CN101906471B - 一种检测地沟油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测地沟油的方法，为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段。本发明的方法灵敏度高、适用性广、操作简便、可行性强，可以快速鉴定食用油中是否掺有地沟油。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测地沟油的方法。
背景技术
“地沟油”又称为“毛油”，其来源主要有：下水道中的油腻漂浮物；将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜经过简单加工、提炼出的油；用于油炸食品的油使用次数超过规定要求，或是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油。被捞回的“地沟油”通常会在勾兑一些新油之后流入食品、餐饮行业。据实验测定，长期摄入“地沟油”将会对人体造成伤害，如发育障碍、易患肠炎，并有肝、心和肾肿大以及脂肪肝等病变。此外，“地沟油”受污染产生的黄曲霉毒性不仅易使人发生肝癌，也有可能引发其他部位癌变，如胃腺癌、肾癌、直肠癌及乳癌、卵巢、小肠等部位癌变。
经过精炼的“地沟油”，从外观和感官上很难与普通一级油区分。国内目前还没有比较好而且方便的检测方法。传统的检测方法只抓住地沟油中的某个特性，但没有一种方法能同时有效检测不同来源的地沟油，导致有时检测误差较大，更有误判的可能。如果地沟油掺入含量较少时，也检测不出来。
现有的国家研究机构的检测方法主要包括下列几种：
电导率检测法。因为油脂在烹饪过程中接触了洗涤剂、金属器皿，或长期停留在重金属环境中，因此地沟油的电导率值明显高于普通食用油。在武汉工业学院，一名姓刘的本科生曾经找到一种30分钟内检测地沟油的方法。他通过检测油的电导率，得出地沟油电导率是一级食用油的5-7倍的结论。这种方法对于“泔水油”的检测相对有效。然而它的缺陷在于，仅仅适用于地沟油添加量在20％以上的食品油检测。
胆固醇检测法。因为地沟油是多种动、植物油脂的混合物，其中动物脂肪中普遍含有胆固醇，而在人们食用的正规植物油中一般不含或只含有极少量的胆固醇。利用这一特性可以鉴别出某些地沟油，但同样要求地沟油的添加量在10％以上。
蓝色试纸。随着地沟油所掺比例不断增加，蓝色试纸会呈现出黄绿色、淡黄色和亮黄色等颜色变化。这是依据油的“积性”来检测油的纯度，当油中有氯化钠(食盐)时，其积性大，反之则小，而正规渠道生产的食用油中通常没有氯化钠。但这一方法同样受到地沟油的添加比例的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测地沟油的方法。包括鉴别食用油中是否掺有地沟油及其含量。该方法能快速的检测出食用油中是否含有地沟油、含量是多少。
由于地沟油的原料中主要是由各种潲水、用于油炸食品的油、劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油炼制而成，这些原料中都含有一些动物性原料，因此含有相应的核酸成分，而目前市面上的合格食用油多为植物油，不存在动物性成分。本发明即是利用实时荧光PCR法检测动物性成分中所含的动物特有的基因来鉴定合格食用油中是否掺有地沟油。
本发明提供了一种检测地沟油的方法，为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段。
进一步的，所述食用油为常见的植物性食用油，以大豆、花生、芝麻、粟米、橄榄、山茶、葵花子、核桃、芥花子等植物性原料经炼制加工获得的可食用的油。
进一步的，在利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段后，根据Ct值来判断食用油中是否含有地沟油，或者根据标准品检测拟合的标准曲线来确定食用油中地沟油的含量。
定性检测Ct值的检测限采用阳性对照品梯度稀释方法来确定。
进一步的，所述动物特有基因片段符合下列要求：1)所选片段与植物存在较大差异，较佳的，相似性低于20％；2)所选片段在动物物种内具有保守性。
符合上述要求的动物特有基因片段可具体采用包括下列方法筛选获得：
1)参考文献，获得多个候选基因；
2)多个候选基因经过blast与GenBank数据库现有数据进行比对，筛选出猪、牛、羊、鸡、鸭等动物中与常见食用油来源的葵花、油菜、大豆及橄榄差异较大的特异基因；
3)多物种目的基因序列通过序列比对，获得保守区域；
4)所选片段再次通过blast验证特异性和保守性。
