CN102534035A - 一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒与使用方法 - Google Patents

一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒与使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒与使用方法，属于食品检测领域。本发明试剂盒由1组具有高特异性的引物、2×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和染料共同组成。经检测验证，本发明试剂盒能快速、方便、高效、高特异性、高灵敏性的鉴别出牛羊肉与非牛羊肉。鉴别准确率高达99％以上，检测过程不需特殊的仪器，结果通过肉眼即能判定，整个检测不超过1小时，单个样品检测成本不超过100元，规模化生产后成本更低。本试剂盒广泛适用于各检测单位对牛羊肉的现场快速检测和专业判定，普通消费者、专业检测人员等均可轻松使用。本发明还包括牛羊肉快速鉴定试剂盒的构建方法，利用该方法，可快速构建特定的检测试剂盒。

Description

一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒与使用方法
技术领域
本发明涉及一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒和使用方法，属于食品检测领域。
背景技术
改革开放以来，我国的肉牛产业得到了迅速的发展，经过20多年的快速发展，从二十世纪九十年代开始，我国肉牛存栏数量跃居世界第一位，牛肉产肉跃居世界第三位。在这20多年里，我国的经济也取得了年均9％以上的高速发展，人们生活水平迅速提高，对牛肉的需求快速增加。正是由于肉牛产业的这种快速发展，才满足了国内对牛肉快速增长的需求，牛肉价格也稳步提高。1999年我国的肉牛数量到达了发展的顶峰，此后，由于受到农村机械化的推广和普及，与外出打工等相比肉牛养殖的比较效益下降，肉牛的存栏数量开始呈逐年下降的趋势，但牛肉产量仍保持小幅上升的趋势。同期，我国的经济仍保持高速增加，人们生活越来越富裕，对牛肉的需求进一步快速增长。此时，仅依靠国内的肉牛产业已经无法满足对牛肉的需求，刺激牛肉价格进一步上涨，2011年普通牛肉达到了40-45元/千克的历史最高点，优质牛肉价格普遍在200元/千克以上，最高价格达到了1000-2000元/千克。
牛肉价格的飞速上涨和短缺导致国外的牛肉大量通过走私等途径进入中国，同时，国内也出现了很多不和谐的现象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加剂使猪肉变牛肉的事件，此后，在全国多个省市均发现了类似的产品。一时间，人们对牛肉等食品安全的关注成为了全社会的焦点。其实，牛肉市场面临的猪肉变牛肉事件仅是冰山的一角。在社会上还大量存在着用鸡肉、鸭肉等低价肉甚至是一些病死肉加工冒充牛肉的现象。目前社会上销售的低价牛肉和牛肉片，几乎都是非牛肉加工而成。因为目前活牛的价格已经达到18-20元/千克，而每千克活牛只能出0.4-0.5千克牛肉，因此，每千克牛肉至少要达到36元以上才有可能盈利。屠宰场和销售商不可能赔钱赚吆喝。羊肉由于其价格高于普通牛肉，其市场面临着与普通牛肉完全一样的情况。
面对牛羊肉市场存在的乱象，人们只能从色泽、气味、弹性等多个方面进行初步鉴别，但大多数消费者都不可能掌握这种专业知识，很难对生牛肉进行鉴别，对加工后的牛肉则更是难以鉴别。目前社会上缺乏牛羊肉的准确鉴别技术。通过现代化的DNA鉴定技术，可以进行鉴别。早在2008年新华每日电讯就报道过杭州一个市民买10元牛肉花2800元进行DNA鉴定的事件，2010年中新网报道了宁波一个消费者花1800元通过DNA亲子鉴定技术鉴别牛肉真假的事件，表明这种方法虽然能够鉴别，但所需时间长，费用高。因此，迫切需要建立一种简单、快速、廉价的牛羊肉鉴别技术，以维护牛羊肉市场的安全，保护广大消费者的身体健康。
发明内容
本发明的目的是针对国内外已有方法在检测技术上存在着操作复杂、耗时、重复性低、检测成本高等不足之处，在检测技术上加以改进。动物线粒体DNA编码序列具有高度保守性，对于物种的鉴定具有很高的可信度和准确性。环介导等温扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi T等(2000)设计创立的，这种新型核酸扩增技术具有灵敏度高、反应迅速，特异性强等优点。本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA相结合对牛羊肉进行鉴定，整个反应可在恒温状态下经过1h就可完成，而且可以通过肉眼观察到反应结果。
本发明的技术方案是：一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒，包含以下组分：
(1)反应液：每23μL的反应液中含有：12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM PrimerBIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL水，其中：
