骤为：
Ustacks：根据序列相似性找出变异，参数：-m 2-M 2-p 15(数据分析中的方法)；
Cstacks：变异汇总，参数：-b 1-n 3-p 15；
Sstacks：过滤掉低质量变异，参数：-p 15-b 1；
2.2.2基因分型
采用撰写的perl脚本，最终得到每条鳕鱼的SNP及基因型。
由于目前大西洋鳕鱼基因组已经完成了序列测序分析，其基因组序列可以在NCBI上找到，可以使用大西洋鳕鱼用作参考基，将筛选出的SNP位点在大西洋鳕鱼基因组中定位，并调出其前后各长度为200bp的序列，以设计更多的特异性的引物。设计引物后进行引物验证，将有条带的片段也就是呈阳性的结果送去测序基因片段，验证变异位点的碱基序列。
三、结果
3.1建库和测序
本实施例中，三种鳕鱼共采集28份肌肉组织样本，经高通量测序，下机测序数据为65.6Gb。
3.2SNP calling
采用无参无参软件Stacks分析，初步选到6941个变异的SNP位点；基于每种鱼80％以上的个体一致的基因型，再筛选出3种鱼均不相同的基因型，满足以上2个条件的位点(SNP)共7个。各SNP的目标区域及扩增验证的引物序列如表1所示：
表1.各SNP位点的目标区域及扩增验证的引物序列
四、引物验证：
根据表1中的7285、37353、43999、12014(SNP1)、16364(SNP2)、 42229(SNP3)、1926(SNP4)的结果，设计七组引物分别扩增三种鳕鱼的基因序列，并对其PCR产物测序验证；采取青斑鱼和弹涂鱼的样本作为阴性对照，以H2O(清水)为空白对照，每种鳕鱼的样本重复两次；各PCR产物凝胶电泳结果如图1至图7所示；由该验证结果可以看出，该7个SNP位点中有4个SNP位点可用于鉴定这三种鳕鱼。
五、不同SNP序列变异位点分析
进一步对上述的4个SNP位点测序结果进行分析，该4个可用于鉴定三种鳕鱼的SNP位点于在大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼基因组中的变异碱基的位置，及各种鳕鱼对应的碱基变化情况如表2所示，
表2.各SNP位点变异碱基的位置及各种鳕鱼的对应的碱基变化情况
| 标记ID | 12014(SNP1) | 16364(SNP2) | 42229(SNP3) | 1926(SNP4) |
| 变异位点 | 82bp、112bp、220bp | 75bp、104bp、136bp | 127bp、163bp、199bp | 52bp、76bp、127bp |
| 大西洋鳕鱼 | G、T、A | A、T、T | G、A、T | T、T、A |
| 格陵兰扁鳕鱼 | T、C、G | C、A、A | A、C、A | A、C、G |
| 法国银鳕鱼 | A、A、T | T、G、C | T、G、C | C、A、T |
因此在，鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的时候只需要采用上述的4个SNP位点其中一个对应的引物进行基因扩增并测序便可判断该鳕鱼的种类。
实施例2
本实施例是利用实施例1的高通量测序鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼三种鳕鱼的方法鉴定一种鳕鱼，具体操作如下：
取该鳕鱼的肌肉样本2份，提取其DNA作为底物，以12014(SNP1)的引物(F1、R1)为引物进行PCR扩增，及测序，测序结果如表3所示。
表3.各SNP位点变异碱基的位置及各种鳕鱼的对应的碱基变化情况
由上表结果结合实施例1中SNP序列变异位点分析结果可见，该鳕鱼为大西洋鳕鱼。本发明方法不仅简单易行，且特异性好、灵敏度高、结果准确率高。基于高通量测序平台及RAD-seq技术，建立的三种鳕鱼DNA鉴定技术平台，不仅为我国海产品物种防伪和商业打假提供了技术支撑，也进一步丰富了我国水生动物遗传资源信息，为珍稀水生动物保护发挥了积极作用，具有非常好的实用及推广价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含这些的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
<110>镇江华大检测有限公司
<120>一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法
<160>25
<210>1
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<212>DNA
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AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA32
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AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTG42
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TGTCCCATCTACTCACATGGAGGAGGCAGGGCTTTATGAC40
CTGTACTGCCACCAGCCACTAGGGGGTGACCTTACTTTGT80
TGATGATTGTTATGACCGGG100
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ATCTACTCACATGGAGGAG19
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CGGTCATAACAATCATCAAC20
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<212>DNA
<213>未知
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CTGAAGAGAGTATGACACTAATGTCTGCCCTGTGGCAGGA40
AGAGAAGGAGCATTAGAGACAGCAGTCGCTGTTCATTTAT80
TTGCAAAGGGAAAAAGAGAA100
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ATGAAGCAAGGCTCCATCATAACCGACACACACACACACA80
GAATTTGGTTTATGAATTAT100
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<213>未知
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TCCTCTAATGATCGGTGCACCAGATATAGCTTTCCCTCGA40