进一步的，所述动物特有基因片段为猪、牛、羊、鸡、鸭或鱼的CYTB(细胞色素b)基因的保守区域。可以是所述CYTB基因的全长序列(1-1140)，也可以是所述CYTB基因的部分序列，如核苷酸序列为所述CYTB基因的1-500位的基因片段，具体可以是实施例所列举的SEQ ID NO：1。
在筛选获得动物特有基因片段后，可利用Primer Express 3.0等软件来设计其特异性引物及探针。在本发明的启示下，本技术领域的技术人员完全可以采用现有的软件，通过常规参数的选择来设计动物特有基因片段的特异性引物，并从中筛选出合适的引物与探针。
本发明实施例具体列举了目标基因序列为SEQ ID NO：1时，优选的引物序列为SEQ IDNO：2和3，探针序列为SEQ ID NO：4。
本发明中，食用油DNA提取可采用常规适用于食用油中DNA提取的方法来提取DNA。如SN/T 1203-2003、文献“动物油脂中DNA的提取及牛、羊源性成分的PCR检测”等中记载的方法。
本发明中，实时荧光定量PCR反应体系为常规，主要包括缓冲液、Mg2+、dNTP、上游引物、下游引物、探针、Taq酶、H2O及模板。
本发明检测地沟油的方法可用于定性或定量检测食用油中的地沟油。
与现有的检测技术相比，本发明采用的Taqman荧光PCR法，具有灵敏度高(可检测出最低1‰的含量)、适用性广、操作简便、可行性强等优点。可以快速鉴定食用油中是否掺有地沟油。
附图说明
图1实例3模拟地沟油的检测曲线图
图2实例4食用油中最低模拟地沟油含量检测曲线图
图3实例5不同种类合格食用油检测曲线图
具体实施方式
以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实施例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1动物特有基因片段的筛选
1)经过blast与GenBank数据库现有数据进行比对，筛选出猪CYTB基因与常见食用油来源的葵花、油菜、大豆及橄榄较大差异，同时与牛、羊、鸡、鸭存在较高的同源性；
2)收集多条猪CYTB基因利用Clustalx1.8软件进行多序列比对，分析获得保守区域，最终目的区域序列为(SEQ ID NO：1)：
ATGACCAACATCCGAAAATCACACCCACTAATAAAAATTATCAACAACGCATTCATTGACCTCCCAGCCCCCTCAAACATCTCATCATGATGAAACTTCGGTTCCCTCTTAGGCATCTGCCTAATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTGTTCTTAGCAATACATTACACATCAGACACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACACACATTTGTCGAGACGTAAATTACGGATGAGTTATTCGCTATCTACATGCAAACGGAGCATCCATATTCTTTATTTGCCTATTCATCCACGTAGGCCGAGGTCTATACTACGGATCCTATATATTCCTAGAAACATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACCGTTATAGCAACAGCCTTCATAGGCTACGTCCTGCCCTGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCTACGGTCATCACAAATCTACTATCAGCTATCCCTTATATCGGAACAGACCTCGTAGAATGAATCTGAGGGGG
实施例2实时荧光定量PCR引物及探针的设计
1)利用软件Primer Express 3.0在实施例1中获得的保守区域设计引物探针；
2)在多序列比对文件中验证引物探针的保守性；
3)通过blast验证引物探针的特异性；
4)最终获得理想的引物探针序列为：
F：5’-TCTTGCAAATCCTAACAGGC-3’(SEQ ID NO：2)；
R：5’-CGTTTGCATGTAGATAGCGA-3’(SEQ ID NO：3)；
P：5’-AGCTTTCTCATCAGTTAC-3’(SEQ ID NO：4)
实施例3地沟油检测
3.1模拟地沟油的制备：将300ml潲水置于烧杯中，加热至50℃5min，降低其粘度，然后沉淀，取上层油样；将油样放置70℃水浴中，加入5％食盐水进行洗涤，去水层，再洗涤，直至没有胶状物出现为止；将洗涤后的油升温至105℃-110℃，搅拌脱水1-2小时，直至液面无水汽和气泡。最后收集到约3ml地沟油。
