CN104004836A - 鳕科鳕鱼成分的实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。首次揭示一种可特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的引物，所述引物针对含有鳕科鳕鱼成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有鳕科鳕鱼成分的DNA不发生特异性扩增。采用本发明的方法，具有良好的再现性、灵敏度。

Description

鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明涉及物种检测领域，更具体地，本发明涉及鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。 

背景技术

鳕科鳕鱼(Gadidae)属脊椎动物门(Vertebrata)、真骨鱼纲(Teleostei)、鳕形目(Gadiformes)。鳕鱼具有高营养、低胆固醇、易于被人体吸收等优点。鳕科鳕鱼是最常见的鳕鱼种类，有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类，已知全世界鳕科鳕鱼类有50多种，它们中大多数分布于大西洋北部大陆架海域；重要鱼种有太平洋鳕、大西洋鳕、黑线鳕、蓝鳕、绿青鳕、牙鳕、挪威长臂鳕和狭鳕等。世界鳕鱼的年产量约占世界鱼产量的15-18％。鳕科鳕鱼中最主要的狭鳕，主要生产国为苏联、日本、朝鲜及美国等，其次为大西洋鳕，主要生产国有加拿大、冰岛、挪威、丹麦、英国、苏联等，我国生产的鳕鱼是叫做太平洋鳕鱼(俗称大头鳕)，我国市面上较常见的鳕鱼有大西洋鳕、太平洋鳕、狭鳕、黑线鳕等，大部分属于鳕科。近些年来市场上鳕鱼及其制品的消费逐渐上升，然而过度捕捞和缺乏保护措施，鳕鱼的资源量大减，不法商贩以低价值鱼及其制品代替鳕鱼及其制品出售，牟取暴利，一方面大大损害了消费者的利益，另一方面也造成了不正当的商业竞争。1999年12月17日，欧洲委员会制定了104/2000号法令，该法令针对的是渔业、农业产品市场的参与者，法令规定鱼类及其制品除非贴上商品名称、生产方法和捕获区域的标签，否则该鱼类及其制品不能用于零售。该法令强制所有成员国制定并发布一项名单，名单包括能在商业上获得的鱼类的俗名和学名。在市场上出售的鳕鱼制品中，物种的原始可识别形态特征消失，这使得物种的鉴别变得相对困难。建立一种可以对鳕科鳕鱼DNA进行特异性检测的准确性高、实用性强的方法非常必要的。 

国内外学者运用普通PCR方法和实时荧光PCR方法对大西洋鲑、黄鳍金 枪鱼、长鳍金枪鱼、鲨鱼等鱼类物种鉴定做了大量研究。国外已有研究报道检测鉴别大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、狭鳕等鳕科的某一物种，Beatriz Herrero等用TaqMan实时荧光PCR检测新鲜、冷藏、加工的产品中的大西洋鳕鱼成分。鶴田小百合等根据cyt b基因设计了特异性引物，建立了TaqMan实时荧光PCR检测和鉴定太平洋鳕，阿拉斯加狭鳕的方法。Martin I.Taylor等建立了实时荧光PCR同时鉴定大西洋鳕，黑线鳕和牙鳕的方法。 

然而，鉴于鳕科鳕鱼难以找到有代表性的检测手段，目前本领域未见鳕科鳕鱼的检测方法的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。 

在本发明的第一方面，提供一种特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针进行实时荧光PCR检测。 

在一个优选例中，所述的待测样品是食品、饲料、水产品或遗传物质材料。 

在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为0.1ng/μL鳕科鳕鱼DNA。 

在另一优选例中，所述的鳕科鳕鱼选自：蓝鳕(Micromesistius poutassou)、南鳕(mutaenolepis microps)、黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)、狭鳕(Theragra chalcogramma)、青鳕(Pollachius pollachius)、太平洋鳕(Gadus macrocephalus)、大西洋鳕(Gadus macrocephalus)、青绿鳕(Pollachius virens)。 

