CN102311994A - 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
烟曲霉荧光定量pcr检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102311994A CN102311994A CN201110112900A CN201110112900A CN102311994A CN 102311994 A CN102311994 A CN 102311994A CN 201110112900 A CN201110112900 A CN 201110112900A CN 201110112900 A CN201110112900 A CN 201110112900A CN 102311994 A CN102311994 A CN 102311994A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aspergillus fumigatus
- plasmid
- pcr
- detection method
- quantitative pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种烟曲霉荧光定量PCR检测方法，该检测方法是采用根据烟曲霉的线粒体翻译优化蛋白基因(Mitochondrial Translation Optimization Protein，Mto1)为参考序列，设计特异引物和探针，通过荧光定量PCR对烟曲霉进行定量分析。本发明建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的烟曲霉荧光定量PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
Description
(一)技术领域
本发明涉及烟曲霉荧光定量PCR检测方法。
(二)发明背景
烟曲霉是常见的空气真菌，也是真菌中研究较为清楚能产生毒性物质的真菌。其致病因子可分为毒素和酶两大类，在烟曲霉致病中共同起作用：首先，烟曲霉所产生的蛋白酶可能不直接参与烟曲霉侵入宿主体内，但可以促进真菌与宿主组织粘附和穿透，由于呼吸道上皮构成内外环境屏障，微生物要进入肺实质细胞形成肺部感染，首先要穿透上皮组织，而烟曲霉可以产生某些蛋白酶，尤其丝氨酸蛋白酶，可促进肺泡上皮细胞脱落，有利于烟曲霉侵入；其次，烟曲霉毒素可以扰乱粘膜防御功能，抑制吞噬细胞功能，通过抑制免疫反应，或破坏局部组织，而促进真菌生长繁殖，危害人体健康。早在1848年就发现烟曲霉可以引起人的感染，至今依然是临床上重要的条件致病真菌，过敏体质者吸入烟曲霉孢子易发生肺部感染。近年来，在临床上烟曲霉已经成为仅次于白色念珠菌的一种重要的病原真菌，其毒素可以直接造成机体损害或降低机体免疫力，严重的可危及生命。烟曲霉对动物也有很大的危害，如烟曲霉产生的毒素会导致马的脑白质软化症，引起兔子的呼吸道疾病，造成畜禽体重减少，腹泻，饲料转化率低和肝坏死，导致猪的胰脏坏死，肝损伤及肺水肿等。研究表明，当烟曲霉菌分生孢子浓度达到109CFU/m3，雏鸡暴露在这样的环境下，数周会造成急性症状，当浓度达到1010CFU/m3以上时只需1天就可造成急性症状，由此可见，真菌气溶胶的危害与浓度密切相关。
长期以来人们对气载微生物的检测主要是依靠培养技术法，它既可以计算出气载微生物的浓度，也便于对优势微生物进行形态学鉴定，同时通过Anderson采样器还可以测定气溶胶的粒子大小和分布规律，因此培养技术法是目前国内外检测微生物气溶胶应用广泛，结果可靠的方法。但是培养计数法依赖于微生物的可培养性，首先不是所有的微生物都能够在采样培养基上生长，不同的微生物有不同的生长要求，例如MEA就不适合嗜干性真菌的生长；其次生物气溶胶在采样过程中很容易失活，从而无法在培养基上形成菌落；再次空气中许多微生物已经死亡，但是其细胞成分仍然能够导致过敏或者引起中毒，这部分气溶胶也无法通过培养技术来进行测定。据Parkes和Taylor计算，可培养的微生物大约占空气微生物总数的0.1-10％左右，所以说培养计数法很容易低估空气中生物气溶胶的总量。基于分子生物学技术的荧光定量RT-PCR方法，能够快速特异、敏感和高效的对样品进行检测，对疾病的早期治疗及疫情的控制提供参考。
(三)发明内容
本发明建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的烟曲霉荧光定量PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
本发明的具体步骤是：
1、引物设计
参照GeneBank公布的Mto1的基因序列(GenBank accession No.XM-742541)，应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物序列：
2、真菌DNA提取
将购买自中国普通微生物菌种保藏中心(中国科学院微生物研究所，北京)的标准烟曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃、7天培养，用于DNA提取。在无菌条件下用接种环刮取少量菌丝体于预先加入提取液的1.5ml离心管中，用试剂盒附带的研磨杵将菌丝体捣散，然后按试剂盒(天根公司，快速DNA提取扩增套装，目录号：KG201，说明书见天根公司网站)说明进行DNA提取。
3、PCR扩增
PCR总体系为25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl，上、下游引物(FP和RP)各1μl，模板1μl，余下用灭菌ddH2O补足。反应条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸15min。反应结束后，取5μlPCR产物于1％琼脂凝胶中电泳。
4、质粒标准阳性模板的制备
①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，酶切鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒。
②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。
注：每个碱基的平均分子量为660
5、荧光定量PCR标准曲线绘制
提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(107～102copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系25μl，其中Mix 12.5μl，上下游引物(FP和RP)各1μl，探针0.25μl，ROX 0.5μl，模板5μl，超纯水4.7μl。反应条件为：50℃2min；95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环。
所述的荧光定量标准品为含有位于Mto1基因(GenBank accession No.XM-742541)上1484～1709之间、大小约为226bp的基因片段的质粒。
最后根据标准曲线分析被检材料中的烟曲酶。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)灵敏度高：通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可检测到最低浓度为100copies/reaction。
