CN102876802A - 鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒。本发明首次揭示一种可特异性鉴定鲑亚科鱼类成分的引物及探针，所述引物及探针针对含有鲑亚科鱼类DNA的样品可发生特异性扩增，而对没有鲑亚科鱼类DNA的样品不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定鲑亚科鱼类，并且具有良好的再现性、灵敏度。

Description

鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒。

背景技术

鲑科(Salmonidae)鱼类属典型冷水鱼类，隶属于硬骨鱼纲，鲑形目，是世界三大养殖鱼类之一。鲑科鱼含有丰富的蛋白质、脂肪和维生素，胆固醇含量很低，而且含有ω3脂肪酸(EPA、DHA和DPA)，肉质鲜美，营养价值极高，深受消费者青睐。一般将鲑科分为三个亚科，包括鲑亚科(Salmoniae)，白鲑亚科(Coregoninae)和茴鱼亚科(Thymallidae)。其中鲑亚科鱼类有5属，即大马哈鱼属(Oncorhynchus)、红点鲑属(Salvelinus)、哲罗鲑属(Hucho taimen)、细鳞鲑属(Brachymystax)和鲑属(Salmo)，囊括了鲑科中多数的食用性鱼类，因此需求最大，经济价值最高，市场上常见的以“三文鱼”为商品名的鲑鳟鱼类，如大西洋鲑、虹鳟、大麻哈鱼，以及哲罗鲑、红点鲑、细鳞大麻哈鱼等均属于鲑亚科鱼类。至2009年世界三文鱼产量达到366.4万吨，我国三文鱼进口量达到了22万吨，消费需求日益增长。但是目前国内外市场上“三文鱼”商品名称混乱，尤其是很多国家食品监管部门在市场上发现近缘鱼种假冒替代现象时有发生，仅美国在2002年就有34%水产品乱贴标签或假冒其它种类产品。为保证保费者权益，规范三文鱼销售市场，使产品“名副其实”，建立一种鲑亚科鱼类的鉴定方法尤为重要。

由于经济利益驱动，一些不法商在食品的加工过程中，常常以价格低廉的原料替代或掺入高价格的原料，或者根本就不添加标注的原料成分。在加工产品的造假掺假过程中，经常会使用有毒有害物质(如染色馒头等)，危害人民身体健康。本发明旨在开发出方便快捷地检测食品、饲料及鱼类加工制品中鲑亚科鱼成分的方法，确保食品质量安全。

发明内容

本发明的目的在于提供鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定鲑亚科鱼类的方法，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲑亚科鱼类。

在一个优选例中，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQID NO:3所示的荧光探针(如Taqman探针)进行实时荧光PCR检测。

在另一优选例中，所述的待测样品是食品或饲料。

在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为0.01%。

在本发明的第一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在本发明的第一方面，提供一种荧光探针，所述的探针序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的第一方面，提供所述的引物或所述的荧光探针的用途，用于从待测样品中鉴定鲑亚科鱼类。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定鲑亚科鱼类的试剂盒，其中包括所述的引物；和/或所述的荧光探针。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：含有鲑亚科鱼类的DNA的检测标准品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鲑亚科鱼类的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、应用实时荧光PCR检测方法来进行特异性实验的荧光PCR检测图谱。

图2、鲑亚科鱼的PCR扩增结果以及标准曲线。其中，A为虹鳟(Oncorhynchus mykiss)，B为白点鲑(Salvelinus leucomaenis)，C为尖吻细鳞鲑(Brachymystax lenok)，D为大西洋鲑(Salmo salar)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定鲑亚科鱼类的引物，所述引物对含有鲑亚科鱼类DNA的样品可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有鲑亚科鱼类DNA的样品不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的荧光探针。采用所述的引物配合荧光探针，可良好地应用于鉴定鲑亚科鱼类，并且具有良好的再现性、灵敏度。

目前开发有效的鉴定各种鱼类成分的方法的难点在于这些成分通常在外观、品质上非常相近，导致人们难分真伪。即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于许多鱼类在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的检测靶标。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，基于此开发了实时荧光PCR检测鲑亚科鱼类的方法。

本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定鲑亚科鱼类的引物，其对于鲑亚科鱼类的DNA发生特异性扩增，而对没有鲑亚科鱼类的DNA不发生特异性扩增。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明还提供一种探针，所述的探针具SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。