ATAAATAACATAAGCTTCTGACTTCTTCCTCCATCTTTCC80
TGCTCCTTTTAGCATCCTCTGGTGTAGAAGCTGGGGCTGG120
AACAGGCTGAACTGTCTATCCACCTTTAGCCGGAAACCTC160
GCTCATGCTGGGGCATCTGTTGATCTCACTATTTTTTCTC200
TTCATCTAGCAGGGATTTCATCAATTCTTGGGGCAATTAA240
TTTTATTACCACAATTATTAATATGAAACCTCCGGCAATT280
TCACAGTACCAAACACCCCTATTTGTTTGGAGCAGTACTA320
ATTACAGCT329
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<213>未知
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GCTCATGCTGGGGCATCTGTTGATCTCACTATTTTTTCTC200
TTCATCTAGCAGGGATTTCATCAATTCTTGGGGCAATTAA240
TTTTATTACCACAATTATTAATATGAAACCTCCGGCAATT280
TCACAGTACCAAACACCCCTATTTGTTTGGAGCAGTACTA320
ATTACAGCT329
Claims (10)
1.一种基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：样本采集：分别采集大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的组织样本多份；
S2：构建RAD文库：通过高通量测序技术获得步骤S1中所说的三种鳕鱼的基因序列，构建鳕鱼基因RAD文库；
S3：SNP calling：采用无参软件对步骤S2构建RAD文库进行Call SNP分析，筛选出三种鳕鱼均不相同的SNP位点；
S4：基因分型：获得每条鳕鱼的SNP及基因型，再根据步骤S3筛选出的三种鳕鱼均不相同的SNP位点，分别鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述采集大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的组织样本为肌肉组织，每种鳕鱼采集的样本份数不少于3份。
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：步骤S2中，所述构建RAD文库的高通量测序技术为采用BGISEQ-500测序技术；使用的引物接头为ad153接头，其序列为：
F：AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA，
R：AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTG；
所述使用的限制性内切酶为TaqⅠ。
4.根据权利要求1所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：步骤S3中，所述Call SNP分析软件为采用无参软件Stacks，其分析步骤为：
S3-1：Ustacks：根据三种鳕鱼的基因序列相似性找出核苷酸序列；
S3-2：Cstacks：将变异的核苷酸序列汇总；
S3-2：Sstacks：过滤掉低质量变异的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：
步骤S3-1中数据分析的参数为：-m 2 -M 2 -p 15；
步骤S3-2中数据分析的参数为：-b 1 -n 3 -p 15；
步骤S3-3中数据分析的参数为：-p 15 -b 1。
6.根据权利要求1所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：步骤S3中，经过Call SNP分析，初步选到的SNP位点为6941个；基于每种鱼80%以上的个体一致的基因型，筛选出三种鳕鱼均不相同的基因型，满足以上2个条件的SNP位点共为7个。
7.根据权利要求1所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：还包括引物验证步骤，筛选出三种鳕鱼均不相同的基因型的SNP位点后，需设计引物获得PCR产物并测序验证。
8.根据权利要求7所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：经引物验证后，获得4个SNP位点可用于鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼；该4个SNP位点均包括3个特异碱基，其扩增引物序列、扩增的序列长度及各SNP位点特异碱基位于该序列中的位置分别为：
F1：CAGATACCCTCGAATA，
R1：CAAACAAATAGAGGGGTTTGGTA；
扩增的序列1长度为329bp；SNP1的位置为：82bp、112bp、220bp；
F2：CCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAAT，
R2：AGAAAAAATAGTTAGGTCAACGGATGC；
扩增的序列2长度为191bp；SNP2的位置为：75bp、104bp、136bp；
F3：ATTCGGGCAGAACTAAGCCAACCTG，
R3：CTCATGTTATTTATTCGAGGGAAAGC；
扩增的序列3长度为193bp；SNP3的位置为：127bp、163bp、199bp；
F4：CATCTTCAGGTGTAGAAGCTGGGG，
R4：TGAGAAATTGCCGGGGGTTTCAT；
扩增的序列4长度为192bp；SNP4的位置为：52bp、76bp、127bp。
9.根据权利要求8所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼的各SNP位点的特异碱基分别是：
大西洋鳕鱼：SNP1：G、T、A；
SNP2：A、T、T；
SNP3：G、A、T；
SNP4：T、T、A；
格陵兰扁鳕鱼：SNP1：T、C、G；
SNP2：C、A、A；
SNP3：A、C、A；
SNP4：A、C、G；
法国银鳕鱼：SNP1：A、A、T；
SNP2：T、G、C；
SNP3：T、G、C；
SNP4：C、A、T。
10.根据权利要求1所述的基于高通量测序鉴定鳕鱼的检测方法，其特征在于：步骤S4中，所述基因分型为采用撰写的perl脚本得到每条鳕鱼的SNP及基因型；所述鉴定大西洋鳕鱼、格陵兰扁鳕鱼和法国银鳕鱼为：将筛选出的SNP位点标记在大西洋鳕鱼的基因组中定位，挑出其前后长度为200bp的序列；设计特异引物扩增选定的序列，将呈阳性的结果送测，验证确定变异位点的碱基序列。
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