在本发明的另一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。 

在本发明的另一方面，提供一种探针，所述的探针序列如SEQ ID NO:3所示。 

在本发明的另一方面，提供所述的引物和/或所述的探针的用途，用于从 待测样品中鉴定鳕科鳕鱼成分。 

在本发明的另一方面，提供一种鉴定鳕科鳕鱼成分的试剂盒，其中包括所述的引物和/或所述的探针。 

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：含有鳕科鳕鱼成分的检测标准品。 

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鳕科鳕鱼成分的方法的使用说明书。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、鳕科鳕鱼成分的物种特异性实时荧光PCR检测图。 

1：狭鳕；2：青鳕；3：太平洋鳕；4：大西洋鳕鱼；5：青绿鳕；6：蓝鳕；7：黑线鳕；8：南鳕。 

图2、鳕科鳕鱼DNA配比的实时荧光PCR检测灵敏度图。 

1：0.1ng/μL太平洋鳕DNA；2：0.1ng/μL大西洋鳕DNA；3：0.1ng/μL狭鳕DNA；4：0.1ng/μL青绿鳕DNA；5：0.1ng/μL青鳕DNA。 

图3、鳕科鳕鱼粉重量比的实时荧光PCR检测灵敏度图。 

1：0.01％太平洋鳕；2：0.01％大西洋鳕；3：0.01％狭鳕；4：0.01％青绿鳕；5：0.01％青鳕。 

图4、实际样品检测结果。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定鳕科 鳕鱼成分(较佳地选自蓝鳕、南鳕(mutaenolepis microps)、黑线鳕、狭鳕、青鳕、太平洋鳕、大西洋鳕、青绿鳕)的引物，所述引物针对含有鳕科鳕鱼成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有鳕科鳕鱼成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定鳕科鳕鱼成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。 

鳕鱼的品种非常多，鳕形目下包括鳞鳗鳕亚目、鳕亚目、长尾鳕亚目和蛇鳚亚目4亚目11个科约162属708种。目前常被捕捞的主要包括鳕科、无须鳕科和长尾鳕科的鳕鱼。鳕科鳕鱼包括有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类，已知全世界鳕科鳕鱼类有50多种，它们中大多数分布于大西洋北部大陆架海域；重要鱼种有太平洋鳕、大西洋鳕、黑线鳕、蓝鳕、绿青鳕、牙鳕、挪威长臂鳕和狭鳕等。 

鉴于鳕鱼种类繁多，从如此多的种类中找到对于鳕科鳕鱼特异性的鉴定试剂非常困难。需要考虑的不仅仅是鳕科鳕鱼这类物种的基因序列，而是需要考虑不要与其它与之具有亲缘关系的诸多物种产生交叉反应，这是非常困难的。例如，澳洲无须鳕、阿根廷无须鳕、南非无须鳕、北太平洋无须鳕为无须鳕科的物种，它们并非鳕科的物种，但要将它们与鳕科鳕鱼区分，目前而言尚缺乏检测手段。 

为此，本发明人经过了长期的研究和筛选，深入比对鳕科鳕鱼物种内的保守性和非鳕科鳕鱼物种间的差异性，经过针对各种样本的反复试验验证，最终确定了适用于鉴定鳕科鳕鱼的特异性引物和探针序列，即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针。 

如本文所用，所述的“鳕科鳕鱼成分”是指特异性来自于鳕科鳕鱼(Gadidae)的成分，可以是鳕科鳕鱼本身或其加工产品。 

所述的“鳕科鳕鱼(Gadidae)”是鳕形目(Gadiformes)下面的“鳕科”的物种。较佳地，所述的鳕科鳕鱼包括：蓝鳕、南鳕、黑线鳕、狭鳕、青鳕、太平洋鳕、大西洋鳕、青绿鳕。一些被俗称为“鳕鱼”的非鳕形目的鱼类(如银 鳕鱼或蓝鳕鱼)或其加工产品不被包含在所述的“鳕形目”中。 

本发明人通过对引物的筛选，获得一种可特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的引物，其对于鳕科鳕鱼的DNA发生特异性扩增，而对没有鳕科鳕鱼成分的DNA不发生特异性扩增。 

因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。 

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。 

本发明还提供一种探针，所述的探针具SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是Taqman探针，从而便于实时荧光检测。 

利用本发明的引物及探针，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有鳕科鳕鱼成分，而且所需的样品量很少，对于微量的鳕科鳕鱼成分也能检出(0.1ng/μL鳕科鳕鱼DNA)。 