利用本发明的引物及探针，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有鲑亚科鱼类，而且所需的样品量很少。

基于本发明所提供的适用于鉴定鲑亚科鱼类的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定鲑亚科鱼类的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲑亚科鱼类。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用实时荧光PCR方法来进行鲑亚科鱼类的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和荧光探针。荧光探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有荧光修饰基团。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及一种用于鉴定鲑亚科鱼类的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ IDNO:3所示的探针。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定鲑亚科鱼类的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定鲑亚科鱼类的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测鲑亚科鱼类的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示一种可特异性鉴定鲑亚科鱼类的引物，所述的引物特异性良好，对于鲑亚科鱼类能够实现特异性扩增，而对于鲑亚科鱼类以外的其它通常用作仿制鲑亚科鱼类的物质则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测鲑亚科鱼类，从待测样品中快速准确地区分真假鲑亚科鱼类，并且所需样品量少，操作简单。

(3)较佳地，本发明应用荧光实时荧光PCR技术，可快速实现食品中鲑亚科鱼类源性成分的准确鉴定。

(4)本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料与方法

鱼类或样品材料的获得

鲑科鱼类包括鲑亚科，白鲑亚科和茴鱼亚科的共七个属鱼类。鱼样收集购买自中国鲑鱼产区及世界范围内的三文鱼产区，如表1。

表1、鲑科鱼样的收集

同时收集购买鲑科鱼类的近缘科、目的鱼类，包括黄菇鱼(Nibea albiflora)、白菇鱼(Argyrosomus argentatus)、大眼菇鱼(Atrobucca alcocki)、左口鱼(Pseudorhombus swinhonis)、格陵兰庸鲽鱼(Hippoglossus)、巴沙鱼(Pangasiusbocourti)、金线鱼(Nemipterus virgatus)、金枪鱼(Thunnus Maccoyii)、黄鳍棘鲷鱼(Sparuslatus Houttuyn)、虎头鱼(Sebastiscus marmoratus)、狗头鱼(arthronhispicus)、白斑狗鱼(Esox lucius)、鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)、旗鱼(Histiophorus orientalis)、银鱼(Hemisalanx prognathus Regan)、鲥鱼(Tenualosareevesii)、鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)、鲫鱼(Carassius auratus)、接吻鱼(Helostoma temminckii)、鳕鱼(Gadus)、罗非鱼(Tilapia)和马鲛鱼(Scomberomorusniphonius)，常见动植物材料包括鸡、鸭、鹅、猪、黄牛、绵羊、玉米、小麦等，用于鲑亚科鉴定的特异性检测。

测试实际样品购买收集自上海超市，商品是鲑亚科鱼或标注含有鲑亚科鱼(表2)，这些样品用于建立方法的鉴定。

表2、测试实际样品列表

编号	商品名称	编号	商品名称
				1	秋鲑	14	蔬菜米粉
2	三文鱼1	15	营养面条2
				3	鱼子酱	16	营养面条3
4	烟熏三文鱼	17	色拉
				5	狗鲑鱼扒	18	鱼肉酥
6	三文鱼2	19	颗粒面
				7	香草三文鱼1	20	蜜汁三文鱼
8	大马哈鱼1	21	蔬菜泥2
				9	大马哈鱼2	22	三文鱼籽
10	香肠	23	奶酪
				11	营养米粉	24	火腿肠
12	蔬菜泥1	25	香草三文鱼2
				13	营养面条1

