CN112831592A - 一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用，所述引物对为RPB2‑F6和RPB2‑R6，引物退火温度为54~57℃，扩增目的片段约900个碱基对，扩增片段应用包括基于Genebank Blast比对的灵芝属真菌鉴定和灵芝分子系统发育学分析。本发明所述引物具有扩增灵芝属真菌的特异性，扩增率高，鉴定准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定灵芝属真菌的方法，具体为一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用。
背景技术
灵芝是中国名贵中药材，又称仙草、瑞草、万年茸等。灵芝在我国有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。灵芝富含灵芝多糖，三萜类，甾醇，氨基酸，蛋白质等600余种成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗辐射等功效，用于治疗癌症，糖尿病，高血压，失眠、厌食症、关节炎、哮喘、支气管炎、胃炎、高胆固醇、红斑狼疮等疾病。《中国药典》将灵芝和紫芝收录其中，认为灵芝是无毒，安全的食品。
灵芝属(Ganoderma P. Karst.)隶属多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Ganodermataceae)，据分类研究报道，全世界有灵芝400余种，中国发现80余种。在古代中国，人们根据颜色将其分为青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、云芝六类。民间常做药用的芝类均以“灵芝”称呼，实则包括欧洲灵芝、四川灵芝、松杉灵芝、紫芝、薄灵芝、树舌灵芝、血芝等10余个灵芝种类，其中有四川灵芝和紫芝最为常见。
中国灵芝物种多样性丰富，不同的灵芝种类含有的药用成分各异。然而，灵芝种类的鉴定区分非常困难，原因一是灵芝在形态上极为相似，难以根据形态鉴定区分；二是以DNA条形码等分子手段鉴定必须要以高质量的DNA为前提，市售灵芝在保存过程中极易附带其它真菌或者被重寄生真菌污染。无论是栽培灵芝种类的鉴定还是解决市售灵芝种类混杂的问题，提出一个可靠、简便、快速有效的灵芝鉴定方法极为重要。
发明内容
本发明的目的是获得一种鉴定灵芝属真菌的有效方法，利用RPB2蛋白基因的一段DNA序列作为鉴定的条形码，本发明设计了一对扩增RPB2序列的引物，为灵芝属真菌的鉴定提供简便、可靠的方法。
技术方案：一种用于鉴定灵芝属真菌的引物，其特征在于所述引物对及其序列为：
RPB2-F6(RGARACGCAYAAGGAGTTYA)和RPB2-R6(CTRGCACARACWCCYAARAT)。
所述引物在灵芝属真菌鉴定中应用。
所述灵芝真菌鉴定需要主要仪器包括PCR仪，主要试剂包括引物、dNTP、MgSO4、DNA聚合酶、反应缓冲液，主要软件工具包括Bioedit、MEGA。
所述灵芝鉴定的步骤包括：
⑴ 提取灵芝属真菌的基因组。
⑶ 取PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检
本发明提供了一对扩增RPB2序列的引物，为灵芝属真菌的鉴定提供简便、可靠的方法。
附图说明
图1为实例PCR产物电泳结果；图2为实例鉴定结果。
其中图1M为DNA Maker 5000，1~3为实例PCR扩增灵芝RPB2基因片段电泳检测结果。
其中图2 Blast比对鉴定1~3号为Ganoderm lingzhi。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对，所述引物对及其序列为：RPB2-F6(RGARACGCAYAAGGAGTTYA)和RPB2-R6(CTRGCACARACWCCYAARAT)。
所述引物在灵芝属真菌鉴定中应用。
所述灵芝真菌鉴定需要主要仪器包括PCR仪，主要试剂包括引物、dNTP、MgSO4、DNA聚合酶、反应缓冲液，主要软件工具包括Bioedit、MEGA。
所述灵芝鉴定的步骤包括：
（1）提取灵芝真菌的基因组。
（2）以步骤⑴提取的基因组为模板，以RPB2-F6和RPB2-R6为扩增引物，进行如下的反应体系配制和反应程序：
（3）取PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检。
（4）PCR产物直接生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
（5）获得序列文件使用Bioedit编辑去头和去尾。
（6） 编辑好的序列使用NCBI的Blast比对功能鉴定灵芝种类。
如图1所示，实例中的PCR产物电泳检测，条带明亮、清晰。
如图2所示，实例中的1~3号样本鉴定为Ganoderm lingzhi。
Claims (9)
1.一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对，其特征在于所述引物对及其序列为：RPB2-F6(RGARACGCAYAAGGAGTTYA)和RPB2-R6(CTRGCACARACWCCYAARAT)。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对，其特征在于所述引物对
为RNA聚合酶
的第二大亚基（RPB2）。
3.根据权利要求1所述的一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对，其特征在于引物对扩增灵芝属真菌的序列条带大小为900bp。
4.一种如权利要求3所述的用于鉴定灵芝属真菌的引物对的应用，其特征在于PCR扩增时引物退火温度为54~57℃。
5.一种如权利要求4所述的应用，其特征在于基于Genebank的Blast序列比对鉴定。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于鉴定野生灵芝和市售灵芝。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，主要仪器包括PCR仪，主要试剂包括引物、dNTP、MgSO4、DNA聚合酶、反应缓冲液，主要软件工具包括Bioedit、MEGA。
8.一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对的鉴定方法，其特征在于，鉴定的步骤包括：
（1） 提取灵芝真菌的基因组；
（2）以步骤⑴提取的基因组为模板，以RPB2-F6和RPB2-R6为扩增引物，进行如下的反应体系配制和反应程序：
（3） 取PCR广增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测；
（4） 测序获得序列片段的Blast比对鉴定和系统发生学分析。
9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，所述灵芝样品的基因组DNA提取方法是CTAB的试剂盒法。
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