基于本发明所提供的适用于鉴定鳕鱼成分的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定鳕科鳕鱼成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鳕科鳕鱼成分。 

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。 

作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用Taqman实时荧光PCR方法来进行鳕科鳕鱼成分的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。 

本发明还涉及一种用于鉴定鳕科鳕鱼成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO:3所示的探针。 

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定鳕科鳕鱼成分的试剂，如(但不限于)： 

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或 

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或 

(C)提取DNA的试剂盒。 

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定鳕科鳕鱼成分的使用说明书和/或标准操作程序。 

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测鳕科鳕鱼成分的目的。 

本发明的主要优点在于： 

(1)首次揭示一种可特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的引物，所述的引物特异性良好，对于鳕科鳕鱼以外的其它通常用作仿制鳕科鳕鱼成分的物质则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。 

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测鳕科鳕鱼成分，从待测样品中快速准确地区分真假鳕科鳕鱼成分，并且所需样品量少，操作简单。 

(3)本发明应用Taqman实时荧光PCR技术，可快速实现食品中鳕科鳕鱼源性成分的准确鉴定。 

(4)首次建立水产品、食品、遗传物质材料、基因或核苷酸混合液中鳕科鳕鱼的实时荧光PCR检测方法。本发明为保障产品的质量、保护消费者知情权和选择权，遗传物质种类鉴定等提供了有效的技术支撑。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

1材料与方法 

1.1试验材料、试剂与仪器 

鳕鱼样品：太平洋鳕(Gadus macrocephalus)、大西洋鳕鱼(又称真鳕，Gadus morhua)、黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)、青绿鳕(Pollachius virens)、蓝鳕(Micromesistius poutassou)、青鳕(Pollachius pollachius)、狭鳕(Theragra chalcogramma)，南鳕(mutaenolepis microps)，澳洲无须鳕(Merluccius australis)、南非无须鳕(Merluccius capensis)、阿根廷无须鳕(Merluccius hubbsi)、北太平洋无须鳕(Merluccius productus)。由上海进出口口岸提供或购自上海市农贸市场或超市。 

非鳕鱼，但常被冠名“鳕鱼”的样品：油鱼(Ruvettus pretiosus)；裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)(常被称为“银鳕鱼”)；新西兰拟鲈(Parapercis colias；又称新西兰鳕鱼)(常被称为“蓝鳕鱼”，或被称为Blue cod，"New Zealand Cod")；黑鳕鱼(Notothenia microlepidota)(鲈形目的鱼种，非鳕鱼)。由上海进出口口岸提供或购自上海市农贸市场或超市。 

其它鱼样品：鳜鱼(Siniperca spp.)、鲥鱼(Hilsa reevesi)、鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)、鲫鱼(Carassius auratus)、花鲢(Aristichthysnobilis)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、凤尾鱼(Engraulis encrasicholus)、蓝鳍金枪鱼(Thunnus Maccoyii)、海鲈(Lateolabraxjaponicus)、鳊鱼(Carnis Megalobramae)、金线鱼(Nemipterus virgatus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、黄鳍棘鲷鱼(Sparus latus Houttuyn)、黄菇鱼(Nibea albiflora)、石斑鱼(Epinephelussp)、马鲛鱼(Scomberomorus niphonius)、庸鲽(Hippoglossus)、笋壳鱼(Oxyeleotris marmorata)、真鲷(Pagrosomus major)、大西洋鲑(Salmo salar)、鳗鱼(Anguilla rostrata)、黑鱼(Channa argus)、鳀鱼(Engraulis japonius)、安康鱼(Lophius Litulon)、巴沙鱼(Pangasius bocourti)、长江回鱼(Leiocassis longirostris)、黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)、孔鳐(Raja porosa Gunther)、蓝鲨(Prionace glauca)、鳟鱼(Squaliobarbus curriculus)、白水鱼(Erythroculter ilishaeformis)、秋刀鱼(Cololnbis snira)、剑鱼(Ziphias gladius)、虎头鱼(Sebastiscus marmoratus)、接吻鱼(Helostoma temmincki)、黄鱼(Pseudosciaena polyactis Bleeker)、舌鳎(Cynoglossus)、带鱼 (Coiliaspp.)、牛蛙(Rana catesbeiana)、鳌虾(Cherax spp.)，由上海进出口口岸提供或购自上海市农贸市场或超市。 

