CN111850132B - 一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用，属于动物遗传育种技术领域。本发明中发现RAI14基因上游区域序列中第33‑95位63bp碱基序列的插入与鸡哥伦比亚羽性状具有密切的联系，因此本发明中利用RAI14基因上游区域的的特点，建立了针对该插入的PCR基因分型方法，进而可以对哥伦比亚羽鸡基因进行分型。本发明所提供的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法操作简单、检测快速、结果准确，有利于在育种实践中更有效、快速地对哥伦比亚羽性状进行选择，加快育种进展，节约育种成本，为哥伦比亚羽鸡性状的选育提供快捷的分子选育方法。

Description

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法 及应用

技术领域

本发明涉及一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用，属于动物遗传育种技术领域。

背景技术

鸡的羽色十分丰富，是鸡的重要品种特征之一，也是鸡育种工作中一项重要选择指标。鸡的浅芦花羽也叫哥伦比亚羽，具体表现为：羽毛外观主体基本为白羽，颈部、翼部和尾部的羽毛末端有黑色横斑呈横斑浅芦花状，其为性连锁哥伦比亚羽。伴性哥伦比亚羽由于其特点鲜明，伴性遗传，获得了更多的关注和研究。

哥伦比亚羽作为一种性状，表现在豫粉1号H系中，国外具有哥伦比亚色洛克鸡。2004年开始，连续2年利用引进的巴布考克B-380祖代C系公鸡的混合精液，与固始鸡原始群体中哥伦比亚母鸡进行级进杂交，从中选出哥伦比亚羽的公母鸡，然后进行横交固定，闭锁繁育，获得豫粉1号鸡。自2008年开始又分快羽、慢羽进行家系选育，其中H系为快羽系、N系为慢羽系。鸡的羽色为质量性状，受众多基因控制，其遗传也是一个复杂的过程，目前没有较好的检测鸡哥伦比亚羽基因型的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物，能够较好的检测鸡的哥伦比亚羽基因型。

本发明还提供了鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，能够用于检测鸡的哥伦比亚羽基因型。

本发明还提供了鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，能够检测出鸡的哥伦比亚羽基因型。

本发明还提供了上述鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的应用，为鸡哥伦比亚羽品种的育种提供了一种新方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物，所述检测引物的PCR扩增序列覆盖如SEQID NO.1所示序列的第33-95位。

如SEQ ID NO.1所示序列为RAI14基因上游区域序列，RAI14基因全称为维甲酸诱导蛋白14基因，是首先在肝脏中鉴定的肌动蛋白结合蛋白。在人体内，RAI14基因在外质特化中发挥肌动蛋白调节作用，对于精子极性的建立和正常精子细胞的粘附极其重要，也可能促进血睾屏障的Sertoli细胞紧密连接的完整性；在鸡体内，RAI14基因位于Z染色体上，有2个转录物(剪接变体)。本发明中发现RAI14基因上游区域序列第33-95位63bp碱基序列的插入与鸡哥伦比亚羽性状具有密切的联系，属于鸡伴性哥伦比亚羽基因，因此本发明中利用RAI14基因上游区域的63bp碱基序列插入的特点，建立了针对该插入的PCR基因分型方法，进而可以对哥伦比亚羽鸡基因进行分型。

优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′(如SEQ ID NO.4所示)。

上述引物扩增片段的大小分别为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为Z^H型；194bp为63bp碱基序列缺失，为Z^h型。

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含检测引物，所述检测引物的PCR扩增序列覆盖如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位。

本发明中的检测试剂盒包含鸡哥伦比亚羽基因型检测引物，能够对哥伦比亚羽鸡基因进行分型。

优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′。

上述引物扩增片段的大小分别为257bp或者194bp(如SEQ ID NO.2所示)，257bp为63bp碱基序列插入，为Z^H型；194bp为63bp碱基序列缺失，为Z^h型。

优选的，上述试剂盒中还包括2×Taq PCR masterMix。提供PCR扩增反应所需物质。

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，包括以下步骤：1)以待测鸡的基因组DNA为模板，用检测引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述检测引物的PCR扩增序列覆盖如SEQID NO.1所示序列的第33-95位；2)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果鉴定鸡哥伦比亚羽的基因型。

本发明中的检测方法能够检测出如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位为插入/缺失，进而检测出鸡哥伦比亚羽的基因型。该方法具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确，有利于在育种实践中更有效快速地对哥伦比亚羽性状进行选择，加快育种进展，节约育种成本，为哥伦比亚羽鸡性状的选育提供快捷的分子选育方法。