(2)特异性强：结果显示，黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉以及黄曲霉均未见扩增；白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、茄病镰刀菌、裴氏着色菌和甄氏外瓶菌以及毛霉属、假丝酵母属、青霉属的一些真菌也未见交叉反应，只有烟曲霉产生扩增，而且灵敏度达到1.08×10-5ng/μl。
(3)重复性好：本实验所建立的标准曲线：y＝-3.1564424x+40.494341，R2值达到0.99985254，接近于1。这说明PCR模板与Ct值之间具有良好的线性函数关系，定量结果有较高的准确性和重复性。
(四)说明书附图：
图1是烟曲霉荧光定量PCR标准品扩增曲线。
图2是烟曲霉荧光定量PCR标准曲线。
相关系数为0.99985254，斜率为-3.1564424，截距为40.494341，标准曲线y＝-3.1564424x+40.494341，R2值达到0.99985254。
(五)具体实施方式：
参照GeneBank公布的Mto1的基因序列(GenBank accession No.XM-742541)，设计了 特异性引物序列：
实施例一：以烟曲霉菌株为检测材料，并以超纯水为阴性对照。
1、烟曲霉DNA提取
将购买的烟曲霉标准菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃、7天培养，用于DNA提取。在无菌条件下用接种环刮取少量菌丝体于预先加入提取液的1.5ml离心管中，用试剂盒附带的研磨杵将菌丝体捣散，然后按试剂盒(天根公司，快速DNA提取扩增套装，目录号：KG201，说明书见天根公司网站)说明进行DNA提取。
2、荧光定量PCR检测
取上述DNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，扩增反应体系25μl，其中2×PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物(FP和RP)各1μl，探针0.25μl，ROX0.5μl，模板5μl，超纯水4.7μl。反应条件为：50℃2min；95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的烟曲霉核酸量(copies)。
根据标准曲线分析被检材料中的烟曲酶，结果说明本方法能有效地检测烟曲霉核酸量。
实施例二：待检病料(有呼吸道症状的兔子咽喉拭子和泄殖腔拭子)中烟曲霉的荧光定量PCR检测。
1、样品制备：
将兔子咽喉拭子和泄殖腔拭子样品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。
2、烟曲霉DNA提取
将上述液体按试剂盒(天根公司，快速DNA提取扩增套装，目录号：KG201，说明书见天根公司网站)说明进行DNA提取。
3、荧光定量PCR检测
取上述DNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，扩增反应体系25μl，其中Mix12.5μl，上下游引物(FP和RP)各1μl，探针0.25μl，ROX0.5μl，模板5 μl，超纯水4.7μl。反应条件为：50℃2min；95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的烟曲霉核酸量(copies)。
根据标准曲线分析被检材料中的烟曲酶，结果说明本方法能有效地检测烟曲霉核酸量。
结果说明本方法能敏感地检测病料中烟曲霉核酸量。
Claims (3)
1.一种烟曲霉荧光定量PCR检测方法，其特征在于该检测方法包括以下步骤：
(1)引物设计
参照Mto1的基因序列设计特异性引物；
(2)取备检样品提取病毒RNA；
(3)PCR扩增
PCR总体系为25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl，上、下游引物各1μl，模板1μl，余下用灭菌ddH2O补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸15min；反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；
(4)质粒标准阳性模板的制备
①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，酶切鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；
②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；
注：每个碱基的平均分子量为660
(5)荧光定量PCR标准曲线绘制
提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释107～102copies/μL用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系25μl，其中Mixl2.5μl，上下游引物各1μl，探针0.25μl，ROX0.5μl，模板5μl，超纯水4.7μl；反应条件为：50℃2min；95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为100copies/reaction；
(6)根据标准曲线分析被检材料中的烟曲酶。
2.根据权利要求1所述的烟曲霉荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述的特异性引物、probe探针序列如下：
上游引物：FP gaaggcaaggtcgcagata
下游引物：RP gaggagtcccggtcttcag
Mto1F tttctccacccaggaacgtt
Mto1R cgaatccggagaggtgatacc
probe FAM-cagttgtgatgacgacacgcccagt-TAMRA。
3.根据权利要求1所述的烟曲霉荧光定量PCR检测方法，其特征在于：荧光定量标准品为GenBank accession No.XM-742541Mto1基因上位于1484～1709之间、大小为226bp的基因片段质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110112900A CN102311994A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110112900A CN102311994A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102311994A true CN102311994A (zh) | 2012-01-11 |
Family
ID=45425560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110112900A Pending CN102311994A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102311994A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103773838A (zh) * | 2013-08-15 | 2014-05-07 | 曹国君 | 烟曲霉实时pcr技术 |
| CN104046681A (zh) * | 2013-03-13 | 2014-09-17 | 长江大学 | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 |
| CN104164511A (zh) * | 2014-08-25 | 2014-11-26 | 天津喜诺生物医药有限公司 | 一种曲霉菌定量检测荧光pcr试剂盒 |