其他动植物成分：牛、羊、鸡、鸭、鹅、驴、猪、骆驼、小鼠、马、鹌鹑、鸽子、兔、鹿、小麦、黄豆、绿豆、大米、玉米、花生、腰果、马铃薯、杏仁、胡萝卜、西红柿、芹菜、海带、甜瓜，购自上海超市或来自实验室储备。用于鳕科鳕鱼成分的特异性检测。 

鳕鱼切片、鳕鱼扒、真鳕鱼扒、鳕鱼罐头、鳕鱼酱等23份鳕鱼样品，购于上海超市由上海进出口口岸提供，用于方法的实际应用。 

实时荧光PCR混合液Taqman Gene Expression Master Mix(AB公司)，基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；ABI7300实时荧光PCR仪，核酸蛋白分析仪，台式高速冷冻离心机，冷冻研磨机。 

1.2方法 

1.2.1样品制备 

使用冷冻研磨机(SPEX6850)将上述样品磨成粉末状，用于物种特异性检测。挑选常见的有代表性的太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、青绿鳕、青鳕5种鳕鱼肉，研磨成粉状后，80℃烘干12h。并用草鱼肉粉将上述5种鳕鱼肉粉样品配制各鳕鱼肉粉含量为0.01％和0.001％(W/W)的样品，用于灵敏度测试。 

1.2.2DNA提取 

使用天根海洋动物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，目录号：DP324)提取鳕鱼及其它鱼类样本DNA、动物基因组提取试剂盒(目录号：DP323)提取动物样本DNA、植物基因组提取试剂盒(目录号：DP305)提取植物样本DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。用BioPhotometer plus核酸蛋白含量测定仪(Eppendorf)测定DNA浓度，置于-20℃保存备用。 

用1×TE缓冲液将太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、青绿鳕、青鳕DNA溶液分别稀释成0.01ng/μL、0.001ng/μL的DNA样品。用于灵敏度测试。 

1.2.3检测引物及探针的获得 

针对大量的基因进行筛选，通过比对鳕科鳕鱼与其它鳕科鱼类的多种基 因，包括：18S rRNA、D-loop、ITS、SypI、HbI、PanI(Pantophysin I gene)、transterrin gene、16S rRNA、12S rRNA、5S rRNA、COI、Cytb、ATPase等等；核苷酸序列，比对这些基因在非鳕科的鳕鱼目鳕鱼、常见动植物差异性。经过深入比对鳕科鳕鱼物种内的保守性和非鳕科鳕鱼物种间的差异性，以大量基因及其特定位点为筛选对象，经过针对各种样本的反复试验验证，最终确定了具有如下物种特异性的引物、探针序列。 

鳕科鳕鱼检测用引物与探针序列为： 

上游引物：5’-CCATCCAATCCTAAAAATTGCTAAT-3’(SEQ ID NO:1)； 

下游引物：5’-AAGTTGAGTAATTARRCAAAGRCCTA-3’(SEQ ID NO:2)； 

探针(Taqman-MGB探针)：5’-FAM-TCAGTATGATGAAAYTT-MGB-3’(SEQ ID NO:3)。 

1.2.4PCR扩增 

使用18S rRNA基因扩增真核生物内源基因，以确保所提取的DNA适合于PCR扩增。检测所用18S rRNA基因引物序列为： 

5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO:4)；和 

5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO:5)。 

PCR反应体系为：1×PCR缓冲液，2.5mmol/L Mg²⁺，1U Taq酶，200μmol/LdNTPs，引物100nmol/L，模板50-100ng，反应体积为25μL。扩增条件为：94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40个循环；72℃，5min。取10μLPCR产物，加1μL10×上样缓冲液点样进行电泳，凝胶成像系统记录电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2.0％。 

实时荧光PCR采用25μL反应体系：2×PCR反应预混液(ABI Taqman Gene Expression Mater Mix，Part No.4369016)12.5μL，引物(5μmol/L)各1.5μL，探针(5μmol/L)0.5μL，模板DNA(10～100ng)1.0μL，用去离子水补足体系。扩增条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s，共40个循环。使用ABI7300实时荧光PCR仪进行定性检测。 

