CN110373472B - 一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法 - Google Patents

一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法，属于分子生物技术领域，提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法包括总DNA提取；以线粒体12S rRNA基因的部分序列作为分子标记序列进行PCR扩增；PCR产物的回收纯化；测序。提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物，正向引物序列：5’‑GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC‑3’；反向引物序列为：5’‑CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG‑3’。该方法能够减少聚合酶的错配率，保证PCR的产量和产物特异性。提供的分子标记引物特异性强，能与目标片段很好的配对结合，从而提高物种鉴定的准确性，且操作简单，易于掌握。

Description

一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法。
背景技术
三色菖鲉隶属于鮋形目、鮋科、菖鲉属，中国目前仅在台湾近海有分布。其外部形态与褐菖鲉极为相似：背鳍XII 11-13；臀鳍III-13；胸鳍17-19(主要18)；腹鳍17-23，侧线鳞49-54；体中长，侧扁，长椭圆形，背缘弧形，腹缘浅弧形。躯干前半部稍高，腹鳍基部处体最高，躯干长约等于尾长；尾柄低长，很侧扁，尾柄长约为尾柄高1.3-1.5倍。背鳍起点位于鳃盖骨上棘前上方；腹鳍中大，胸位，后缘与胸鳍后缘齐平，鳍棘细长，为第一鳍条长4/5，第二鳍条最长，约为头长1/2，第五鳍条鳍膜连于体壁。尾鳍后缘截形或微圆凸，长约为头长3/5。体褐红色，体侧有5～6条较明显褐色横纹，第一至第五横纹在侧线下方分散成云状或网状。背鳍具斑点和斑块。胸鳍具斑块和1至数行斑点。尾鳍具斑块和斑点。三色菖鲉同褐菖鲉一样，皆为近岸重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此，一种具有区分褐菖鲉和三色菖鲉的可靠标准的方法将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
现有技术如授权公告号为CN 105648105 B的中国发明专利，公开了一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法，所述柿cpDNA分子标记的扩增引物如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。所述利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法包括如下步骤：利用分子标记引物PCR扩增标准种质，目标种质即为待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，所用分子标记的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。该方法操作简单、重现性好、效率高，可以有效的鉴别未知材料为柿种或其他柿属植物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能与目标片段很好的配对结合，不易与线粒体假基因结合，提高物种鉴定的准确性，有助于解决菖鲉属鱼类种质混杂问题的鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，该方法所用PCR扩增的反应体系能够提高聚合酶的稳定性，减少聚合酶的错配率；保护DNA模板，减少嘌呤断裂和脱嘌呤的情况出现；抑制磷酸基团和EDTA与Mg2+结合，保证最适Mg2+浓度，保证PCR的产量和产物特异性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，包括以下步骤：
S1：总DNA提取；
S2：以线粒体12S rRNA基因的部分序列作为分子标记序列进行PCR扩增；
S3：PCR产物的回收纯化；
S4：测序；
其中，PCR扩增用分子标记引物包括正向引物和反向引物：
正向引物序列为：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
