CN105018611B - 一种利用线粒体dna鉴别牛羊肉中貂肉的lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法,属于分子生物学检测技术领域。本发明的检测方法以待测肉品的DNA作为模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物构建LAMP检测体系;LAMP检测体系于64℃恒温水浴中LAMP反应40min,反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREENⅠ;若反应液变成绿色,说明待测肉品中存在貂肉;若为橘黄色,则待测肉品中不存在貂肉。本发明的检测方法与传统PCR相比,在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成,而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果,能快速准确地鉴定出动物源性成分;具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法,属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
近年来随着市场对牛羊肉的需求逐渐增加及价格快速上涨,一些不法商贩在利益的驱动下,掺加其他廉价肉造假冒充牛羊肉。2012年以来,国内曝光了多起以猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛羊肉的事件。而在一些以皮毛为主的特种经济动物养殖地区,貂肉和狐狸肉的去向成了一个谜,不少人推测其被掺入了牛羊肉中进入了人们的餐桌。这种现象不仅扰乱了经济秩序,而且严重危害人们身体健康。
目前,用于动物源性成分检测的方法主要有常规PCR、荧光定量PCR等,但上述诊断方法花费时间较长,而且判定结果需要借助精密仪器设备,难以在实际生产中普及应用。
发明内容
为了解决采用常规PCR、荧光定量PCR法检测牛羊肉中掺入貂肉所存在的上述技术问题,本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COXⅠ)基因对貂肉进行鉴定,整个反应在恒温水浴锅中进行40min即可,而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果。
本发明的技术方案是:
一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法,以待测肉品的DNA作为模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物构建LAMP检测体系;LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min,反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ;若反应液变成绿色,说明待测肉品中存在貂肉;若为橘黄色,则待测肉品中不存在貂肉;
所用引物如下:
DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT,如SEQ ID NO.1所示,
DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT,如SEQ ID NO.2所示,
DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC,如SEQ ID NO.3所示,
DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC,如SEQ ID NO.4所示;
所述LAMP检测体系,总体积为25uL;其组成如下
10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL,10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL,2.5mmol/L的dNTP 4uL,50mmol/L的 MgSO4 2uL,5mol/L的Betaine2.5uL,Bst DNA聚合酶1uL,10×Thermobuffer 2.5uL,模板2uL,余量为超纯水。
本发明的检测方法与传统PCR相比,在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成,而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果,能快速准确地鉴定出动物源性成分;具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。 本发明无需借助于大型的昂贵仪器设备,更适合于基层的现地检测,具有广阔的市场前景和较大的社会经济效益。
本发明选用线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COXⅠ)基因作为目的基因;以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物,能特异性地扩增貂肉COXⅠ基因,从而将貂肉从羊肉、牛肉中检测出来;且能够将其与猫、狐狸等相近种属的肉区分开来;具备特异性高的优点。另外,采用DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物,其灵敏度高,所能检测到的最低浓度为2×10-4ng/uL;因此,即使掺杂有微量貂肉也能被检测出来。
本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂,含有如下引物:
DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT,如SEQ ID NO.1所示,
DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT,如SEQ ID NO.2所示,
DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC,如SEQ ID NO.3所示,
DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC,如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂盒,含有10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL,10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL,2.5mmol/L的 dNTP 4uL,50mmol/L的 MgSO4 2uL,5mol/L的Betaine2.5uL,Bst DNA聚合酶1uL,10×Thermo buffer 2.5uL;
其中:
DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT,如SEQ ID NO.1所示,
DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT,如SEQ ID NO.2所示,
DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC,如SEQ ID NO.3所示,
DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC,如SEQ ID NO.4所示。
附图说明
图1为实施例1检测结果图;从左向右顺序为:阴性对照,阳性对照,牛肉,羊肉,狗肉,猫肉,狐狸肉,貂肉;结果显示:第2、8管为绿色,其余为橘黄色;
图2为PCR检测方法灵敏度示意图;从右向左顺序为:Marker,10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度;
图3为LAMP检测方法灵敏度示意图;从左向右顺序为:Marker,10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度。
具体实施方式
下述实施例中:所用试剂除由生产厂家直接提供的以外,其它均为分析纯;水,如果没有特别说明,为超纯水。
实施例1 设计引物
从GenBank中检索获得貂的COXⅠ序列,并进行软件比对分析,确定序列的准确性;根据上述序列利用PrimerExplore软件设计引物如下:
DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT (如SEQ ID NO.1所示),
DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT(如SEQ ID NO.2所示),
DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC(如SEQ ID NO.3所示),
DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC(如SEQ ID NO.4所示)。
实施例2 特异性实验
(1)提取样品DNA作为模板
严格无菌采集牛、羊、狗、猫、狐狸、貂的新鲜肌肉组织作为样品,然后采用酚氯仿提取法分别提取样品中的DNA。分别以超纯水(阴性对照),本实验室保存的含有貂肉COXⅠ基因的阳性质粒(阳性对照),牛肉DNA,羊肉DNA,狗肉DNA,猫肉DNA,狐狸肉DNA,貂肉DNA为模板建立LAMP反应体系;DNA模板浓度均为20ng/uL。
(2)LAMP反应体系的建立
通过摸索内外引物浓度比、dNTP浓度、反应温度、反应时间等建立的LAMP反应体系:25μL,其组成为:10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL,10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL,2.5mmol/L的 dNTP 4uL,50mmol/L的 MgSO4 2uL,5mol/L的Betaine2.5uL,Bst DNA聚合酶1uL,10×Thermo buffer 2.5uL,最低浓度为20ng/uL的模板2uL,余量为超纯水。
其中,dNTP和MgSO4购自宝生物工程(大连)有限公司、Betaine购自美国Sigma公司、Bst DNA聚合酶(8U/ uL)和10×Thermo buffer购自美国NEB公司、SYBR GREEN I核酸染料购自北京Solarbio公司。
LAMP扩增反应
将上述LAMP反应体系(按照实施例1获取模板的顺序排列)同时置于64℃恒温水浴中进行LAMP扩增40min;反应结束后加入1uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ;反应液颜色依次为橘黄色、绿色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、绿色(如图1所示)。其中,橘黄色为阴性结果,绿色为阳性结果。
实施例3
从山东省内屠宰厂采集鲜牛肉样品30个,鲜羊肉样品30个;从山东省动物医院采集鲜貂肉样品10个;采用实例1的方法提取样品的DNA作为模板、建立LAMP反应体系、进行LAMP扩增反应,检测结果如表1所示:
表1
牛肉 | 羊肉 | 貂肉 | 牛肉和羊肉 | 牛肉和貂肉 | 羊肉和貂肉 | |
样品数量 | 30 | 30 | 10 | 30 | 10 | 10 |
阳性数量 | 0 | 0 | 10 | 0 | 10 | 10 |
阳性比例/% | 0 | 0 | 100 | 0 | 100 | 100 |
由实施例2和3可以得出,实施例1的引物能特异性扩增貂肉DNA,只有模板中含有貂肉DNA时,向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN Ⅰ后的反应液才显示绿色;而模板中含有其他任意非貂肉(牛、羊、猫、狐狸、狗)
DNA时,向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN Ⅰ后的反应液显示橘黄色。因此,以实施例1的引物,采用上述LAMP反应体系,以荧光染料SYBR GREEN Ⅰ作为显色剂,能够将貂肉与其他动物(牛、羊、猫、狐狸、狗)的肉区分开来;从而能用于鉴别肉品中是否含有貂肉。
实施例4 灵敏度实验
将实施例1的阳性对照所用DNA分别以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀释度进行稀释,分别以稀释后的DNA为模板,分别进行LAMP和PCR,比较两种检测方法的灵敏度。结果显示:LAMP法的扩增灵敏度比普通PCR法要高;普通PCR可以检测到第3个稀释梯度(如图2所示);而LAMP法在第4个稀释梯度仍可以检测到(如图3所示)。
<110>山东省兽药质量检验所
<120>一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法
<160>4
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
GCTATGGGCC TTAGGGTT 18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CATTTAGGGT GTAGCCTGT 19
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GTGAAGAACG ATGTCTAGTG ATGAGTTTTA TTTACAGTGG GTGGC 45
<210>4
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GCACATTTTC ACTACGTTCT TTCAAGGAAC CAGTGAACGA ATCC 44
Claims (3)
1.一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法,其特征在于,以待测肉品的DNA作为模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物构建LAMP检测体系;LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min,反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ;若反应液变成绿色,说明待测肉品中存在貂肉;若为橘黄色,则待测肉品中不存在貂肉;
所用引物如下:
DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT,如SEQ ID NO.1所示,
DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT,如SEQ ID NO.2所示,
DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC,如SEQ ID NO.3所示,
DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC,如SEQ ID NO.4所示;
所述LAMP检测体系,总体积为25uL;其组成如下
10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL,10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL,2.5mmol/L的 dNTP4uL,50mmol/L的 MgSO4 2uL,5mol/L的Betaine2.5uL,Bst DNA聚合酶1uL,10×Thermobuffer 2.5uL,模板2uL,余量为超纯水。
2.一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法所用检测试剂,其特征在于,含有如下引物:
DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT,如SEQ ID NO.1所示,
DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT,如SEQ ID NO.2所示,
DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC,如SEQ ID NO.3所示,
DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC,如SEQ ID NO.4所示。
3.一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法所用检测试剂盒,其特征在于,含有10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL,10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL,2.5mmol/L的dNTP 4uL,50mmol/L的 MgSO4 2uL,5mol/L的Betaine2.5uL,Bst DNA聚合酶1uL,10×Thermobuffer 2.5uL;
其中:
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