2、实施例 

实施例1、真核生物特异引物18S rRNA引物的检测结果 

用真核生物18S rRNA特异引物扩增本实验提取的所有DNA溶液，所有DNA溶液均能出现137bp的特异扩增条带。结果表明，所有抽提的DNA溶液均适合于PCR测试。 

实施例2、鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR特异性检测 

使用鳕科鳕鱼成分检测引物和探针对供试的84种动植物材料DNA样品进行检测。其中大西洋鳕鱼、南鳕、黑线鳕、青绿鳕、太平洋鳕、青鳕、蓝鳕、狭鳕出现明显的扩增曲线，而在其它物种DNA样品中均无扩增(图1)。检测结果见表1。这说明该检测方法具有物种特异性。 

表1、鳕科鳕鱼成分特异性检测结果 

实施例3、鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测灵敏度 

用1×TE缓冲液将太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、青绿鳕、青鳕DNA溶液分别稀释成0.1ng/μL、0.01ng/μL的DNA溶液。使用本发明人筛选到的鳕科鳕鱼成分特异性引物和探针对0.1ng/μL、0.01ng/μL鳕鱼DNA溶液进行实时荧光PCR测试。实验重复20次。在20次检测中，5种0.1ng/μL鳕鱼DNA溶液中均出现扩增曲线，5种0.01ng/μL鳕鱼DNA溶液中未全部出现扩增曲线，如图2。实验表明，在DNA浓度的水平上，该方法的检测灵敏度为0.1ng/μL鳕鱼DNA。 

用草鱼肉粉将太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、青绿鳕、青鳕5种鳕鱼肉粉样品配制各鳕鱼肉粉含量为0.01％和0.001％(W/W)的样品，使用鳕科鳕鱼特异性引物和探针对0.01％、0.001％鳕鱼粉含量(W/W)的样品DNA进行检测。在20次检测中5种0.01％鳕鱼粉均出现扩增曲线，5种0.001％鳕鱼粉未全部出现扩增曲线(图3)。实验表明，在重量百分比水平上，该方法的检测灵敏度为0.01％(W/W)。 

实施例4、食品中鳕科鳕鱼成分检测的应用 

市场上收集鳕鱼切片、鳕鱼扒、真鳕鱼扒、鳕鱼罐头、鳕鱼酱等13份鳕 鱼样品进行检测。 

使用本发明人筛选到的鳕科鳕鱼成分特异性引物和探针进行荧光PCR检测。结果，在6份检出鳕科鳕鱼成分，7份鳕鱼样品未检出鳕科鳕鱼成分，其中有1份真鳕鱼扒中未检出鳕科鳕鱼成分。结合后续追踪调查结果显示，本发明的方法检测的结果与真实用料是相符的。 

结论与讨论 

本发明提供的鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法，特异性强，灵敏度高，DNA浓度灵敏度可达0.1ng/μL，鳕鱼肉粉的重量灵敏度可达0.01％(W/W)，具有很高的可操作性和实用性，可广泛用于市场上常见鳕鱼产品的真实性检测。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针进行实时荧光PCR检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品、饲料、水产品或遗传物质材料。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为0.1ng/μL鳕科鳕鱼DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鳕科鳕鱼选自：蓝鳕(Micromesistius poutassou)、南鳕(mutaenolepis microps)、黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)、狭鳕(Theragra chalcogramma)、青鳕(Pollachiuspollachius)、太平洋鳕(Gadus macrocephalus)、大西洋鳕(Gadus macrocephalus)、青绿鳕(Pollachius virens)。

5.一种引物，其特征在于，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

6.一种探针，其特征在于，所述的探针序列如SEQ ID NO:3所示。

7.权利要求5所述的引物和/或权利要求6所述的探针的用途，用于从待测样品中鉴定鳕科鳕鱼成分。

8.一种鉴定鳕科鳕鱼成分的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求5所述的引物和/或权利要求6所述的探针。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：含有鳕科鳕鱼成分的检测标准品。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鳕科鳕鱼成分的方法的使用说明书。