PrimeμF3(Forward Outer F3)：AACAGCTTAAAACTCAAAGGA(SEQNO.1)
Primer B3(Reverse Outer B3)：AGCCCATTTCTTCCCATT(SEQ NO.2)
Primer FIP(Forward Inner FIP)：TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTT(SEQ NO.3)
Primer BIP(Reverse Inner BIP)：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT(SEQ NO.4)
2×等温反应缓冲液含有40mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl(pH8.8)、20mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM的硫酸铵、20％的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
(2)染料
每23μL的反应液加入染料1μL，所述染料优选为Loopamp FluorescentDetection Reagent(Loopamp荧光检测试剂)。
其使用方法为：按照常规方法提取待测样品的DNA，取1μL DNA加入试剂盒中，10000rpm瞬时离心30秒混匀，60℃下恒温水浴培养45min，根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，则说明待测样品存在牛羊肉，若为桔黄色，则待测样品中不存在牛羊肉。
本发明的优点：
1、高特异性：能准确的鉴别出是否是牛羊肉，准确率高达99％以上。
2、高灵敏度：仅需极微量样品即可(所需模板达到10个拷贝或更少)。
3、鉴定简便：只要将检测样品的DNA加入试剂盒中放入60℃恒温水浴一定时间后，通过肉眼观察即可判定结果。
4、快速高效：整个过程1小时之内就可完成。
本发明的检测体系可以在恒温条件下，快速、方便、高效、高特异性、高灵敏地检测到牛羊肉，不需要复杂的仪器，检测成本大大低于现有技术，能满足当前畜禽肉类市场掺假检测的迫切需要，可广泛用于进出口检疫部门、食品卫生检测部门等的现场快速检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为本试剂盒对各种畜禽DNA进行检测试验图。图2中自左向右DNA顺序为：阳性对照，阴性对照，猪肉、牛肉、鸭肉、羊肉、兔肉；结果显示：第1、4、6管为绿色，其余的枯黄色。
图2为PCR检测方法灵敏度示意图，其中自左向右依次为：以10-1、10-2.........10-7稀释度的Positive Control DNA(PC DNA)为模板的样品和标准品的PCR检测图。
具体实施方式
实施例1：试剂盒的构建
(1)从GenBank中检索获得牛452bp 12s RNA序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性。
(2)根据上述序列利用PrimerExplore软件设计，并筛选出最佳引物
Primer F3：AACAGCTTAAAACTCAAAGGA(SEQ NO.1)
Primer B3：AGCCCATTTCTTCCCATT(SEQ NO.2)
Primer FIP：TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTT(SEQ NO.3)
Primer BIP：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT(SEQ NO.4)
(3)构建试剂盒
试剂盒构成：12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μMPrimer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、1μL染料(Loopamp Fluorescent Detection Reagent)、3.5μL水。其中：2×等温反应缓冲液由日本荣研化学株式会社提供，含有40mM的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.8)、20mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM硫酸铵、20％的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
(4)标本的采集：严格无菌采集各种畜禽DNA的新鲜肌肉组织，采用酚仿提取法提取组织样的基因组DNA。
(5)取1μL DNA加入步骤(3)的试剂盒中，10000rpm瞬时离心30秒混匀，60℃下恒温水浴培养45min，根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，则说明待测样品存在牛羊肉，若为桔黄色，则待测样品中不存在牛羊肉。