样品准备

对于整鱼样本，用无菌手术刀切取内部肉一块，完全冷冻后采用冷冻研磨机(美国Spex SamplePrep公司，6850型)研磨成均匀的粉末。解冻后用于DNA提取。

为了测定建立的检测方法的相对灵敏度，选取三种食品基质如玉米、鸡肉和鲫鱼以及代表性的鲑亚科鱼如大西洋鲑鱼和红点鲑制备混合样品。首先将鸡肉、鲫鱼及鱼样分别烘干，使用冷冻研磨机分别将其研磨成均匀的干粉。然后配制重量梯度的混合样品。称取13.50g玉米粉和1.50g大西洋鲑鱼干粉，混合后使用冷冻研磨机将其充分混匀用于制备10%(w/w)混合样品(编号为Aa1)。然后称取13.50g玉米粉和1.50g Aa1混合样品，混合后用冷冻研磨机将其充分混匀用于制备1%(w/w)混合样品(Aa2)。采用同样的方法制备0.1%、0.01%、0.001%的混合样品(Aa3、Aa4、Aa5)。鸡肉、鲫鱼与大西洋鲑鱼的混合样品(编号分别为Ab1-Ab5、Ac1-Ac5)以及玉米、鸡肉和鲫鱼与红点鲑鱼的重量梯度混合样品(编号分别为Ba1-Ba5、Bb1-Bb5、Bc1-Bc5)采用同样方法配制。

DNA提取

称取研磨后的100mg鱼肉、混合样品或实际样品，使用Blood&tissue Kit(Cat.No.69504，QIAGEN，Germany)并按其操作步骤提取DNA，每次DNA提取均设置提取空白对照。用微量分光光度计(GE公司NanoPlus，美国)测定DNA浓度和质量后，置-20℃保存备用。

引物和探针的设计

本发明人选取了大量的鲑科鱼的基因，并进行分析，来确定哪种基因具有鲑亚科特异性，适合于进行鲑亚科的鉴定。经过大量分析，最终确定采用生长激素(growth hormone，GH)基因(GenBank序列号L04688.1、EU090916.1、J03797.1)作为靶基因，用于鲑亚科鉴定。在此基础上进行引物和探针的设计。

设计的特异性引物如下：

FPN 5’-CCATCACTCTCTAATCGGCG-3’(SEQ ID NO:1)，

RPN 5’-GGAGCAGCTTCAGGACCTG-3’(SEQ ID NO:2)，

设计的特异性探针如下：

PN 5’-FAM-TCATGTAAATGATATGGCATCTCAAGCTG-BHQ 1-3’(SEQID NO:3)。

为了验证DNA的有效提取，针对18SrRNA的引物如下：

18S rRNA15’-TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3’(SEQ ID NO:4)

18S rRNA25’-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3’(SEQ ID NO:5)

为了验证DNA的有效提取和是否含有鱼类成分，针对12SrRNA的引物如下：

12S-FISH-1F 5’-TAA GAG GGC CGG TAA AAC TC-3’(SEQ ID NO:6)

12S-Fish-2R 5’-GTG GGG TAT CTA ATC CCA G-3’(SEQ ID NO:7)

引物和探针均由宝生物(大连)有限公司合成。

实时荧光PCR反应条件

实时荧光PCR反应体系为25μL，包含2×TaqMan Master Mix 12.5μL，上下游引物各400nM，探针200nM，5μL模板DNA，用去离子水补足至25μL。实时荧光PCR反应参数：95℃，10min；45个循环，95℃，10s；60℃，30s。荧光信号在60℃时收集。

18S rRNA、12S rRNA基因PCR扩增与检测

使用18S rRNA、12S rRNA基因扩增生物内源基因，以确保所提取的DNA适合于PCR扩增。检测所用18S rRNA基因引物序列为：

PCR反应体系：1×PCR缓冲液，2.5mmol/L Mg²⁺，1U Taq酶，200μmol/LdNTPs，引物400nM，模板100ng，反应体积为25μl。

18S rRNA扩增条件为：94℃，5min；94℃，20s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环；72℃，5min。

12S rRNA扩增条件为：94℃，4min；94℃，20s，55℃，40s，72℃，40s，36个循环；72℃，5min。

取10μL PCR产物，加1μL 10×上样缓冲液点样进行电泳。PCR产物电泳检测所用的凝胶浓度为1.5-2.0%。

II.实施例

实施例1、实时荧光PCR特异性测试

鲑科及非鲑科样品的DNA溶液，均以真核生物18S rRNA特异引物进行PCR扩增，此外，再以鱼类特异性引物12S rRNA进行PCR扩增，确保DNA的有效提取。结果表明，所有提取的DNA样品18S rRNA均产生目标条带，对于12S rRNA扩增，只有鱼类样品出现特异性扩增条带，非鱼类样品均无目标条带。因此，所有提取的DNA样品适合实时荧光PCR测试。

为了鉴定建立的实时荧光PCR检测体系特异性，以鲑亚科、白鲑亚科和茴鱼亚科鱼、近缘科目鱼类样品和常见动植物样品DNA为模板，采用建立的实时荧光PCR检测方法进行扩增。