反向引物序列为：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。线粒体DNA是核外DNA，由于它具有分子结构简单、母系遗传、进化速率快、缺少重组等特点，已成为群体遗传结构、地理变异、系统发育及物种特性研究等领域的有效的分子标记，作为线粒体上的一种核糖体RNA，12S rRNA在进化上较为保守，通常被用于科、属间遗传分化、系统发育和近缘物种鉴别等种及以上分类阶元的遗传学研究。采用PCR产物直接测序法比克隆测序法更为快速简便，节省成本，且特异性强，灵敏度高，重复性好。很多通用引物很容易发生错配，不能很好的与目标片段配对结合，从而得不到目标片段的扩增产物。核基因组中线粒体的DNA片段是由于线粒体基因向核基因的转移而造成的，这些线粒体来源的核DNA片段都是不能表达的假基因，很容易被通用引物从总DNA模板上优选扩增出来，有时比线粒体DNA更容易与通用引物结合，从而干扰线粒体基因组片段的扩增，与真实线粒体序列比较，受不同突变约束的线粒体假基因有着不同的遗传模式与进化模式，就DNA序列进化方面来看，线粒体假基因序列的核苷酸替代随机性更强，显示出更低的偏向性，颠换/转换与替换/沉默替代的比值一般都比较高，从而影响物种的鉴定。使用该分子标记引物，能与目标片段很好的配对结合，且不易与线粒体假基因结合，从而提高物种鉴定的准确性，且操作简单，易于掌握。
在一些实施方式中，总DNA提取的材料来源为肌肉组织。肌肉组织中线粒体含量丰富，可以降低线粒体假基因联合扩增的概率。
在一些实施方式中，PCR扩增的反应体系为：ddH2O 10.5-31.5μL，10×buffer1.5-4.5μL，dNTPs 1.2-3.6μL，Taq酶0.1-0.27μL，DNA模板0.6-1.8μL，分子标记引物各0.5-1.9μL。本发明提供的PCR扩增的反应体系能够在保证PCR产物量的同时尽量减少非特异性扩增的出现。
在一些实施方式中，DNA模板的浓度为40-80ng/μL。线粒体基因组在细胞中的拷贝数远远大于核基因组，稀释总基因组DNA同样可降低核基因被扩增的概率，当总基因组模板达到足够的稀释倍数，线粒体假基因将不再被扩增，但是当总基因组模板浓度在40ng/μL时，扩增出的条带很暗，为扩增12S rRNA基因片段的最低DNA模板浓度。
在一些实施方式中，PCR扩增的反应体系中添加有四氢呋喃。PCR产物的质量是测序成败的主要因素，与测序图谱的质量有着直接的关系。DNA聚合酶在PCR过程中会出现活力下降的情况，从而会增加非特异扩增和二聚体的出现，在PCR体系中加入四氢呋喃，能够提高聚合酶的稳定性，减少聚合酶的错配率，同时也可以保护DNA模板，减少嘌呤断裂和脱嘌呤的情况出现。
在一些实施方式中，PCR扩增的反应体系中添加有柠檬酸铵。Mg2+能够影响DNA聚合酶的活性和引物的退火，从而会影响PCR的产量和产物特异性，当PCR产量过低时，测序时，序列曲线的信噪比会明显减少，甚至得不到核苷酸的信号。一般来说，PCR反应体系中要求有一定浓度的游离Mg2+，浓度过低时没有PCR产物，浓度过高时则会导致非特异性产物的产生。磷酸基团和EDTA能够与镁离子络合，导致Mg2+量的降低，在PCR反应混合物中加入柠檬酸铵，能够抑制磷酸基团和EDTA与Mg2+结合，从而保证最适Mg2+浓度。
在一些实施方式中，PCR扩增程序为：94-95℃预变性4-5min，然后94-95℃变性44-46s，49-52℃退火44-46s，70-74℃延伸44-46s，进行33-37个循环，最后70-74℃延伸8-12min。本发明提供的PCR扩增程序有利于引物与模板的正确结合，很大程度上的减少引物与模板间的非特异性结合，提高了PCR的反应特异性，大大减少了给特异性扩增条带的出现。
在一些实施方式中，PCR产物的回收纯化采用玻璃奶法。PCR产物的质量是测序成败的主要因素，与测序图谱的质量有着直接的关系。由于PCR产物的纯度不够，其序列曲线会有噪峰出现，碱基不易判读，信号弱，核苷酸曲线的信噪比降低，可读序列短，因此，PCR特异产物的回收纯化是进行基于测序的基础。采用玻璃奶法回收的产物纯度和每次回收的稳定性均较高，且快速、安全、回收率高。
在一些实施方式中，测序方式为双向测序。双向测序是采用不同的引物，分别从两个方向对两条核苷酸链都进行测序，就是双向测序，该测序方法效率高、灵敏度高且准确性极高。
本发明的另一个目的在于提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法用分子标记引物，该分子标记引物能与目标片段很好的配对结合，不易与线粒体假基因结合，避免线粒体假基因的联合扩增，提高物种鉴定的准确性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法的分子标记引物，包括正向引物和反向引物,正向引物和反向引物的序列为：
正向引物：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
