CN105567680A - 拟茎点霉rpb2基因扩增引物及其设计方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了拟茎点霉RPB2基因扩增引物及其设计方法和应用。本发明设计的是针对拟茎点霉属真菌的通用引物。其上游引物PR2-F有44个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。本发明设计的RPB2引物对拟茎点霉属通用性强，扩增测序成功率高，具有合适的片段长度，便于高通量测序与分析，为拟茎点霉分子生态学研究以及检疫鉴定工作提供了重要工具。
Description
技术领域
本发明设计拟茎点霉真菌鉴别技术领域，具体的说，涉及拟茎点霉RPB2基因扩增引物及其设计方法和应用。
背景技术
拟茎点霉属（Phomopsis（Sacc.）Bubak）是半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科（Sphaeropsidaceae）中的重要真菌属，其有性态为间座壳属（Diaporthe）。该属真菌已描述900多种，呈世界性分布，主要集中在热带和亚热带地区。拟茎点霉属真菌是农业和林业上重要的病原菌，在我国2007年颁布的进境植物检疫性有害生物名录中，其中包括6种检疫性拟茎点霉及其有形态真菌，分别是黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsissclerotioides）、向日葵茎溃疡病菌（Diaporthehelianthi）、苹果果腐病菌（Diaportheperniciosa）、大豆北方茎溃疡病菌（DiaporthephaseolorumSacc.var.caulivora）、大豆南方茎溃疡病菌（DiaporthephaseolorumSacc.var.meridionalis）、蓝莓果腐病菌（Diaporthevaccinii）。
RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymera-ses）在基因表达的过程中扮演着很重要的角色。其中RNA聚合酶II由12个亚基组成（RPB1~RPB12），负责转录生成hnRNA和mRNA。RPB2（thesecondlar-gestRNApolymerasesubunit）基因负责编码RNA聚合酶II的第2大亚基，具有单拷贝和进化速率慢的特点。目前RPB2基因片段广泛用于构建系统发育树、预测种群结构、评估种群进化过程、生态学研究以及确定分类地位等研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一对高效的拟茎点霉RPB2基因扩增引物。
本发明的另一个目的是提供上述引物的设计方法。
本发明的进一步目的是提供上述引物在拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别和检验检疫中的应用。
本发明设计的拟茎点霉RPB2基因扩增引物，其上游引物PR2-F有44个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
本发明的拟茎点霉RPB2基因扩增引物设计的步骤为：登陆GenBank搜索目前已测定全序列的60种拟茎点霉RPB2基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，并在5’端加入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物PR2-F有44个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。扩增片断大小在1000bp左右。
可扩增拟茎点霉属真菌RPB2基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系为25μL，内含2×TaqMasterMix、10μM的引物PR2-F和引物PR2-R、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH2O。
扩增体系：2×TaqMasterMix12.5μL、PR2-F1μL、PR2-R1μL、Template1μL、ddH2O9.5μL。
反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
本发明所述的拟茎点霉RPB2基因增引物可扩增拟茎点霉RPB2基因片段，能获得单一的目的片段，产物大小为1000bp左右，并可对PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为：PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100ng/μL的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为PR2-F（10μM）和PR2-R（10μM），序列分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的拟茎点霉RPB2基因扩增引物对我国常见拟茎点霉真菌RPB2基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为1000bp左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为拟茎点霉RPB2基因的扩增产物。利用本发明设计的拟茎点霉RPB2基因扩增引物，可以对拟茎点霉属真菌进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别或检验检疫工作提供了重要的工具。
附图说明
图1为PR2-F/PR2-R扩增不同拟茎点霉RPB2基因的电泳图谱。
其中M：DNA分子量标准(100bpDNALadder)，N：阴性对照，1-16：依次为大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsislongicolla）、黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsissclerotioides）、小麦拟茎点霉（Phomopsiscontroversa）、茴香拟茎点霉（Phomopsisfoeniculi）、十字花拟茎点霉（Phomopsiscruciferae）、杏拟茎点霉（Phomopsisamygdali）、苘麻拟茎点霉（Phomopsisabutilonis）、扁桃拟茎点霉（Phomopsisamygdaliana）、梨干枯拟茎点霉（Phomopsisfukushii）、芦笋拟茎点霉（Phomopsisasparagi）、粽竹拟茎点霉（Phomopsisrhapidis）、茄褐纹拟茎点霉（Phomopsisvexans）、樟拟茎点霉（Phomopsiscinnamom）、蔓绿绒拟茎点霉（Phomopsisphilodendri）、花烛拟茎点霉（Phomopsisanthurii）、苹果拟茎点菌（Phomopsismali）。
具体实施方式
登陆GenBank搜索目前已测定序列的60种拟茎点霉RPB2基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，并在5’端加入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物PR2-F有44个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
可扩增拟茎点霉属真菌RPB2基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系为25μL，内含2×TaqMasterMix、10μM的引物PR2-F和引物PR2-R、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH2O。反应体系为：2×TaqMasterMix12.5μL、PR2-F1μL、PR2-R1μL、Template1μL、ddH2O9.5μL。扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
本发明所述的拟茎点霉RPB2基因增引物能扩增拟茎点霉属真菌RPB2基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1000bp左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为：PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100ng/μL的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为M13F-47(10μM)和RV-M(10μM)，序列分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。
本发明的拟茎点霉RPB2基因扩增引物对我国常见拟茎点霉真菌RPB2基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为1000bp左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为拟茎点霉RPB2基因的扩增产物。其主要扩增的拟茎点霉真菌包括以下种类：大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsislongicolla）、黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsissclerotioides）、小麦拟茎点霉（Phomopsiscontroversa）、茴香拟茎点霉（Phomopsisfoeniculi）、十字花拟茎点霉（Phomopsiscruciferae）、杏拟茎点霉（Phomopsisamygdali）、苘麻拟茎点霉（Phomopsisabutilonis）、扁桃拟茎点霉（Phomopsisamygdaliana）、梨干枯拟茎点霉（Phomopsisfukushii）、芦笋拟茎点霉（Phomopsisasparagi）、粽竹拟茎点霉（Phomopsisrhapidis）、茄褐纹拟茎点霉（Phomopsisvexans）、樟拟茎点霉（Phomopsiscinnamom）、蔓绿绒拟茎点霉（Phomopsisphilodendri）、花烛拟茎点霉（Phomopsisanthurii）、苹果拟茎点菌（Phomopsismali）。其电泳图谱如图1所示，从而可对拟茎点霉真菌进行分析鉴别。
Claims (3)
1.拟茎点霉RPB2基因扩增引物，其特征是将测序序列和扩增序列结合在一起，其上游引物PR2-F有44个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
2.权利要求1所述扩增引物的设计方法，其特征包括如下步骤：找出已测定全序列的60种拟茎点霉RPB2基因，去掉不完全和部分序列，进行同源性比较，寻找保守序列，并在5’端加入测序序列，从而获得一对通用引物。
3.权利要求1中所述拟茎点霉RPB2基因扩增引物在物种鉴定、地理种群分析以及口岸检验检疫中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN112831592A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-05-25 | 贵州大学 | 一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104046681A (zh) * | 2013-03-13 | 2014-09-17 | 长江大学 | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 |
| CN104195262A (zh) * | 2014-09-24 | 2014-12-10 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 拟茎点霉rna聚合酶(rpb1)基因扩增引物及其设计方法和应用 |
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