具体的，所述基因型为哥伦比亚羽基因型、非哥伦比亚羽基因型；所述哥伦比亚羽基因型为Z^HZ^H、Z^HW或Z^HZ^h基因型，非哥伦比亚羽基因型为Z^hZ^h或Z^hW基因型；其中Z^H表现为如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位插入，Z^h表现为如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位缺失。

该方法中利用鸡的性别作为辅助，可以明确鸡哥伦比亚羽基因型。

优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′。

上述引物扩增片段的大小分别为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为Z^H型；194bp为63bp碱基序列缺失，为Z^h型。

具体的，其中Z^H的PCR扩增产物大小为250bp-270bp，Z^h的PCR扩增产物大小为180bp-200bp。

在实际的实验中，难以精确的辨认的PCR扩增产物大小，因此当PCR扩增产物大小为250bp-270bp时即可判断为Z^H型；当PCR扩增产物大小为180bp-200bp时，即可判断为Z^h型。

上述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法在鸡育种方面的应用。

根据鸡的哥伦比亚羽基因型，可以定向的选择出特定基因型的鸡，富集某种基因型，进行品种育种。

附图说明

图1为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2中技术流程示意图；

图2为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2中构建的羽色分离遗传群体示意图；

图3为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2中羽色分离资源群体中PCR扩增以后的电泳检测结果图；其中1-12泳道为待测鸡的基因型，M为marker；

图4为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例3中7个不同品种中PCR扩增以后的电泳检测结果图；其中1-12泳道为待测鸡的基因型，M为marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物的实施例1

本实施例中鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒的实施例1

本实施例中鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒中包括：检测引物，2×Taq PCRmasterMix，ddH₂O。其中2×Taq PCR masterMix由康维世纪生物科技有限公司提供，产品编号Lot01036/30146。

检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例1

本实施例中的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，包括以下步骤：

1)以待测鸡的基因组DNA为模板，用检测引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′。

2)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果鉴定鸡哥伦比亚羽的基因型。

上述步骤1)中PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR masterMix 5μL、P-F 0.5μL、P-R0.5μL、DNA模板1.0μL、ddH₂O 3μL。

上述步骤1)PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环；72℃延伸10min。

上述步骤2)中琼脂糖凝胶浓度为2.0％。

上述步骤2)中琼脂糖电泳缓冲液浓度为1×TBE。

上述步骤2)中琼脂糖电泳电压为120V，电流110A，电泳时间为30min。

所述基因型为哥伦比亚羽基因型、非哥伦比亚羽基因型；所述哥伦比亚羽基因型为Z^HZ^H、Z^HW或Z^HZ^h基因型，非哥伦比亚羽基因型为Z^hZ^h或Z^hW基因型；其中Z^H表现为如SEQ IDNO.1所示序列的第33-95位插入，Z^h表现为如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位缺失；其中Z^H的PCR扩增产物大小为250bp-270bp，Z^h的PCR扩增产物大小为180bp-200bp。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2

本实施例的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤：

1)试样的制备与保存

黄麻羽固始公鸡15只、哥伦比亚羽豫粉1号蛋鸡配套系H系母鸡150只，并以此为亲本构建遗传群体(如图2所示)，其中F1代哥伦比亚羽公鸡39只和黄麻羽母鸡38只；F2代鸡是2只F1代哥伦比亚羽公鸡与20只F1代黄麻羽母鸡进行杂交的后代，包括哥伦比亚羽公鸡181只、哥伦比亚羽母鸡212只、黄麻羽公鸡192只和黄麻羽母鸡186只；F3代A组选择F2的哥伦比亚羽公鸡和哥伦比亚羽母鸡杂交，产生哥伦比亚羽公鸡36只、哥伦比亚羽母鸡18只和黄麻羽母鸡22只；B组选择F2的哥伦比亚羽公鸡和黄麻羽母鸡杂交，产生哥伦比亚羽公鸡15只、哥伦比亚羽母鸡16只、黄麻羽公鸡15只和黄麻羽母鸡14只。采取待测鸡离体组织器官或血液，用蛋白酶K法提取DNA，将DNA样品保存于4℃冰箱备用。