反向引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。很多通用引物很容易发生错配，不能很好的与目标片段配对结合，从而得不到目标片段的扩增产物。核基因组中线粒体的DNA片段是由于线粒体基因向核基因的转移而造成的，这些线粒体来源的核DNA片段都是不能表达的假基因，很容易被通用引物从总DNA模板上优选扩增出来，有时比mtDNA更容易与通用引物结合，从而干扰线粒体基因组片段的扩增，与真实线粒体序列比较，受不同突变约束的线粒体假基因有着不同的遗传模式与进化模式，就DNA序列进化方面来看，线粒体假基因序列的核苷酸替代随机性更强，显示出更低的偏向性，颠换/转换与替换/沉默替代的比值一般都比较高，从而影响物种的鉴定。本发明提供的分子标记引物特异性强，能与目标片段很好的配对结合，且不易与线粒体假基因结合，从而提高物种鉴定的准确性，且操作简单，易于掌握。
本发明的有益效果为：
1)本发明以线粒体12S rRNA作为分子标记，采用PCR产物直接测序法鉴别褐菖鲉和三色菖鲉，该方法快速简便，节省成本，且特异性强，灵敏度高，重复性好，采用玻璃奶法回收纯化PCR产物，得到的PCR产物纯度和每次回收的稳定性均较高，且快速、安全、回收率高；
2)本发明通过在PCR扩增的反应体系中添加有四氢呋喃，提高聚合酶的稳定性，减少聚合酶的错配率，同时也可以保护DNA模板，减少嘌呤断裂和脱嘌呤的情况出现；在PCR扩增的反应体系中添加有柠檬酸铵，能够抑制磷酸基团和EDTA与Mg2+结合，从而保证最适Mg2+浓度，进而保证PCR的产量和产物特异性；
3)本发明提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物，该分子标记引物能与目标片段很好的配对结合，且不易与线粒体假基因结合，避免线粒体假基因的联合扩增，从而提高物种鉴定的准确性，且操作简单，易于掌握。
附图说明
图1为本发明的实施例1的褐菖鲉和三色菖鲉线粒体12S rRNA基因的部分序列排序结果示意图；
图2为本发明的实施例1的PCR扩增产物电泳图；
图3为本发明的对比例1的PCR扩增产物电泳图；
图4为本发明的对比例2的PCR扩增产物电泳图。
附图标记说明：*表示相同的碱基序列位点；ZST代表浙江舟山三色菖鲉样品；ZSM代表浙江舟山褐菖鲉样品；QSM代表山东青岛褐菖鲉样品；FSM代表广西防城港褐菖鲉样；M代表50bp Maker。
具体实施方式
本申请提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，包括总DNA提取；以线粒体12SrRNA基因的部分序列作为分子标记序列进行PCR扩增；PCR产物的回收纯化；测序。该鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法所用的分子标记引物，包括正向引物和反向引物,正向引物和反向引物的序列为：
正向引物：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
反向引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
测序后，对褐菖鲉和三色菖线粒体DNA 12S rRNA基因168bp序列排序，可以看出褐菖鲉与三色菖鲉存在4个碱基的差异，表现为4个转换。其结果稳定，可重复性强。三色菖鲉舟山群体样品的扩增结果一致，表现出高度的一致性。同时，鉴别方法简单。
因此，本申请一方面提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，包括总DNA提取；线粒体12S rRNA基因的PCR扩增；CR产物的回收纯化；测序。
另一方面，提供本文描述的鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法所用的分子标记引物，包括正向引物和反向引物,正向引物和反向引物的序列为：
正向引物：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
反向引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
本文中在鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法的上下文中描述了许多实施方式。本领域普通技术人员将认识到，以下实施方式的详细描述仅是示例性的，而非旨在以任何方式进行限制。在本公开内容的教导下，对于本领域技术人员而言提出其他实施方式是容易的。在本文中提及“实施方式”、“方面”或“实施例/实例”表示这样描述的本发明之实施方案可包括特定特征、结构或特性，但并非每个实施方式都必然包括所述特定特征、结构或特性。此外，重复使用短语“在一个实施方式中”尽管可以指同一实施方式，但并非必然指同一实施方式。
