CN106434984A - 一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的pcr引物及方法 - Google Patents

一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的pcr引物及方法 Download PDF

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王永久
潘霞
段蕊
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Abstract

本发明提供一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，所述PCR引物分别为COD ID NO：1&COD ID NO：2或TIL ID NO：1&TIL ID NO：2或RAF ID NO：1&RAF ID NO：2；所述检测方法是将提取的水产胶原蛋白的DNA模板进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳检测鉴定；本发明根据三种鱼类线粒体保守基因12SrRNA设计了大量引物，从中选取出了可对不同种类水产胶原蛋白进行有效检测的引物，通过PCR扩增及凝胶电泳检测，进行水产胶原蛋白的鉴定，其检测方法具有高特异性，高灵敏度以及实用性的特点，能够有效的对水产胶原蛋白物种来源进行检测。

Description

一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，尤其是一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法。
背景技术
胶原蛋白原本指的是生物体内细胞外基质(ECM)的一类结构蛋白质，是一类外观呈白色、不透明、没有支链的纤维型蛋白质，它在生物体内作为一种重要的功能性蛋白质，在细胞再生、保证皮肤、骨骼发挥正常功能中有着重要作用，同时也与细胞分化、细胞衰老、关节润滑及疾病产生息息相关。目前，市售胶原蛋白主要来源于陆源性畜禽(猪、牛等)皮骨、淡水鱼鱼皮、鱼鳞以及深海鱼皮等，而水产胶原蛋白因其优良的理化特性和生理活性功能，渐渐成为市售胶原蛋白主要来源，也逐渐被人们所认可。
随着胶原蛋白在市场上的流通，胶原蛋白的品质及其来源也成为人们关注的热点：最初对于胶原蛋白产品的鉴定，大都通过外观、气味进行观察识别，但此方法准确性较差，检测的结果并不可靠，不值得提倡。进一步的，胶原蛋白产品的鉴别采用理化鉴定方法，如钙盐沉淀法以及盐酸部分水解法等，这类鉴别方法同样存在弊端：准确性差、重复性低，可操作不强等，未能得到很好的使用。
PCR技术自发明以来被广泛证明具有高特异性，高灵敏度的特点，在鉴定物种来源中发挥着重要作用。本发明所参考序列线粒体基因组具有种内高度保守性，特别是线粒体12SrRNA基因具有抗腐蚀以及耐高温的特点，广泛被应用于牛肉、猪肉及其制品、其他肉类加工制品以及饲料的检测。本发明利用水产品的线粒体——12SrRNA基因进行测定与鉴别，以期为水产胶原蛋白的检测提供有效的分子标记系统，实现胶原蛋白类制品行业的规范化、标准化以及国际化。
发明内容
为了实现对市售水产胶原蛋白产品的鉴别，同时也为鱼皮鱼鳞胶原产品质量控制、胶原蛋白类药物的质量控制以及含胶原生物材料、医疗器械、生化材料质量控制提供理论依据与技术借鉴，实现胶原蛋白类制品行业的规范化、标准化以及国际化，本发明提出了一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其技术方案如下：
一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其特征在于：所述PCR引物分别为COD ID NO：1&COD ID NO：2或TIL ID NO：1&TIL ID NO：2或RAF ID NO：1&RAF IDNO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分别为：
COD ID NO：1ACCTCCGATTCCACGAAAG
COD ID NO：2ACGCTACACCTCGACCTGAC
TIL ID NO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTG
TIL ID NO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTT
RAF ID NO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCC
RAF ID NO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC
所述检测方法包括以下步骤：
(1)对胶原蛋白样本进行预处理，直至胶原蛋白粉末被完全消化；
(2)提取胶原蛋白样本中的DNA作为核苷酸检测的模板；
(3)将样本中所提取的DNA模板进行PCR扩增；
(4)将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并确定产物的目标条带。
进一步的，所述步骤(3)中PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min；所述PCR反应体系包括样本DNA 1ul，2×Tap PCR Master Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物各1ul。
进一步的，所述步骤(3)设置阴性对照，所述阴性对照组为去离子水。
进一步的，所述样本DNA由DNA提取试剂盒提取获得。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明根据三种鱼类线粒体保守基因12srRNA设计了大量引物，从中选取出了可对不同种类水产胶原蛋白进行有效检测的引物，与样本DNA进行PCR扩增生成特异性的基因片段，之后通过琼脂糖凝胶电泳过程得出样品鉴定的结果，其检测方法具有高特异性，高灵敏度以及实用性的特点，能够有效的对水产胶原蛋白物种来源进行检测。样品DNA由深加工食品DNA提取试剂盒DNeasymericon Food Kit(德国Qiagen公司)提取获得，操作过程严格依据试剂盒说明书进行，保证获取足够的DNA量进行聚合酶链式反应。本发明检测方法具有高特异性、高灵敏度的特点，现已在鉴定物种来源中发挥着重要作用，检测的结果精确可靠。同时，本发明的引物序列经过本领域相关软件DNAman、Primer Premier 6.0、Oligo 7设计获得，三对引物分别对各自物种的12SrDNA片段进行扩增，不会扩增该物种的其它区域以及其它物种的DNA序列，其引物干粉可通过化学合成方法获得。
附图说明
图1为PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
其中，图a为罗非鱼胶原蛋白检测结果，图b为鳕鱼胶原蛋白检测图谱，图c为斑点叉尾鮰胶原蛋白检测图谱。
样品顺序为：M-分子量Marker；1-猪胶原蛋白；2-鳕鱼胶原蛋白；3-罗非鱼胶原蛋白；4-牛胶原蛋白；5-斑点叉尾鮰胶原蛋白；6-水。
具体实施方式
下面结合附图1对本发明做详细说明，如图1所示，一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其特征在于：所述PCR引物分别为COD ID NO：1&COD ID NO：2或TIL ID NO：1&TIL ID NO：2或RAF ID NO：1&RAF ID NO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分别为：
