CN104988233B - 一种利用线粒体dna鉴别牛羊肉中狗肉的lamp检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明的检测方法以待测肉品的DNA作为模板、以DF3、DB3、DFIP、DBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在狗肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在狗肉。本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。

Description

一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
近年来随着市场对牛羊肉的需求逐渐增加及价格快速上涨，一些不法商贩在利益的驱动下，掺加其他廉价肉造假冒充牛羊肉。2012年以来，国内曝光了多起以猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛羊肉的事件；更有甚者，在牛羊肉中还掺入病死的狗肉。这种现象不仅扰乱了经济秩序，而且严重危害人们身体健康。
目前，用于动物源性成分检测的方法主要有常规PCR、荧光定量PCR等，但上述诊断方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在实际生产中普及应用。
发明内容
为了解决采用常规PCR、荧光定量PCR法检测牛羊肉中掺入狗肉时所存在的上述技术问题，本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COXⅠ）基因对狗肉进行鉴定，整个反应在恒温水浴锅中进行40min即可，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果。
本发明的技术方案是：
一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法，以待测肉品的DNA作为模板、以DF3、DB3、DFIP、DBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入1uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在狗肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在狗肉；
所用引物如下：
DF3: TTATTTACAGTAGGCGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，
DB3: GTAAAGTGAATCTTTGCTCAAG，如SEQ ID NO.2所示，
DFIP:ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC，如SEQ ID NO.3所示，
DBIP:CTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCTATCGTTAAGAGTATAACCTGAGA，如SEQ ID NO.4所示，
所述LAMP检测体系，总体积为25uL；其组成如下
10umol/L的DF3、DB3各0.5uL，10umol/L 的DFIP、DBIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP4uL，50mmol/L的 MgSO4 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermobuffer 2.5uL，模板2uL，余量为超纯水。
本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。 本发明无需借助于大型的昂贵仪器设备，更适合于基层的现地检测，具有广阔的市场前景和较大的社会经济效益。
本发明选用线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COXⅠ）基因作为目的基因；以DF3、DB3、DFIP、DBIP为引物，能将特异性地扩增狗肉COXⅠ基因，从而将狗肉从羊肉、牛肉中检测出来；且能够将其与猫、狐狸等相近种属的肉区分开来；具备特异性高的优点。另外，采用DF3、DB3、DFIP、DBIP为引物，其灵敏度高，所能检测到的最低浓度为2×10-4ng/uL；因此，即使掺杂有微量狗肉也能被检测出来。
本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂，含有如下引物：
DF3: TTATTTACAGTAGGCGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，
DB3: GTAAAGTGAATCTTTGCTCAAG，如SEQ ID NO.2所示，
DFIP:ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC，如SEQ ID NO.3所示，
DBIP:CTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCTATCGTTAAGAGTATAACCTGAGA，如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂盒，含有10umol/L的DF3、DB3各0.5uL，10umol/L 的DFIP、DBIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP 4uL，50mmol/L的 MgSO4 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermo buffer 2.5uL；
其中：
DF3: TTATTTACAGTAGGCGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，
DB3: GTAAAGTGAATCTTTGCTCAAG，如SEQ ID NO.2所示，
DFIP:ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC，如SEQ ID NO.3所示，
DBIP:CTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCTATCGTTAAGAGTATAACCTGAGA，如SEQ ID NO.4所示。
附图说明
图1为实施例1检测结果图；从左向右顺序为：阳性对照，阴性对照，牛肉，羊肉，狗肉，猫肉，貂肉，狐狸肉；结果显示：第1、5管为绿色，其余为橘黄色；
图2为PCR检测方法灵敏度示意图；从右向左顺序为：Marker，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度；
图3为LAMP检测方法灵敏度示意图；从右向左顺序为：Marker，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度。
具体实施方式
下述实施例中：所用试剂除由生产厂家直接提供的以外，其它均为分析纯；水，如果没有特别说明，为超纯水。
实施例1 设计引物
从GenBank中检索获得狗的COXⅠ序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性；根据上述序列利用PrimerExplore软件设计引物如下：
DF3: TTATTTACAGTAGGCGGGTT（如SEQ ID NO.1所示），
DB3: GTAAAGTGAATCTTTGCTCAAG（如SEQ ID NO.2所示），
DFIP:ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC（如SEQ ID NO.3所示），
DBIP:CTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCTATCGTTAAGAGTATAACCTGAGA（如SEQ ID NO.4所示）。
实施例2
（1）提取样品DNA作为模板
严格无菌采集牛、羊、狗、猫、狐狸、貂的新鲜肌肉组织作为样品，然后采用酚氯仿提取法分别提取样品中的DNA。分别以本实验室保存的含有狗肉COXⅠ基因的阳性质粒（阳性对照），超纯水（阴性对照），牛肉DNA，羊肉DNA，狗肉DNA，猫肉DNA，狐狸肉DNA，貂肉DNA为模板建立LAMP反应体系；DNA模板浓度均为20ng/uL。
（2）LAMP反应体系的建立
通过摸索内外引物浓度比、dNTP浓度、反应温度、反应时间等建立的LAMP反应体系：25μL，其组成为：10umol/L的DF3、DB3各0.5uL，10umol/L 的DFIP、DBIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP 4uL，50mmol/L的 MgSO4 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermo buffer 2.5uL，最低浓度为20ng/uL的模板2uL，余量为超纯水。
其中，dNTP和MgSO4购自宝生物工程（大连）有限公司、Betaine购自美国Sigma公司、Bst DNA聚合酶（8U/ uL）和10×Thermo buffer购自美国NEB公司、SYBR GREEN I核酸染料购自北京Solarbio公司
(3)LAMP扩增反应
将上述LAMP反应体系（按照实施例1获取模板的顺序排列）同时置于64℃恒温水浴中进行LAMP扩增40min；反应结束后加入1uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；反应液颜色依次为绿色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、绿色、橘黄色、橘黄色、橘黄色（如图1所示）。其中，橘黄色为阴性结果，绿色为阳性结果。
实施例3
从山东省内屠宰厂采集鲜牛肉样品30个，鲜羊肉样品30个；从山东省动物医院采集鲜狗肉样品10个；采用实例1的方法提取样品的DNA作为模板、建立LAMP反应体系、进行LAMP扩增反应，检测结果如表1所示：
表1
牛肉 羊肉 狗肉 牛肉和羊肉 牛肉和狗肉 羊肉和狗肉
样品数量 30 30 10 30 10 10
阳性数量 0 0 10 0 10 10
阳性比例/% 0 0 100 0 100 100
由实施例2和3可以得出，实施例1的引物能特异性扩增狗肉DNA，只有模板中含有狗肉DNA时，向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN Ⅰ后的反应液才显示绿色；而模板中含有其他任意非狗肉（牛、羊、猫、狐狸、貂）DNA时，向LAMP反应产物加入荧光染料SYBRGREEN Ⅰ后的反应液显示橘黄色。因此，以实施例1的引物，采用上述LAMP反应体系，以荧光染料SYBR GREEN Ⅰ作为显色剂，能够将狗肉与其他动物（牛、羊、猫、狐狸、貂）的肉区分开来；从而能用于鉴别肉品中是否含有狗肉。
实施例4 灵敏度试验
将实施例1的阳性对照所用DNA分别以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀释度进行稀释，分别以稀释后的DNA为模板分别进行LAMP和PCR，比较两种检测方法的灵敏度。结果显示：LAMP法的扩增灵敏度比普通PCR法要高；普通PCR可以检测到第3个稀释梯度（如图2所示），而LAMP法在第4个稀释梯度仍可以检测到（如图3所示）。
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
TTATTTACAG TAGGCGGGTT 20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GTAAAGTGAA TCTTTGCTCA AG 22
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ACATAGTGAA AATGAGCCAC AACATATTGT CCTAGCTAAT TCGTCC 46
<210>4
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CTTTCAATAG GAGCAGTTTT TGCCTATCGT TAAGAGTATA ACCTGAGA 48