为了清楚起见，本文中并未示出和描述本文所述实施或方法的全部常规特征。当然将理解，在研发任何这样的实际实施时，将作出许多实施特异性的决定以实现具体目标。此外，将理解，这样的开发工作可能是复杂且耗时的，但在本公开内容的教导下，这对于本领域普通技术人员而言不过是常规工作。
本文描述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，包括以下步骤：
S1：总DNA提取：
将样品材料去除酒精后置于1-2ml(例如1ml、1.5ml、2ml等)离心管中，加入432-865μL(例如432μL、433μL、445μL、460μL、480μL、525μL、650μL、685μL、728μL、763μL、800μL、810μL、825μL、865μL等)消化缓冲液和13-26μL(13μL、14μL、16μL、17μL、19μL、20μL、24μL、25μL、26μL等)蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于55-57℃(例如55℃、56℃、57℃等)烘箱内消化4-6h(例如4h、5h、6h等)，每28min(例如28min、30min、32min等)摇晃一次；
待溶液冷却至室温后，于离心管中加入432-865μL(例如432μL、433μL、445μL、460μL、480μL、525μL、650μL、685μL、728μL、763μL、800μL、810μL、825μL、865μL等)平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在9000-11000rpm(例如9000rpm、9800rpm、10000rpm、11000rpm等)条件下离心9-11min(例如9min、10min、11min等)，用850-1100μL(例如850μL、900μL、950μL、1000μL、1050μL、1100μL等)移液枪吸出上层液体；
加入相同体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，其中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为24-26:23-25:1(例如26:25:1、25:24:1、24:23:1等)，按照上述方式再提取两次，将上层液体转移到新的1-2ml(例如1ml、1.5ml、2ml等)离心管中，加入0.5-1.5ml(例如0.5ml、1ml、1.5ml等)-18--22℃(例如-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃等)预冷酒精，轻轻振动离心管，可以观察到DNA沉淀下来，在9000-11000rpm(例如9000rpm、9800rpm、10000rpm、11000rpm等)条件下离心9-11min(例如9min、10min、11min等)后，用200-400μL(例如200μL、220μL、280μL、300μL、310μL、340μL、350μL、380μL、400μL等)72-75％(例如72％、73％、74％、75％)酒精溶液漂洗两次，在9000-11000rpm(例如9000rpm、9800rpm、10000rpm、11000rpm等)条件下离心9-11min(例如9min、10min、11min等)后弃上清液，晾干后在离心管中加入65-130μL(例如65μL、66μL、68μL、72μL、78μL、88μL、100μL、110μL、117μL、126μL、130μL等)去离子水，溶解DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，使用Qubit荧光仪测量DNA浓度。
S2：以线粒体12S rRNA基因的部分序列作为分子标记序列进行PCR扩增，分子标记引物包括正向引物和反向引物：
正向引物序列为：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
反向引物序列为：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
S3：PCR产物的回收纯化。
S4：测序及分析：将纯化后的产物进行测序，测序引物为扩增引物：
测序反应体系：测序反应体系为：0.5-1.5μL(例如0.5μL、1μL、1.5μL等)纯化后的PCR产物；4-12μL(例如4μL、8μL、12μL等)3-3.2pmol/μL(例如3pmol/μL、3.1pmol/μL、3.2pmol/μL等)的测序引物；5-15μL(例如5μL、10μL、15μL等)的Big Dye；