特异性实验结果如图1。图1上图中，曲线1表示大西洋鲑鱼的扩增结果，曲线2(界定阴性结果的分界线，上方曲线为扩增信号阳性，下方曲线为扩增信号阴性)下方的曲线为非鲑亚科鱼，包括乌苏里白鲑、高白鲑、齐尔白鲑、目笋白鲑、图贡白鲑、海浪河茴鱼、黑龙江茴鱼、鸭绿江茴鱼、下游黑龙江茴鱼、北极茴鱼、黄菇鱼、白菇鱼、大眼菇鱼、左口鱼、格陵兰庸鲽鱼、巴沙鱼、金线鱼、金枪鱼、黄鳍棘鲷鱼、虎头鱼、狗头鱼、白斑狗鱼、鲐鱼、旗鱼、银鱼、鲥鱼、鲢鱼、鲫鱼、接吻鱼、鳕鱼、罗非鱼和马鲛鱼及鸡、鸭、鹅、猪、黄牛、绵羊、玉米、小麦和空白对照的扩增结果。

图1下图中，曲线2(界定阴性结果的分界线，上方曲线为扩增信号阳性，下方曲线为扩增信号阴性)下方的曲线为空白对照的扩增结果，曲线2上方的曲线为鲑亚科鱼的PCR扩增曲线，共20条，包括来源于北京、青海和美国的虹鳟、来源于日本的山女鳟、来源于黑龙江、日本、俄罗斯的大麻哈鱼、来源于日本的北极红点鲑、来自日本的白点鲑、黑龙江产太门哲罗鲑、黑龙江产尖吻细鳞鲑、来源于青海、挪威、加拿大、澳大利亚、英国和法罗群岛的大西洋鲑鱼、澳大利亚、挪威和智利的褐鳟的PCR扩增结果。

上述结果表明，所有鲑亚科鱼类样品均产生显著的荧光增幅，Ct值介于20-26之间(图1上图)；而以白鲑亚科、茴鱼亚科和近缘科目的其他鱼类以及常见动植物样品DNA为模板均无荧光扩增信号(图1下图)。

因此，本发明建立的实时荧光PCR检测方法特异于鲑亚科鱼类检测。

实施例2、实时荧光PCR灵敏度测试

对建立的实时荧光PCR检测体系灵敏度进行测试，包括绝对灵敏度和相对灵敏度测试。

(1)绝对灵敏度测试

选取代表性的鲑亚科样品DNA虹鳟、北极红点鲑、太门哲罗鲑、尖吻细鳞鲑和大西洋鲑，分别将其DNA溶液稀释至100、10、1、0.1、0.02、0.01、0.001ng/μL，采用建立的实时荧光PCR方法进行测试，每个浓度设置5个平行，重复4次，即每个浓度得到20个对应的Ct值，检测下限(LOD)的确定需满足≥95%置信区间。测试结果如表3所示。

表3、绝对灵敏度实验结果

*阳性扩增数/扩增总数

结果表明，虹鳟和大西洋鲑实时荧光PCR最低检测浓度为0.01ng/μL，即检测下限为50pg(模板为5μL)，北极红点鲑、太门哲罗鲑和尖吻细鳞鲑最低检测浓度为0.02ng/μL，即检测下限为100pg，均可以满足日常检测要求。

(2)相对灵敏度测试

采用准备好的混合样品DNA，以不同重量梯度的鲑亚科鱼混基质样品DNA为模板，采用建立的实时荧光PCR方法进行测试，每个梯度设置5个平行，重复4次，即每个梯度得到对应的20个Ct值，统计阳性Ct的数量；同样LOD的确定需要满足≥95%的置信区间。测试结果如表4所示。