Claims (3)

1.一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法，其特征在于,以待测肉品的DNA作为模板、以DF3、DB3、DFIP、DBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在狗肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在狗肉；
所用引物如下：
DF3: TTATTTACAGTAGGCGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，
DB3: GTAAAGTGAATCTTTGCTCAAG，如SEQ ID NO.2所示，
DFIP: ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC，如SEQ ID NO.3所示，
DBIP:CTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCTATCGTTAAGAGTATAACCTGAGA，如SEQ ID NO.4所示，
所述LAMP检测体系，总体积为25uL；其组成如下
10umol/L的DF3、DB3各0.5uL，10umol/L 的DFIP、DBIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP 4uL，50mmol/L的 MgSO4 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermo buffer2.5uL，模板2uL，余量为超纯水。
2.一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法所用检测试剂，其特征在于,含有如下引物：
DF3: TTATTTACAGTAGGCGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，
DB3: GTAAAGTGAATCTTTGCTCAAG，如SEQ ID NO.2所示，
DFIP: ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC，如SEQ ID NO.3所示，
DBIP:CTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCTATCGTTAAGAGTATAACCTGAGA，如SEQ ID NO.4所示。
3.一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP检测方法所用检测试剂盒，其特征在于,含有10umol/L的DF3、DB3各0.5uL，10umol/L 的DFIP、DBIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP4uL，50mmol/L的 MgSO4 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermobuffer 2.5uL；
其中：
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DFIP: ACATAGTGAAAATGAGCCACAACATATTGTCCTAGCTAATTCGTCC，如SEQ ID NO.3所示，
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