测序反应程序：95-96℃(例如95℃，96℃等)变性10-15s(例如10s、12s、14s、15s等)，50-54℃(例如50℃、52℃、53℃、54℃等)退火5-7s(例如5s、6s、7s等)，58-60℃(例如58℃、59℃、60℃等)延伸3-4min(例如3min,4min等)，共23-25个(例如23个、24个、25个)循环，4-6℃(例如4℃、5℃、、6℃等)保温，反应在热循环仪上进行；
测序反应产物的纯化：测序反应结束后，在反应混和物中加入3-5倍(例如3倍、4倍、5倍等)体积的72-75％(例如72％、74％、75％等)异丙醇，混匀后黑暗条件下放置18-22min(例如18min、20min、22min等)；2720-2750g(例如2720g、2730g、2740g、2750g等)离心28-32min(例如28min、30min、31min、32min等)后，将80-100孔板(例如80孔板、85孔板、88孔板、96孔板、98孔板、100孔板等)倒置在吸水纸上，然后48-52g(例如48g、49g、50g、52g等)离心40-60s(例如40s、45s、50s、58s、60s等)；再加入7-9倍(例如7倍、8倍、9倍等)体积的72-75％(例如72％、74％、75％等)异丙醇，2720-2750g(例如2720g、2730g、2740g、2750g等)离心8-12min(例如8min、9min、10min、12min等)；将80-100孔板(例如80孔板、85孔板、88孔板、96孔板、98孔板、100孔板等)倒置在吸水纸上，48-52g(例如48g、49g、50g、52g等)离心40-60s(例如40s、45s、50s、58s、60s等)，加入25-30μL(例如25μL、27μL、29μL、30μL等)ddH2O溶解，瞬时离心，于自动测序仪测序，线粒体DNA是核外DNA，由于它具有分子结构简单、母系遗传、进化速率快、缺少重组等特点，已成为群体遗传结构、地理变异、系统发育及物种特性研究等领域的有效的分子标记，作为线粒体上的一种核糖体RNA，12S rRNA在进化上较为保守，通常被用于科、属间遗传分化、系统发育和近缘物种鉴别等种及以上分类阶元的遗传学研究。采用PCR产物直接测序法比克隆测序法更为快速简便，节省成本，且特异性强，灵敏度高，重复性好。很多通用引物很容易发生错配，不能很好的与目标片段配对结合，从而得不到目标片段的扩增产物。核基因组中线粒体的DNA片段是由于线粒体基因向核基因的转移而造成的，这些线粒体来源的核DNA片段都是不能表达的假基因，很容易被通用引物从总DNA模板上优选扩增出来，有时比线粒体DNA更容易与通用引物结合，从而干扰线粒体基因组片段的扩增，与真实线粒体序列比较，受不同突变约束的线粒体假基因有着不同的遗传模式与进化模式，就DNA序列进化方面来看，线粒体假基因序列的核苷酸替代随机性更强，显示出更低的偏向性，颠换/转换与替换/沉默替代的比值一般都比较高，从而影响物种的鉴定。使用该分子标记引物，能与目标片段很好的配对结合，且不易与线粒体假基因结合，从而提高物种鉴定的准确性，且操作简单，易于掌握。
在一些实施方式中，总DNA提取的材料来源为肌肉组织。肌肉组织中线粒体含量丰富，可以降低线粒体假基因联合扩增的概率。
在一些实施方式中，PCR扩增的反应体系为：超纯水10.5-31.5μL(优选地，例如10.5μL、11.1μL、17.5μL、18.3μL、31.5μL等)，10×buffer 1.5-4.5μL(优选地，例如1.5μL、2.5μL、4.5μL等)，dNTPs 1.2-3.6μL(优选地，例如1.2μL、2μL、3.6μL等)，Taq酶0.1-0.27μL(优选地，例如0.1μL、0.15μL、0.27μL等)，DNA模板0.6-1.8μL(优选地，例如0.6μL、1μL、1.8μL等)，分子标记引物各0.6-1.8μL(优选地，例如0.6μL、1μL、1.8μL等)。本发明提供的PCR扩增的反应体系能够在保证PCR产物量的同时尽量减少非特异性扩增的出现。
在一些实施方式中，DNA模板的浓度为40-80ng/μL(优选地，例如40ng/μL、43ng/μL、46ng/μL、50ng/μL、58ng/μL、60ng/μL、62ng/μL、64ng/μL、70ng/μL、76ng/μL、80ng/μL等)。线粒体基因组在细胞中的拷贝数远远大于核基因组，稀释总基因组DNA同样可降低核基因被扩增的概率，当总基因组模板达到足够的稀释倍数，线粒体假基因将不再被扩增，但是当总基因组模板浓度在40ng/μL时，扩增出的条带很暗，为扩增12S rRNA基因片段的最低DNA模板浓度。