| CN105624290A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-06-01 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用 |
| CN105755108A (zh) * | 2013-08-15 | 2016-07-13 | 曹国君 | 烟曲霉实时pcr技术 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101038254A (zh) * | 2007-04-29 | 2007-09-19 | 南方医科大学 | 一种检测曲霉菌荧光定量pcr试剂盒 |
-
2011
- 2011-04-19 CN CN201110112900A patent/CN102311994A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101038254A (zh) * | 2007-04-29 | 2007-09-19 | 南方医科大学 | 一种检测曲霉菌荧光定量pcr试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《中国博士学位论文全文数据库》 20110221 苗增民 "兔舍环境真菌气溶胶及其向环境的传播" 第59-72页 1-2 , * |
| 苗增民: ""兔舍环境真菌气溶胶及其向环境的传播"", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104046681A (zh) * | 2013-03-13 | 2014-09-17 | 长江大学 | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 |
| CN103773838A (zh) * | 2013-08-15 | 2014-05-07 | 曹国君 | 烟曲霉实时pcr技术 |
| CN103773838B (zh) * | 2013-08-15 | 2016-02-10 | 曹国君 | 烟曲霉实时pcr技术 |
| CN105755108A (zh) * | 2013-08-15 | 2016-07-13 | 曹国君 | 烟曲霉实时pcr技术 |
| CN105755108B (zh) * | 2013-08-15 | 2019-01-08 | 曹国君 | 烟曲霉实时pcr技术 |
| CN104164511A (zh) * | 2014-08-25 | 2014-11-26 | 天津喜诺生物医药有限公司 | 一种曲霉菌定量检测荧光pcr试剂盒 |
| CN105624290A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-06-01 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102311994A (zh) | 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 | |
| CN104032034A (zh) | 一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的方法及试剂盒 | |
| CN102321738A (zh) | 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr通用引物、检测探针和试剂盒 | |
| CN105441589A (zh) | 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103320540A (zh) | 鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重rt-pcr试剂盒 | |
| Moretti et al. | Diffuse cutaneous candidiasis in a dog. Diagnosis by PCR-REA | |
| Wen et al. | Onychomycosis associated with Exophiala oligosperma in Taiwan | |
| CN103540680A (zh) | 一种鉴定h9n2亚型禽流感病毒的双重rt-pcr检测方法 | |
| Garcia‐Hermoso et al. | Agents of systemic and subcutaneous mucormycosis and entomophthoromycosis | |
| CN105316427A (zh) | 一种快速检测瓜果腐霉菌的荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN106222297A (zh) | 一组用于快速诊断柞蚕微孢子虫的荧光定量pcr引物及其应用 | |
| CN1308461C (zh) | 一种检测口蹄疫病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| CN101260423A (zh) | 一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法 | |
| CN101914632B (zh) | 一种h9亚型禽流感病毒荧光定量rt-pcr检测方法 | |
| CN102676697A (zh) | 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒 | |
| CN106868147B (zh) | 一种香蕉叶斑病菌分子检测引物及其快速检测方法 | |
| CN101985653B (zh) | 禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法 | |
| CN104313181A (zh) | 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法 | |
| CN108893547A (zh) | 一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对、试剂盒及快速雌雄鉴别方法 | |
| CN103320539A (zh) | 鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重rt-pcr试剂盒 | |
| CN104195254A (zh) | 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物 | |
| Al-Masaoodi et al. | Molecular characterization and gene expression profiling of Trichophyton rubrum treated with a Marasmius palmivorus filtrate. | |
| CN102634585B (zh) | 基于多聚半乳糖醛酸酶Pcipg8基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法 | |
| CN101935716A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒双重检测方法 | |
| CN102304591A (zh) | 鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120111 |