3.2模拟地沟油核酸抽提：在1.5ml离心管中加入1ml地沟油及200μl TE缓冲液，颠倒混匀5min，室温下13000rpm离心5min，去除上层油脂层，取水相用于DNA提取。200μl水相中加入400μl裂解液，旋涡混匀，加600μl氯仿/异戊醇(24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心15min。取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置1～2h。12000rpm离心10min，取沉淀，加入1ml 75％乙醇，12000rpm离心5min，吸去液体，干燥，加50μl TE溶解。
3.3检测：用实时荧光定量PCR进行检测。
3.3.1反应体系：40ul反应体系
10xBuffer 4.0ul
Mg2+ 3.2ul
dNTP 0.8ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
探针 0.3ul
Taq酶 0.3ul
H2O 26.4ul
模板 4.0ul
引物探针采用实施例2中设计的引物探针进行实时荧光定量PCR检测。
3.3.2检测参数：94℃×2min；再按93℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。
3.3.3结果判定：Ct＜40，有明显的S型曲线，表明待检样品中含有地沟油。Ct＝40或undet.，待检样品中不含有地沟油，或地沟油含量低于检测限。
3.4检测结果：对制备前和制备后的样本同时进行检测，所有结果两者均阳性，从Ct值看，制备前后核酸损失不到1/10。
实施例4食用油中最低模拟地沟油含量检测：
4.1标本的制备：将实例3中制备好的模拟地沟油与合格食用油分别按1∶10，1∶100，1∶1000和1∶10000混合。
4.2核酸抽提及检测同实例3。采用实施例2设计的引物及探针进行实时荧光定量PCR检测。
4.3检测结果：模拟地沟油与合格食用油按1∶1000混合后，检测结果都为阳性，而按1∶10000混合后，检测结果为阴性。表明本发明能用于地沟油添加量至少在1‰以上的食品油检测。检测结果如下表所列：
实施例5不同种类合格食用油检测：
5.1所选用的合格食用油均购自超市，具体见下表：
| 食用油名称 | 厂家 |
| 金龙鱼第二代食用调和油 | 嘉里粮油(中国)有限公司 |
| 金龙鱼玉米油 | 嘉里粮油(中国)有限公司 |
| 金龙鱼菜籽油 | 嘉里粮油(中国)有限公司 |
| 金龙鱼葵花籽油 | 嘉里粮油(中国)有限公司 |
| 福临门橄榄油 | 上海福临门食品有限公司 |
| 福临门维A大豆油 | 上海福临门食品有限公司 |
| 鲁花5S压榨一级花生油 | 山东鲁花集团有限公司 |
5.2核酸抽提及检测同实例3。采用实施例2设计的引物及探针进行实时荧光定量PCR检测。以实例3制备的模拟地沟油为阳性对照。
5.3检测结果：模拟地沟油检测结果都为阳性，而不同种类的合格食用油检测均为阴性。检测结果如下表所列：
| 名称 | 检测结果 |
| 金龙鱼第二代食用调和油 | 阴性 |
| 金龙鱼玉米油 | 阴性 |
| 金龙鱼菜籽油 | 阴性 |
| 金龙鱼葵花籽油 | 阴性 |
| 福临门橄榄油 | 阴性 |
| 福临门维A大豆油 | 阴性 |
| 鲁花5S压榨一级花生油 | 阴性 |
| 模拟地沟油 | 阳性 |
Claims (5)
1.一种检测地沟油的方法，为对待检油提取DNA后，以所提取的DNA为模板，利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段，所述动物特有基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。
2.如权利要求1所述检测地沟油的方法，其特征在于,在利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段后，根据Ct值来定性检测食用油中是否含有地沟油，或者根据标准品检测拟合的标准曲线来确定食用油中地沟油的含量。
3.如权利要求2所述检测地沟油的方法，其特征在于，Ct值定性检测地沟油的检测限采用阳性对照品梯度稀释方法来确定。
4.如权利要求1-3任一所述检测地沟油的方法，其特征在于,实时荧光定量PCR时所用的引物序列为SEQ ID NO:2和3，探针序列为SEQ ID NO：4。
5.如权利要求1-4任一权利要求所述检测地沟油的方法用于定性或定量检测食用油中的地沟油的用途。
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