2)引物设计

根据哥伦比亚羽鸡RAI14基因序列的上游区域(NC_006127.5g 10407224)的一段参考序列上下游序列，覆盖63bp碱基插入位点，设计如下引物对P：

上游引物P-F：5′-CGTATACACAGCCTGGCCTAA-3′；

下游引物P-R：5′-ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG-3′。

3)PCR扩增

PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR masterMix 5μL、P-F 0.5μL、P-R 0.5μL、DNA模板1.0μL、ddH₂O 3μL。

PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

4)基因型检测

PCR扩增产物采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液浓度为1×TBE，电压为120V，电流为110A，电泳时间30min，用凝胶电泳成像系统显像，得到电泳图谱，根据电泳图谱，检测基因型，具体依据为：

若只有257bp的片段，则为哥伦比亚羽纯合基因型(表型为哥伦比亚羽)，对应基因型为Z^HZ^H或Z^HW。Z^HZ^H基因型个体的两条Z^H染色体或Z^HW基因型个体的Z^H染色体在RAI14基因序列的上游区存在63bp碱基插入。

若存在257bp和194bp的片段，则为哥伦比亚羽杂合基因型(表型为哥伦比亚羽)，对应基因型为Z^HZ^h。Z^HZ^h基因型个体的Z^H染色体在RAI14基因序列的上游区存在63bp碱基插入；Z^HZ^h基因型个体的Z^h染色体在RAI14基因序列的上游区不存在63bp碱基插入。

若只有194bp的片段，则为非哥伦比亚羽纯合基因型(表型为非哥伦比亚羽)，对应基因型为Z^hZ^h或Z^hW。Z^hZ^h基因型个体的两条Z染色体或Z^hW基因型个体的Z染色体在RAI14基因序列的上游区不存在63bp碱基插入。

5)检测结果

具体的检测结果如图3所示。

黄麻羽固始公鸡分型结果为一条带，如图3中泳道7，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hZ^h型(非哥伦比亚羽纯合)；豫粉1号蛋鸡H系母鸡分型结果为一条带，如图3中泳道1，PCR扩增产物序列长度经过测序为257bp，判定其基因型为Z^HW型(哥伦比亚羽纯合)。

F1代公鸡(表型为哥伦比亚羽)分型结果为两条带，见图1中的泳道4；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp和257bp，判定其基因型为Z^HZ^h。F1代母鸡(表型为黄麻羽)分型结果为一条带，见图3中的泳道8；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型。

F2代鸡中的哥伦比亚羽公鸡分型结果为两条带，见图3中的泳道5；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp和257bp，判定其基因型为Z^HZ^h。F2代鸡中的哥伦比亚羽母鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道2；PCR扩增产物序列长度经过测序为257bp，判定其基因型为Z^HW型。F2代鸡中的黄麻羽公鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道9；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hZ^h。F2代鸡中的黄麻羽母鸡分型结果为一条带，见图1中的泳道10；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型。

F3代鸡中的哥伦比亚羽公鸡分型结果为两条带，见图3中的泳道6；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp和257bp，判定其基因型为Z^HZ^h。F3代鸡中的哥伦比亚羽母鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道3；PCR扩增产物序列长度经过测序为257bp，判定其基因型为Z^HW型。F3代鸡中的黄麻羽公鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道11；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hZ^h。F2代鸡中的黄麻羽母鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道12；PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型。

利用本发明对羽色分离资源群体的分型结果见表1，从表1可见利用该方法对F0、F1、F2、F3A组和B组鸡进行基因型鉴定结果与相应表型几乎完全一致，表明本方法鉴定结果是可靠的，也是正确的。此外，F1、F2、F3A组和B组鸡的羽色分离的遗传规律均符合孟德尔遗传规律，表明可以通过本发明的方法根据其基因型来判断待测鸡的羽色表型。

表1羽色分离资源群体中的哥伦比亚羽位点的判型结果

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例3

本实施例的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，主要包括以下步骤：

1)试样的制备与保存

固始鸡96只(黄麻羽)，卢氏鸡96只(黄麻羽)，长顺鸡绿壳蛋鸡96只(黄羽)，固始鸡和安卡鸡杂交的F2资源群体96只(GxA F2，黄羽)，隐性白羽鸡96只(白羽)，淅川乌骨鸡96只(白羽)，AA鸡96只(白羽)，东乡鸡绿壳蛋鸡96只(黑羽)。采取待测鸡离体组织器官或血液，用蛋白酶K法提取DNA，将DNA样品保存于4℃冰箱备用。