在一些实施方式中，PCR扩增的反应体系中添加有四氢呋喃。PCR产物的质量是测序成败的主要因素，与测序图谱的质量有着直接的关系。DNA聚合酶在PCR过程中会出现活力下降的情况，从而会增加非特异扩增和二聚体的出现，在PCR体系中加入四氢呋喃，能够提高聚合酶的稳定性，减少聚合酶的错配率，同时也可以保护DNA模板，减少嘌呤断裂和脱嘌呤的情况出现。
在一些实施方式中，PCR扩增的反应体系中添加有柠檬酸铵。Mg2+能够影响DNA聚合酶的活性和引物的退火，从而会影响PCR的产量和产物特异性，当PCR产量过低时，测序时，序列曲线的信噪比会明显减少，甚至得不到核苷酸的信号。一般来说，PCR反应体系中要求有一定浓度的游离Mg2+，浓度过低时没有PCR产物，浓度过高时则会导致非特异性产物的产生。磷酸基团和EDTA能够与镁离子络合，导致Mg2+量的降低，在PCR反应混合物中加入柠檬酸铵，能够抑制磷酸基团和EDTA与Mg2+结合，从而保证最适Mg2+浓度。
在一些实施方式中，PCR扩增程序为：94-95℃(优选地，例如94℃，95℃等)预变性4-5min(优选地，例如4min，5min等)，然后94-95℃(优选地，例如94℃，95℃等)变性44-46s(优选地，例如44s、45s、46s等)，49-52℃(优选地，例如49℃、50℃、51℃、52℃等)退火44-46s(优选地，例如44s、45s、46s等)，70-74℃(优选地，例如70℃、72℃、74℃等)延伸44-46s(优选地，例如44s、45s、46s等)，进行33-37个(优选地，例如33个、35个、36个、37个等)循环，最后70-74℃(优选地，例如70℃、72℃、74℃等)延伸8-12min，优选地，例如8min、10min、11min、12min等。本发明提供的PCR扩增程序有利于引物与模板的正确结合，很大程度上的减少引物与模板间的非特异性结合，提高了PCR的反应特异性，大大减少了给特异性扩增条带的出现。
在一些实施方式中，PCR产物的回收纯化采用玻璃奶法。PCR产物的质量是测序成败的主要因素，与测序图谱的质量有着直接的关系。由于PCR产物的纯度不够，其序列曲线会有噪峰出现，碱基不易判读，信号弱，核苷酸曲线的信噪比降低，可读序列短，因此，PCR特异产物的回收纯化是进行基于测序的基础。采用玻璃奶法回收的产物纯度和每次回收的稳定性均较高，且快速、安全、回收率高。
在一些实施方式中，测序方式为双向测序。双向测序是采用不同的引物，分别从两个方向对两条核苷酸链都进行测序，就是双向测序，该测序方法效率高、灵敏度高且准确性极高。
本申请在一些实施方式中还提供一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法的分子标记引物，包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物的序列为：
正向引物：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
反向引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。很多通用引物很容易发生错配，不能很好的与目标片段配对结合，从而得不到目标片段的扩增产物。核基因组中线粒体的DNA片段是由于线粒体基因向核基因的转移而造成的，这些线粒体来源的核DNA片段都是不能表达的假基因，很容易被通用引物从总DNA模板上优选扩增出来，有时比mtDNA更容易与通用引物结合，从而干扰线粒体基因组片段的扩增，与真实线粒体序列比较，受不同突变约束的线粒体假基因有着不同的遗传模式与进化模式，就DNA序列进化方面来看，线粒体假基因序列的核苷酸替代随机性更强，显示出更低的偏向性，颠换/转换与替换/沉默替代的比值一般都比较高，从而影响物种的鉴定。本发明提供的分子标记引物特异性强，能与目标片段很好的配对结合，且不易与线粒体假基因结合，从而提高物种鉴定的准确性，且操作简单，易于掌握。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，包括以下步骤：
用广西防城港、浙江舟山和山东青岛的褐菖鲉样品与浙江舟山的三色菖鲉样品，组成3个不同地理群体的褐菖鲉样本群和三色菖鲉样本群。
S1：总DNA提取：将4个样本群体的肌肉组织去除酒精后置于2ml离心管中，加入865μL消化缓冲液和26μL蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于56℃烘箱内消化5h，每30min摇晃一次；待溶液冷却至室温后，于离心管中加入865μL平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在10000rpm条件下离心10min，用1000μL移液枪吸出上层液体；加入相同体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，其中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为24:23:1，按照上述方式再提取两次，将上层液体转移到新的2ml离心管中，加入1.5ml-20℃预冷酒精，轻轻振动离心管，可以观察到DNA沉淀下来，在10000rpm条件下离心10min后，用400μL 75％酒精溶液漂洗两次，在10000rpm条件下离心10min后弃上清液，晾干后在离心管中加入126μL去离子水，溶解DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，使用Qubit荧光仪测量DNA浓度，将样品稀释至60ng/μL。