表4、相对灵敏度实验结果

*阳性扩增数/扩增总数

结果表明，玉米粉掺大西洋鲑鱼灵敏度达到0.001%，其余的均为0.01%，可以满足食品中鲑亚科鱼类成分的日常检测。

实施例3、鲑亚科鱼标准曲线的绘制

选取代表性的鲑亚科鱼样虹鳟、白点鲑、尖吻细鳞鲑和大西洋鲑，分别将其DNA溶液稀释至100ng/μL，然后使用0.1×TE溶液梯度稀释。对4个鲑亚科样品构建标准曲线，以DNA溶液浓度的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，每个反应均重复3次。直线方程及扩增效率如表5所示，标准曲线如图2。图2(A)为以虹鳟鱼DNA为模板的扩增，从左到右分别为100、10、1、0.1、0.01ng/μL浓度DNA的扩增曲线；图2（B）为以白点鲑DNA为模板的扩增，从左到右分别为100、10、1、0.1、0.02ng/μL浓度DNA的扩增曲线；图2（C）为以尖吻细鳞鲑DNA为模板的扩增，从左到右分别为100、10、1、0.1、0.02ng/μL浓度DNA的扩增曲线；图2（D）为以大西洋鲑DNA为模板的扩增，从左到右分别为100、10、1、0.1、0.02ng/μL浓度DNA的扩增曲线。

结果表明，四个代表性的鲑亚科样品反应效率都很高，其中大西洋鲑反应效率达到98.2%，尖吻细鳞鲑相对较低，为89.3%，均可满足定量要求。重复性测试结果表明，每个浓度DNA扩增所得Ct值的标准偏差（SD）值介于0.06至0.22之间，相对标准偏差RSD(%)值介于0.02至1.53之间，均在可接受范围内。表明建立的实时荧光PCR方法重复性与稳定性好。

表5、标准曲线方程及扩增效率

样品	直线方程	R2	反应效率E
				虹鳟	y=-3.441x+31.92	0.9978	95.3%
白点鲑	y=-3.5129x+34.095	0.9921	92.6%
				尖吻细鳞鲑	y=-3.6069x+33.157	0.9834	89.3%
大西洋鲑	y=-3.3653x+32.391	0.9947	98.2%

实施例4、鲑亚科实时荧光PCR鉴定方法的应用

为了证实建立的实时荧光PCR检测方法在测试样品中对鲑亚科鱼类检测的应用，采用实时荧光PCR鉴定方法，对收集购买的25份测试样品进行测试。

检测结果如表6所示，所有样品在采用18S rRNA引物时均可扩增出目的条带，表明所有样品均成功提取出适于扩增的DNA；采用12S rRNA引物(用于鱼源性成分鉴定)可在除12号和14号样品为模板的扩增中出现目的条带(数据未在此呈现)，表明除12和14号样品外其余23个样品均含有鱼类成分。

表6、测试样品检测结果

编号	商品名称	检测结果	编号	商品名称	检测结果
						1	秋鲑	+	14	蔬菜米粉
2	三文鱼1	+	15	营养面条2	+
						3	鱼子酱	+	16	营养面条3
4	烟熏三文鱼	+	17	色拉	+
						5	狗鲑鱼扒	+	18	鱼肉酥
6	三文鱼块	+	19	颗粒面	+
						7	香草三文鱼1	+	20	蜜汁三文鱼	+
8	大马哈鱼1	+	21	蔬菜泥2	+
						9	大马哈鱼2	+	22	三文鱼籽	+
10	香肠	+	23	奶酪	+
						11	营养米粉	+	24	火腿肠	+
12	蔬菜泥1-		25	香草三文鱼2	+
						13	营养面条1	+

注：“+”表明有荧光扩增信号，“-”表明无荧光扩增信号。

采用建立的鲑亚科鱼类实时荧光PCR方法进行扩增时，在12、14、16、18号样品中没有显著的荧光增幅，即无扩增曲线，表明上述4个样品未检出鲑亚科鱼类成分。而根据12S rRNA的扩增结果，16、18号样品有目标条带产生，提示存在用其他鱼代替鲑亚科鱼的假冒替代现象。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种鉴定鲑亚科鱼类的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲑亚科鱼类。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品或饲料。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为0.01%。

5.一种引物，其特征在于，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

6.一种荧光探针，其特征在于，所述的探针序列如SEQ ID NO:3所示。

7.权利要求5所述的引物或权利要求6所述的荧光探针的用途，用于从待测样品中鉴定鲑亚科鱼类。

8.一种鉴定鲑亚科鱼类的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求5所述的引物；和/或权利要求6所述的荧光探针。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：含有鲑亚科鱼类的DNA的检测标准品。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鲑亚科鱼类的方法的使用说明书。

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