步骤2)、步骤3)和步骤4)同鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2。

5)检测结果

检测结果如图4中所示。固始鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道1，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型；卢氏鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道2、3，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型；长顺鸡绿壳蛋鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道4，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型；固始鸡和安卡鸡杂交的F2资源群体分型结果为一条带，见图4中的泳道5、6，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型；淅川乌骨鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道7、8，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型；AA鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道9、10，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型；东乡绿壳蛋鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道11、12，PCR扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为Z^hW型或Z^hZ^h型。利用本发明对7个不同品种鸡的分型结果如表2所示。

表2 7个不同品种的鸡在哥伦比亚羽位点的判型结果

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的应用的实施例1

本实施例的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的应用，包括如下步骤：

(1)选取地方品种中突变出的哥伦比亚羽色公、母鸡；

(2)公母鸡杂交自繁，利用本发明专利的方法检测杂交后代鸡哥伦比亚羽基因型；

(3)选留携带Z^HZ^H基因型的公鸡和携带Z^HW基因型的母鸡；

(4)将步骤(3)中得到的公母鸡杂交得到后代鸡，即为基于本分子标记(63bp插入)培育的哥伦比亚羽鸡纯系。

<110> 河南农业大学

<120> 一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 257

<212> DNA

<213> 鸡

<221> 63bp插入的RAI14基因上游区域序列

<400> 1

cgtatacaca gcctggccta actccaagca atctgctcca gtttatcaag tgaacatcac 60

acgtttggaa gttgtctgca aacttattga cttccctgct ccagtttatc aagtgaacat 120

cacacgtttg gaagttgtct gcaaacttat tgacttccct gccacatgaa ctcccgtaga 180

gacctgaaaa cagccccttc cctgatcccc acagaatctc cttgtgcttc ctgctccact 240

ccaccacaca caggaat 257

<211> 194

<212> DNA

<213> 鸡

<221> 63bp缺失的RAI14基因上游区域序列

<400> 2

cgtatacaca gcctggccta actccaagca atctgctcca gtttatcaag tgaacatcac 60

acgtttggaa gttgtctgca aacttattga cttccctgcc acatgaactc ccgtagagac 120

ctgaaaacag ccccttccct gatccccaca gaatctcctt gtgcttcctg ctccactcca 180

ccacacacag gaat 194

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 上游引物P-F

<400> 3

cgtatacaca gcctggccta a 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 上游引物P-R

<400> 4

attcctgtgt gtggtggagt g 21

Claims (9)

1.一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物，其特征在于：所述检测引物的PCR扩增序列覆盖如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位；所述PCR扩增序列的大小分为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为Z^H型，如SEQ ID NO.1所示序列；194bp为63bp碱基序列缺失，为Z^h型，如SEQ ID NO.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物，其特征在于：所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′- CGTATACACAGCCTGGCCTAA -3′；

下游引物P-R：5′- ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG -3′。

3.一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中包含检测引物，所述检测引物的PCR扩增序列覆盖如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位；所述PCR扩增序列的大小分为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为Z^H型，如SEQ ID NO.1所示序列；194bp为63bp碱基序列缺失，为Z^h型，如SEQ ID NO.2所示序列。

4.根据权利要求3所述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，其特征在于：所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′- CGTATACACAGCCTGGCCTAA -3′；

下游引物P-R：5′- ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG -3′。

5.根据权利要求3所述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，其特征在于：还包括2×Taq PCR masterMix。

6.一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）以待测鸡的基因组DNA为模板，用检测引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述检测引物的PCR扩增序列覆盖如SEQ ID NO.1所示序列的第33-95位；所述PCR扩增序列的大小分为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为Z^H型，如SEQ ID NO.1所示序列；194bp为63bp碱基序列缺失，为Z^h型，如SEQ ID NO.2所示序列；

2）对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果鉴定鸡哥伦比亚羽的基因型。

7.根据权利要求6所述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，其特征在于：所述基因型为哥伦比亚羽基因型、非哥伦比亚羽基因型；所述哥伦比亚羽基因型为Z^HZ^H、Z^HW或Z^HZ^h基因型；非哥伦比亚羽基因型为Z^hZ^h或Z^hW基因型。

8.根据权利要求7所述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，其特征在于：所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物P-F：5′- CGTATACACAGCCTGGCCTAA -3′；

下游引物P-R：5′- ATTCCTGTGTGTGGTGGAGTG -3′。

9.如权利要求6所述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法在鸡育种方面的应用。

Images