S2：以线粒体12S rRNA基因的部分序列作为分子标记序列进行PCR扩增：PCR扩增的分子标记引物包括正向引物和反向引物，正向引物序列为：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；反向引物序列为：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
PCR扩增的反应体系为：ddH2O 18.3μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq酶0.15μL，0.3μL体积分数为1％的四氢呋喃水溶液，DNA模板1μL，正向引物和反向引物各1μL，0.7μL体积分数为8％的柠檬酸铵水溶液；
PCR扩增程序为：95℃预变性4min，然后95℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
S3：采用玻璃奶法对PCR产物回收纯化：将PCR产物经电泳分离后，切胶得到目的片段，放入离心管中，用枪头缓慢捣碎；准确加入3倍体积的琼脂糖凝胶溶液，室温放置6min，缓缓振荡至完全融化；加入10μL玻璃奶，振荡混匀，冰浴10min，每隔3min振荡混匀一次，然后12000r/min离心30s，移去上清；加入250μL漂洗液，缓缓振荡混匀，然后12000r/min离心30s，移去上清，再重复一次；置于37℃下干燥18min，加入20μL ddH2O混匀，60℃水浴5min，12000r/min离心60s，回收上清。
S4：测序及分析：将纯化后的产物进行测序，测序引物为扩增引物：
测序反应体系：测序反应体系为：1μL纯化后的PCR产物；8μL 3.2pmol/μL的测序引物；10μL的Big Dye。
测序反应程序：96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，共24个循环，4℃保温，反应在热循环仪上进行。
测序反应产物的纯化：测序反应结束后，在反应混和物中加入4倍体积的75％的异丙醇，混匀后黑暗条件下放置20min；2720g离心30min后，将96孔板倒置在吸水纸上，然后50g离心60s；再加入8倍体积的75％的异丙醇，2720g离心10min；将96孔板倒置在吸水纸上，50g离心60s，加入29μL ddH2O溶解，瞬时离心，于自动测序仪测序，所有样品进行双向测序。测得的褐菖鲉的分子标记序列为：
CACCGCGGCTATACGAGAGGCCCAAGTTGATACCATTCGGCGTAAAGAGTGGTTATGGAAAATAAAAACTAAAGCCGCACGCCTTCAAAGCTGTTATACGCATCCGAAGGTTAGAAGATCAATCACGAAGGTAGCTTTACAACCCCTGACCCCACGAAAGCTCTGGCA；
三色菖鲉的分子标记序列为：
CACCGCGGCTATACGAGAGGCCCAAGTTGATACCATTCGGCGTAAAGAGTGGTTATGGAAAATAAAGACTAAAGCCGCACGCCTTCAAGGCTGTTATACGCATCCGAAGGTTAGAAGACCAATCACGAAAGTAGCTTTACAACCCCTGACCCCACGAAAGCTCTGGCA。
将序列进行比对，比对结果见图1。由图1可以看出，3个褐菖鲉群体和三色菖鲉的线粒体DNA 12S rRNA基因片段的测序结果表明，其长度均为168bp，序列比对结果为：3个褐菖鲉群体种内遗传差异不大于1％，其中三色菖鲉与褐菖鲉的A+T的含量比例分别为51.8％，50.5％，均高于G+C含量比，这与其他物种结果一致，三色菖鲉与褐菖鲉存在4个碱基的差异，表现为4个转换，其中T/C互换1次，G/A转换3次，浙江舟山三色菖鲉群体样品的扩增结果一致，结果稳定，可重复性强。因此基于12S rRNA基因的碱基差异可以作为褐菖鲉和三色菖鲉的种质区分的分子标记，同时，鉴别方法简单。
对比例1：
PCR扩增的反应体系中未添加有四氢呋喃，其余部分和实施例1完全一致。
对比例2：
PCR扩增的反应体系中未添加有柠檬酸铵，其余部分和实施例1完全一致。PCR扩增产物电泳图见图2、图3、图4。