COD ID NO：1ACCTCCGATTCCACGAAAG
COD ID NO：2ACGCTACACCTCGACCTGAC
TIL ID NO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTG
TIL ID NO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTT
RAF ID NO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCC
RAF ID NO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC
所述检测方法包括以下步骤：
(1)对胶原蛋白样本进行预处理，直至胶原蛋白粉末被完全消化；
(2)提取胶原蛋白样本中的DNA作为核苷酸检测的模板；
(3)将样本中所提取的DNA模板进行PCR扩增；
(4)将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并确定产物的目标条带。
其中，样品DNA样品由深加工食品DNA提取试剂盒DNeasymericon Food Kit(德国Qiagen公司)提取获得，操作过程严格依据试剂盒说明书进行，保证获取足够的DNA量进行聚合酶链式反应，在此基础上再对其进行PCR扩增及电泳检测。
所述步骤(3)中PCR反应程序为：在94℃条件下进行预变性5min，接着94℃条件下变性30s，然后55℃条件下退火30s，再72℃条件下延伸1min，一共进行30个循环，最后在72℃条件下延伸10min；所述PCR反应体系包括样本DNA 1ul，2×Tap PCR Master Mix12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物各1ul。
作为优选方案，所述步骤(3)设置阴性对照，所述阴性对照组为去离子水。
作为优先方案，所述样本DNA由DNA提取试剂盒提取获得。
实施例1：罗非鱼胶原蛋白检测
(1)DNA提取：取罗非鱼胶原蛋白样品2g，使用DNeasymericon Food Kit试剂盒或者同类型食品深加工DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取过程中的操作要严格依据试剂盒说明书进行，保证获取足够的DNA量进行聚合酶链式反应，在此基础上再对其进行PCR扩增及电泳检测。
(2)PCR扩增：建立25ul PCR反应体系：取1ul提取的DNA模板，2×Tap PCR MasterMix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物均为1ul。PCR反应进程为94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。
(3)凝胶电泳：制备2％的琼脂糖凝胶，混合DNA样品、上样缓冲液和胶体染色剂SYBR Green I并将其加入至胶体点样孔中。接通电源进行电泳，80V恒压电泳40min后凝胶成像系统下拍照，如图1a所示。
实施例2：鳕鱼胶原蛋白检测
(1)DNA提取：取鳕鱼胶原蛋白样品2g，使用DNeasymericon Food Kit试剂盒或者
同类型食品深加工DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取过程中的操作要严格依据试剂盒说明书进行，保证获取足够的DNA量进行聚合酶链式反应，在此基础上再对其进行PCR扩增及电泳检测。
(2)PCR扩增：建立25ul PCR反应体系：取1ul提取的DNA，2×Tap PCR Master Mix12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物均为1ul。PCR反应进程为预变性94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。
(3)凝胶电泳：制备2％的琼脂糖凝胶，混合DNA样品、上样缓冲液和胶体染色剂SYBR Green I并将其加入至胶体点样孔中。接通电源进行电泳，80V恒压电泳40min后凝胶成像系统下拍照，如图1b所示。
实施例3：斑点叉尾鮰胶原蛋白的检测
(1)DNA提取：取斑点叉尾鮰胶原蛋白样品2g，使用DNeasymericon Food Kit试剂盒或者同类型食品深加工DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取过程中的操作要严格依据试剂盒说明书进行，保证获取足够的DNA量进行聚合酶链式反应，在此基础上再对其进行PCR扩增及电泳检测。
(2)PCR扩增：建立25ul PCR反应体系：取1ul提取的DNA，2×Tap PCR Master Mix12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物和模板均为1ul。PCR反应进程为预变性94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。
(3)凝胶电泳：制备2％的琼脂糖凝胶，混合DNA样品、上样缓冲液和胶体染色剂SYBR Green I并将其加入至胶体点样孔中。接通电源进行电泳，80V恒压电泳40min后凝胶成像系统下拍照，如图1c所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其特征在于：利用引物与水产胶原蛋白中提取的DNA进行扩增，生成特异性片段；所述PCR引物分别为COD ID NO：1&CODID NO：2或TIL ID NO：1&TIL ID NO：2或RAF ID NO：1&RAF ID NO：2；
其中，所述引物上下游核苷酸序列分别为：
COD ID NO：1ACCTCCGATTCCACGAAAG
COD ID NO：2ACGCTACACCTCGACCTGAC
TIL ID NO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTG
TIL ID NO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTT
RAF ID NO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCC
RAF ID NO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC
所述检测方法包括以下步骤：
(1)对胶原蛋白样本进行预处理，直至胶原蛋白粉末被完全消化；
(2)提取胶原蛋白样本中的DNA作为核苷酸检测的模板；
(3)将样本中所提取的DNA模板进行PCR扩增；
(4)将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并确定产物的目标条带。
2.根据权利要求1所述的一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min；所述PCR反应体系包括样本DNA 1ul，2×TapPCRMaster Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物各1ul。
3.根据权利要求1所述的一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其特征在于：所述步骤(3)设置阴性对照，所述阴性对照组为去离子水。
4.根据权利要求1所述的一种检测大分子水产胶原蛋白或明胶的PCR引物及方法，其特征在于：所述样本DNA由DNA提取试剂盒提取获得。
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