(6)灵敏度和特异性检验
采用猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、兔肉来检测特异性，结果显示，该试剂盒的特异性测试良好(如图1所示)。
以10-1、10-2.........10-7稀释度的Positive Control DNA(PC DNA)为模板分别进行LAMP和PCR比较两种检测方法的灵敏度，结果显示，LAMP法的扩增灵敏度比普通PCR法要高。普通PCR可以检测到7个稀释梯度中的第三个梯度(如图2所示)，而LAMP法可以检测到第四个梯度。
实施例2：样品检测
(1)从山东省内屠宰厂生产线采集鲜牛肉样品45个，鲜羊肉样品32个，鲜鸡肉样品70个，鲜鸭肉样品50个，鲜兔肉样品30个，分别提取DNA，用试剂盒进行检测。检测结果如表1：
表1山东省内屠宰厂生产线牛羊肉检测结果
  牛肉   羊肉   鸡肉   鸭肉   兔肉
  样品数量   45   32   70   50   30
  阳性数量   45   32   0   0   0
  阴性数量   0   0   70   50   30
  阳性比例/％   100   100   0   0   0
将以上来自不同畜禽品种的样品两两或两个以上混合，只要含有牛羊肉结果均为阳性，只要不含有牛羊肉结果均为阴性。
(2)从济南超市购买冷鲜牛肉样品15个、冷冻羊肉片样品10个、鸡腿肉样品20个，鸭胸肉样品5个，分别提取DNA，用试剂盒进行检测。检测结果如表2：
表2济南超市牛羊肉检测结果
  牛肉   羊肉片   鸡腿肉   鸭胸肉
  样品数量   15   10   20   5
  阳性数量   15   9   0   0
  阴性数量   15   1   20   5
  阳性比例/％   100   90   0   0
(3)从济南农贸市场购买鲜牛肉样品10个、冷冻牛肉片5个，鲜羊肉样品9个，冷冻羊肉片样品8个、鸡肉样品15个，鸭肉样品10个，兔肉样品4个，分别提取DNA，用试剂盒进行检测。检测结果如表3：
表3济南农贸市场牛羊肉检测结果
  鲜牛肉   牛肉片   鲜羊肉   羊肉片   鸡肉   鸭肉   兔肉
  样品数量   10   5   9   8   15   10   5
  阳性数量   10   4   9   6   0   0   0
  阴性数量   10   1   0   2   15   10   5
  阳性比例/％   100   80   100   25   0   0   0
(4)从济南批发市场购买牛肉片10个(其中每斤10元以下2个，10-18元4个，18元以上4个)、冷冻羊肉片样品12个(其中每斤10元以下3个，10-20元6，20元以上3)，分离瘦肉和脂肪，分别提取DNA，用试剂盒进行检测。检测结果如表4和表5：
表4济南批发市场牛羊肉脂肪样品检测结果
Figure BDA0000137150320000071
表5济南批发市场牛羊肉瘦肉样品检测结果
Figure BDA0000137150320000072
Figure IDA0000137150400000011
Figure IDA0000137150400000021

Claims (3)

1.一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒，其特征是，包含以下组分：
(1)反应液
每23μL的反应液中含有：12.5μL2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL水，其中：
Primer F3：AACAGCTTAAAACTCAAAGGA
Primer B3：AGCCCATTTCTTCCCATT
Primer FIP：TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTT
Primer BIP：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT
2×等温反应缓冲液含有40mM的pH8.8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM的硫酸铵、20％的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP；
(2)染料
每23μL的反应液加入染料1μL。
2.如权利要求1所述的一种快速鉴别牛羊肉的试剂盒，其特征是，所述染料为Loopamp荧光检测试剂。
3.权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，其特征是，按照常规方法提取待测样品的DNA，取1μL DNA加入试剂盒中，10000rpm瞬时离心30秒混匀，60℃下恒温水浴培养45min，根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，则说明待测样品存在牛羊肉，若为桔黄色，则待测样品中不存在牛羊肉。
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