由图2、图3、图4可以看出，实施例1与对比例1，对比例2相比，PCR产物电泳效果较好，质量较高，这说明：PCR扩增的反应体系中未添加有四氢呋喃时，聚合酶活性降低，聚合酶的错配率较高，DNA模板出现嘌呤断裂和脱嘌呤，从而会导致非特异扩增和二聚体的出现；PCR扩增的反应体系中未添加有柠檬酸铵时，游离Mg2+浓度较低，导致PCR的产量较低。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的分子标记引物及方法
<140> 201910494994X
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcggtaaaa ctcgtgccag c 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catagtgggg tatctaatcc cagtttg 27
<210> 3
<211> 168
<212> DNA
<213> 褐菖鲉(Sebasticus marmoratus)
<400> 3
caccgcggct atacgagagg cccaagttga taccattcgg cgtaaagagt ggttatggaa 60
aataaaaact aaagccgcac gccttcaaag ctgttatacg catccgaagg ttagaagatc 120
aatcacgaag gtagctttac aacccctgac cccacgaaag ctctggca 168
<210> 4
<211> 168
<212> DNA
<213> 三色菖鲉(Sebastiscus tertius)
<400> 4
caccgcggct atacgagagg cccaagttga taccattcgg cgtaaagagt ggttatggaa 60
aataaagact aaagccgcac gccttcaagg ctgttatacg catccgaagg ttagaagacc 120
aatcacgaaa gtagctttac aacccctgac cccacgaaag ctctggca 168

Claims (7)

1.一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：总DNA提取；
S2：以线粒体12S rRNA基因的部分序列作为分子标记序列进行PCR扩增；
S3：PCR产物的回收纯化；
S4：测序；
其中，所述PCR扩增用分子标记引物包括正向引物和反向引物：
所述正向引物序列为：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；
所述反向引物序列为：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’
其中，所述PCR扩增的反应体系中添加有四氢呋喃和柠檬酸铵；
所述鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法的判断标准为：测序可得，三色菖鲉的分子标记序列为SEQ ID NO.4所示，褐菖鲉的分子标记序列为SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于：所述总DNA提取的材料来源为肌肉组织。
3. 根据权利要求1或2所述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 10.5-31.5μL，10×buffer 1.5-4.5μL， dNTPs1.2-3.6μL，Taq酶0.1-0.27μL，DNA模板0.6-1.8μL，分子标记引物各0.6-1.8μL。
4.根据权利要求3所述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于：所述DNA模板的浓度为40-80ng/μL。
5. 根据权利要求1或2所述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：94-95℃预变性4-5min，然后94-95℃变性44-46s，49-52℃退火44-46s，70-74℃延伸 44-46s，进行33-37个循环，最后70-74℃延伸8-12min。
6.根据权利要求1或2所述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于：所述PCR产物的回收纯化采用玻璃奶法。
7.根据权利要求1所述的一种鉴别褐菖鲉和三色菖鲉的方法，其特征在于：所述测序方式为双向测序。
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